安捷伦高效液相色谱知识收藏
Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤
(一)、开机：
1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp Server程序。
2、打开 1100 LC 各模块电源。
3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。
4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。
5、把流动相放入溶剂瓶中。
6、打开Purge阀。
7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。
8 、设Flow：5ml/min，单击OK。
9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump control选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。
10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump Control选项，选中Off，单击Ok关泵，关闭Purge valve。
11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入Pump 编辑画面，设Flow：1.0ml/min。
12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。
（二）数据采集方法编辑：
1、开始编辑完整方法：
●从“Method”菜单中选择“Edit entire method”项，如上图所示选中除“Data analysis ”外的三项，单击Ok，进入下一画面。
2、方法信息：
●在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。
●单击Ok 进入下一画面。
3、泵参数设定：（以二元泵为例）
●在“Flow”处输入流量,如1ml/min，在“Solvent B”处输入
70.0,(A=100-B) ,也可Insert 一行”Timetable” ,编辑梯度。在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。
●单击Ok进入下一画面。
4、自动进样器参数设定:
●选择合适的进样方式, 进样体积 1.0ul ,洗瓶位置为6号。“Standard Injection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“Injection with Needle Wash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Use injector program”---可以点击Edit 键进行进样程序编辑。
●点击Ok进入下一画面。
5、柱温箱参数设定:
●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more>>”键,如图所示,选中”Same as left”---使柱温箱的温度左右一致。
●点击ok进入下一画面。
6、VWD检测器参数设定:
●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如
254nm, 在”Peak width (Response time)”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间, 如>0.1min (2s)。
●在Timetable 中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波长，如1min ，波长=300nm。点击ok进入下一画面。
7、DAD检测器参数设定:
●检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长
=350nm,BW=100nm;
●检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit—狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。
●点击Ok进入下一画面。
8、RID检测器参数设定:
●色谱条件:
进样体积: 20ul 。光学单元温度: Off 。
极性: 正。峰宽(响应时
间) : 4s 。
●“Optical Unit Temperature”---若环境温度控制在±2℃,设定为Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。“Peak width”---大多数分析设为4S，只有在高速分析下设为更短。“Automatic recycling after analysis”---在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。
●点击RID图标，选择RID Control ：Heater 设为On，若要循环流动相，必须将“Recycling Valve”设为ON。手动purge 参比池，将其设为On，并输入Purge 时间。
9、FLD检测器参数设定:
色谱条件：
●样品：P/N 01018-68704 用甲醇稀释为1:10。
●进样体积：5ul。
●柱温箱: 30℃。 EX=246nm,
EM=317nm ,PMT=10。
●响应时间=4s. 停止时间：出峰完毕。
● Excitation A: 激发波长:200-700nm,步长为1nm,或Zero Order。
● Emission: 发射波长: 280-900nm, 步长为1nm,或Zero Order。
● PMT: 大多数应用适当的设定值为10,若高浓度样
品峰被切平头,则减少 PMT 值。
●“Peak width”：大多数应用设为4s，只有快速分析采用小的设定值。
● Multi Ex ：多波长及光谱（激发）。
● Multi Em：多波长及光谱（发射）。
●同时可以输入范围Range、步长step、采集光谱。
10、在“ Run time checklist ”中选中“Data acquisition”，单击Ok。
11、单击“Method”菜单，选中“Save method as”，输入一方法名，如“test”，单击Ok。
12、从菜单“View”中选中”Online signal” ,选中Windows 1,然后单击Change 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击Ok.(如同时检测二个信号,则重复12,选中Windows 2)。
13、从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix”。
区别: Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。Prefix—在Prefix 框中输入前缀，在Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。
14、从Instrument 菜单选择System on。
15、等仪器Ready，基线平稳，从Method菜单中选择“Run method”，进样。
（三）、数据分析方法编辑:
1、从“View”菜单中，单击“Data analysis”进入数据分析画面。
2、从“File”菜单选择“Load signal”，选中您的数据文件名，如下图所示。单击Ok。
3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signal options”选项，。从Ranges中选择Auto scale及合适的显示时间，单击ok,或选择”Use Ranges”调整。反复进行，直到图的比例合适为止。
4、积分:
(1)、从“Integration”中选择“Auto integrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“Integration Events”选项，选择合适的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。
(2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项，则数据被积分。
(3)、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。
(4)、单击左边“√”图标，将积分参数存入方法。
5、打印报告:
(1)、从“Report”菜单中选择“Specify report”选项，进入如上画面。
(2)、单击“Quantitative Results”框中Calculate右侧的黑三角，选中Percent（面积百分比），其它选项不变。
(3)、单击Ok.
(4)、从“Report”菜单中选择“Print report”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击Report 底部的“Print”钮。
(四)、关机:
●关机前，用 100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如ACN），然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]
●退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shut down 关）。
关掉Agilent 1100电源开关。
Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：
1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）
2、对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。
3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。
4、带seal-wash的 1100，要配制90%水+10%异丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。
5、其它主意事项见说明书，或由现场工程师介绍。
维护知识问答
1、为什么溶剂和样品要过滤?
溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。
色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
样品过滤头的类型：
30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。
13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。
3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。
尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。
再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。
2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？
HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的
细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.
清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。
3、为什么Agilent 1100LC的流动相管路非常细?
在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，Agilent 1100LC 使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。
毛细管线分类：0.17mm内径 ------绿色 ;0.12mm内径-------红
色。
PEEK 管线：内径 -----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。
毛细管线优点: 柔韧性好.
***Agilent 公司同时备有1/16in 的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户 ,优点是刚性好,但柔韧性差一些。
4、流动相使用前为什么要脱气？
流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。
常用的脱气方法比较：
氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。
加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
抽真空脱气法：易抽走有机相。
超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。
在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？
溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4—7）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。
A：请严格执行溶剂过滤。
B：请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液
C：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.
D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。
E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。
堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。
6、Agilent 1100LC泵如何维护？
Agilent 1100LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相，及时合理的维护非常重要。
A：流动相使用前请必须脱气、过滤。
B：使用缓冲盐时，要加在线Seal-wash选项。
C：关机前，用 100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如甲醇），然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗] D：及时更换Purge Valve内的过滤芯。（当打开Purge Valve时，压力高于10bar，表明过滤芯已堵）。E：使用合适的密封圈。
7、如何选择合适的泵头活塞密封圈？
泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同的密封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n0905-1420 2/pk）
***注意：聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：0—200bar；建议在泵的压力限制中，将最大压力设为200bar。
8、使用梯度比例发时要注意那些事项？
当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常，阀A接水相/盐溶液，D接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。若颠倒过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。
强烈建议：当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通道接在A 通道上，有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上；定期用水冲洗所有的通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。
9、在线真空脱气机使用要注意那些事项？
一般来说，Agilent 1100LC 的真空脱气机无需过多维护，只需注意几个注意事项就可以了。
A：第一次使用，要用随仪器附带的注射器抽满脱气机腔体；更换不同类型的溶剂时，要先抽空，再抽满。
B：不用的通道要充满溶剂或密闭起来。
10、更换色谱柱时要注意什么事项?
在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积
（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，仪器的流动相管路连接非常重要,一般Agilent 1100LC 在第一次安装时,均有受过专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。客户只需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了，一般柱子入口接头为不锈钢卡套接头，柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧街头，当完成第一次安张后，不锈钢卡套已固定死，当接不同的柱子时，要注意柱子接头处的形状和长度，否则会产生一个非常大的死体积。
11、手动进样阀需做那些维护，使用时要注意什么？
对于手动进样器，当使用缓冲溶液后，或者进浓度差异比较大的样品时要用专用工具而不是用带针头的注射器冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。
注意事项：
●安装时六通阀的5，6出口要与注射器在同一水平线上，以防止虹吸现象的发生，导致进样量的重复性变异。
●进样量的多少要根据定量管的LOOP体积决定。
当样品量少时：进样体积由注射器的进样体积决定，但最大进样体积要小于1/2loop体积。
当样品量较多时：进样体积由定量管的体积决定，为保证样品完全把定量管的流动相置换干净，需注射5—6倍的LOOP体积。
●要使用专用的液相注射器进样，绝对不可以用气相的注射器。
高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法
诊状
(一)保留时间变化
可能的原因 : 解决方法
1.柱温变化: 柱恒温
2.等度与梯度间未能充分平衡 : 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够 : 用>25mmol/L的缓冲液
4.柱污染 : 每天冲洗柱
5.柱内条件变化 : 稳定进样条件,调节流动相
6.柱快达到寿命 : 采用保护柱
(二)保留时间缩短
可能的原因 : 解决方法
1.流速增加 : 检查泵,重新设定流速
2.样品超载 : 降低样品量
3.键合相流失 : 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀
5.温度增加 : 柱恒温
(三)保留时间延长
可能的原因: 解决方法
1.流速下降 : 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
2.硅胶柱上活性点变化 : 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
3.键合相流失 : 同前(二)3
4.流动相组成变化 : 同前(二)4
5.温度降低 : 同前(二)5
(四)出现肩峰或分叉
可能的原因: 解决方法
1.样品体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
2.样品溶剂过强 : 采用较弱的样品溶剂
3.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.进样器损坏 : 更换进样器转子
(五)鬼峰
可能的原因: 解决方法
1.进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
2.样品中未知物 : 处理样品
3.柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂
5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水
(六)基线噪声
可能的原因: 解决方法
1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压
2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
3.检测器灯连续噪声 : 更换氘灯
4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
5.检测器中有气泡 : 流动相脱气,加柱后背压
(七)峰拖尾
可能的原因: 解决方法
1.柱超载 : 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
2.峰干扰 : 清洁样品,调整流动相
3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
4.同前(四)4 : 同前(四)4
5.同前(四)3 5. : 同前(四)3
6.死体积或柱外体积过大 : 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
7.柱效下降 : 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
(八)峰展宽
可能的原因: 解决方法
1.进样体积过大 : 同(四)1
2.在进样阀中造成峰扩展 : 进样前后排出气泡以降低扩散
3.数据系统采样速率太慢 : 设定速率应是每峰大于10点
4.检测器时间常数过大 : 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
5.流动相粘度过高 : 增加柱温,采用低粘度流动相
6.检测池体积过大 : 用小体积池,卸下热交换器
7.保留时间过长 : 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
8.柱外体积过大 : 将连接管径和连接管长度降至最小
9.样品过载 : 进小浓度小体积样品
液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。
安捷伦高效液相色谱仪的规范操作
安捷伦高效液相色谱仪的规范操作 1. 目的：明确安捷伦高效液相色谱仪的规范操作，确保数据的准确性。 2. 范围：适用于安捷伦高效液相色谱仪。 3. 职责：检验人员对此负责。 4.操作规程： 系统组成 本系统由1个溶剂二元输送泵（分主/A泵和副/B泵）、手动进样阀、柱温箱、检测器、化学工作站和电脑等组成。 准备 4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相，用合适的μm滤膜过滤，超声脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的μm滤膜过滤。 4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常 将待测样品按要求前处理，准备HPLC 所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。 开机： 4.3.1 打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。4.3.2 打开1200 LC 各模块电源。 4.3.3 待各模块自检完成后，双击[Instrument 1 Online]图标，化学工作站自动与1200LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。 4.3.4 从[视图]菜单中选择[方法和运行控制]画面, 点击[视图]菜单中的[显示顶部工具栏]，[ 显示状态工具栏]，[系统视图],[样品视图]，使其命令前有[√]标志，来调用所需的界面。 4.3.5 把流动相放入溶剂瓶中。
4.3.6 打开冲洗阀。 4.3.7 点击[泵]图标，点击[设置泵…]选项，进入泵编辑画面。 4.3.8 设流速：5ml/min，点击[确定]。 4.3.9 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[启动]，点击[确定] ，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 4.3.10 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[关闭]，点击[确定]关泵，关闭冲洗阀。 4.3.11 点击[泵]图标，点击[设置泵…选项]，设流速：min。 4.3.12 点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击[确定]。 数据采集方法编辑 4.4.1开始编辑完整方法：从[方法]菜单中选择[编辑完整方法…] 项，如下图所示选中除[数据分析]外的三项，点击[确定]，进入下一画面。 4.4.2方法信息 4.4.2.1在[方法注释]中加入方法的信息（如：测试方法）。 4.4.2.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.3 泵参数设定 4.4.3.1 在[流速]处输入流量,如1ml/min，在[溶剂B]处输入,(A=100-B) ,也可[插入]一行[时间表] ,编辑梯度。在[压力限]处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 4.4.3.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.4 柱温箱参数设定 4.4.4.1 在[温度]下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。并选中它,点击[更多>>] 键,如图所示,选中[与左侧相同]，使柱温箱的温度左右一致。 4.4.4.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.5 检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区 域。参比带宽：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省
高效液相色谱法简介
高效液相色谱法简介 “色谱”一词是由俄国科学家斯威特提出的。色谱法是基于补充物质在相对运动物的两相之间分布时，物理或物理化学性质的微小的差异而使混合物相互分离的一类分离或分析方法。发展与上世纪初，飞速发展于五十年代，有超过30位科学家家因为它而获得诺贝尔奖，其有自己的理论和研究方法，同时也有众多的应用领域。 色谱法常见的方法有：柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。 柱色谱：柱色谱法是最原始的色谱方法，这种方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中，将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端，以流动相洗脱。常见的洗脱方式有两种，一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱，一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法，一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带，以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。柱色谱法被广泛应用于混合物的分离，包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。 薄层色谱：薄层色谱法是应用非常广泛的色谱方法，这种色谱方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层，用毛细管、钢笔或者其他工具将样品点染于薄板一端，之后将点样端浸入流动相中，依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。薄层色谱法成本低廉操作简单，被用于对样品的粗测、对有机合成反应进程的检测等用途。
气相色谱：GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体流动相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立起来。也正是由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸附，结果是在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后，立即进入检测器。检测器能够将样品组分的与否转变为电信号，而电信号的大小与被测组分的量或浓度成正比。当将这些信号放大并记录下来时，就是气相色谱图了。气相色谱被广泛应用于小分子量复杂组分物质的定量分析。 高效液相色谱：高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9-107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高效液相色谱（HPLC）是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效
高效液相色谱操作知识
高效液相色谱操作知识 （一）高压恒流泵的维护注意事项 泵的密封圈是最易磨损的部件，密封圈的损坏可引起系统的许多故障，要注意保养和定期更换。应采取下列措施以延长使用寿命： 绝对不允许在没有流动相的或流动相还没有进入泵头的情况下启动泵而造成柱塞杆的干磨。每天使用后应将整个系统管路中的缓冲液体冲洗干净，防止盐沉积，整个管路要浸在无缓冲的溶液或有机溶剂中。长期不用也要定期开泵冲洗整个管路。 要用HPLC级试剂 输液管前端要用烧结不锈钢沉子过滤流动相。要注意防止管路阻塞造成压力过高而损坏仪器。压力下限应设置在0.5~1MPa，以防止储液器中的流动相被抽干或严重渗漏而引起柱塞的干磨有柱后清洗功能的高压恒流泵还要注意保持清洗液，否则将失去柱后清洗效果。 (二)流动相使用的注意事项 必须使用HPLC级或相当于该级别的流动相，并要先经0.45?m薄膜过滤。 过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如02），如不脱气易产生气泡，增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。 几种脱气方法比较： 1、氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好但成本高。 2、加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 3、抽真空脱气法：易抽走有机相 4、超声脱气法：一种较为常见的脱气法。流动相放在超声波容器中，用超声波震荡10~15 分钟，此法效果并不太好但操作简单。 如果管路中使用peek树脂部件，请不要使用下列流动相： 浓硫酸、浓硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亚砜 特别注意HPLC使用过后的系统清洗： 含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法： 1、先用100%的纯水冲洗，打开排放阀，用3~5ml/min的流量，洗二十分钟左右后停泵。 此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗 2、再用5：95的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用1ml/min的流量，洗30~60分钟后停泵。此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用5%的甲醇主要是为了保护色谱柱。 3、最后用100%的甲醇清洗整个系统，用1ml/min的流量，洗2分钟左右，然后关机。
Agilent-1290-超高效液相色谱仪标准操作规程
Agilent 1290 超高效液相色谱仪标准操作规程 一、目的 制定Agilent 1290超高效液相色谱仪使用操作规程，确保操作人员能正确规范地操作液相色谱仪。 二、范围 适用于Agilent1290超高效液相色谱仪的使用。 三、操作规程 1 开机 1.1 打开计算机，进入 Windows画面。 1.2 打开 1290INFINITY HPLC 各模块电源。 1.3 待各模块自检完成后，双击“Instrument 1 Online”图标，化学工作站自动与 12001290INFINITY HPLC 通讯。 1.4 从“View”菜单中选择“方法和运行控制”画面，点击”视图”菜单中的“样品视图 “系统视图”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 1.5 点击泵下面的瓶图标，选择‘瓶填充‘如下图所示，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也 可输入停泵的体积。点击“Ok”。 1.6 从菜单“视图”中，选中“在线信号”，选中“信号窗口 1”，然后点击“改变…”钮， 将所要绘图的信号移到右边的框中，点击“确定”。(如同时检测二个信号，则重复选中“信号窗口 2”) 2 排气 2.1 首先在方法编辑中，泵的参数设置部分，选好需要排空的通道（保证是开的） 2.2 点击仪器状态视图中泵的图标，选择控制，出现如下图 2.3 勾上吹扫，并且输入流速，时间，比例就可以 purge 泵头。排空的时候阀会自动切换， 无需人为介入。 2.4 当我们发现泵头里面有气泡出不来的时候，选择预备---开。然后点击确定。此时泵会 用很强烈的方式朝外泵液体，并持续 20 次自动停止。 3 编辑数据采集方法 3.1 开始编辑完整方法： 从“方法”菜单中选择“编辑完整方法…”项，如下图所示选中除“数据分析”外
安捷伦1260高效液相色谱仪操作规程资料
安捷伦1260高效液相色谱仪操作规程
安捷伦1260高效液相色谱仪操作规程一、开机 （1）打开计算机，登陆windows操作系统。 （2）打开主机各模块电源（从上至下），待各模块完成自检后，再双击桌面“仪器1联机”图标，进入化学工作站，从视图菜单中选择“方法和运行控制”画面。 （3）进行仪器配置，点仪器-仪器配置-选择所需模块-自动配置-输入IP地址：192.168.254.11。把各流动相放入相应的溶剂瓶中。 （4）编辑方法。方法-新建方法-方法-编辑完整方法-编辑各项（四元泵、TCC、VWD、仪器曲线参数设定，仪器参数默认），完成后，文件→方法另存为→编辑名称，保存方法。 （5）排气。旋开排气阀（逆时针），右单击“四元泵”图标出现快捷键，点击“方法”设置泵流速，排气可设置1.2ml/min，l流量梯度100，也可 5ml/min，流量梯度10。一般冲洗3-5min，注意倾斜储液瓶使过滤头处 的气体进入管道才可使气体排出，观察管路中气体位置，以其排净为目的。关泵，关闭排气阀（顺时针）。（注意：先开排气阀，再开泵，先关泵，后关排气阀）。 （6）在让液体进入柱子之前应将甁填充设置为实际值，谨防空进。将泵流速设置1ml/min,用过渡液即缓冲液冲洗色谱柱20—30分钟。 （7）换流动相，待柱前压力基本稳定后，打开检测器，视图，在线信号，选择信号，观察基线情况。 二、数据采集信息编辑及进样
（1）编辑样品信息：点“单次样品”小瓶，或点击运行信息-单次进样，设定操作者姓名，样品数据文件名，进样量等。 （2）编辑好样品信息后方可进样。 三、数据处理 （1）打开桌面“仪器1脱机”，单击“数据分析”进入数据分析画面。 （2）从“文件”菜单中选择调用信号，选择您的数据文件名，单击确定。（3）谱图优化。从“图形”菜单中选择“信号选项”从范围中选择“自动量程”及合适的显示时间，或选择“自定义量程”调整，反复进行，直到图比例合适 为止。 （4）积分。从“积分”中选择“自动积分”，若积分结果不理想，从菜单中选“积分事件”，更改数据为合适的“斜率灵敏度、峰宽、最小峰面积、最小峰 高”，从“积分”中选择积分选项，则数据被积分，如积分结果不理想则修改相应的积分参数直到满意为止。单击左边图标将积分参数存入方法。（5）校正表设计。点击“校正”菜单中的“校正设置”给出各个参数，点击确定，调出建立校正表所需的谱图并对谱图进行图形优化和积分优化。点击校正→新建校正表，选择自动设定→确定，在校正表中给出正确的“化合物名”和“含量”如需增加校正点数，校正→添加级别，给出第二校正点的含量，以此类推。校正表建立完成后点击“确定”点击“保存图标”将校正表存入方法中，或点击文件-方法另存为-找到对应文件夹，编辑日期及前缀 存入。
高效液相试题及答案
高效液相色谱基础知识测试 一、填空题 1、我们公司所用的高效液相色谱仪的品牌是：安捷伦1260 。高效气相色谱仪的型号是安捷伦7890 。 2、高效液相色谱系统由恒温器、四元泵、进样器、色谱柱、检测器和分析系统组成。 3、本公司所用的高效液相，为防止压力过大导致柱内填料空间发生变化，影响分离效果。一般采用C18（十八烷基硅烷键合硅胶）填料的色谱柱，最高工作压力为400 bar。 4、高效液相根据流动相与固定相极性分为：正相高效液相色谱和反相高效液相色谱。 5、开机步骤：接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。 6、高效液相的维护：最后一次进样完成后，应用流动相冲洗20分钟，以保证洗脱完全，若流动相中含有无机盐类，应用高纯水冲洗30分钟，。 7、进样器的保养：每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。 8、气相色谱仪常用的检测器有热导检测器，氢火焰检测器，电子捕获检测器和火焰光度检测器。 二、选择题 1.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（D ） A.提高柱温 B.降低板高 C.降低流动相流速 D.减小填料粒度 2. 在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选用( A )
A.适当提高柱温 B.增加固定液含量 C.增大载体颗粒直径 D.增加柱长 3. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是( B ) A. 高压泵 B. 梯度淋洗 C. 贮液器 D. 加温 4. 在液相色谱中, 最通用型检测器是( A ) A.示差折光检测器 B.极谱检测器 C.荧光检测器 D.电化学检测器 5. 在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是( A ) A.直形填充柱 B.毛细管柱 C.Ｕ形柱 D.螺旋形柱 6. 实验室常用气相色谱仪的基本组成是（B ）。(1)光源；(2)气路系统；(3)单色器系统；(4)进样系统；(5)分离系统；(6)吸收系统；(7)电导池；(8)检测系统；(9)记录系统。 A 1-3-6-8-9 B 2-4-5-8-9 C 2-4-5-7-9 D 2-4-6-7-9 7.在气相色谱定性分析中，实验室之间可以通用的定性参数是（ D ）。 A 调整保留时间 B 校正保留时间C保留时间D相对保留值 三、判断题：（正确-----√；错误----×） 1. 确基线噪音和漂移是检测器稳定性的主要技术指标（√） 2. 灵敏度是检测器的主要性能指标（√） 3. 检出限与噪音无关（×） 4. 要提高柱的分离效能，可以考虑增加柱长，增加色谱柱选择性，调节流动相的组成等措施（√） 5. 溶解于流动相中的气体在色谱分离的过程中不会影响流动相的流速和检测器的稳定性（×） 6. 分析一个复杂混合物，恒溶剂洗脱是不能令人满意的。可在分离的过程中连续改变流动相的组成，即所谓梯度洗脱( √)
Agilent1100高效液相色谱仪操作规程
Agilent1100高效液相色谱仪操作规程 操作说明： 1.开机前准备： 1.1仪器设备：Agilent 1200LC ● G1322A (在线脱气机)。 ● G1311A (四元泵)。 ● G1329A（标准型自动进样器）。 ● G1316A（柱温箱）。 ● G1315A（DAD检测器）。 ●色谱柱 1.2溶剂准备： ●有机相必须是色谱级纯。 ●水相必须是二次蒸馏水或用二级蒸馏水配置的缓冲盐溶液、 酸碱溶液。 ●流动相使用前必须过0.45μm的微孔滤膜。有机相和水相微孔滤膜的选择参考下表。
2.基本操作步骤: (一)、开机： 1、打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序（部分安装程序不需要运行Bootp）。 2、打开 1200 LC 各模块电源。 3、待各模块自检完成后，双击“仪器1 联机”图标，化学工作站自动与1200LC通讯，进入的工作站画面如下所示。 4、从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面, 点击“视图”
菜单中的“仪器实际值”，“在线光谱”，“化学工作站状态”，“系统视图”,“样品视图”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 5、把流动相放入溶剂瓶中。 6、打开冲洗阀。 7、点击“泵”图标，点击“设置泵…”选项，进入泵编辑画面。 8 、设流速：5ml/min，点击“确定”。 9、点击“泵”图标，点击“控制…”选项，选中“启动”，点击“确定”，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 10、点击“泵”图标，点击“控制…”选项，选中“关闭”，点击“确定”关泵，关闭冲洗阀。 11、点击“泵”图标，点击“设置泵…选项”，设流速：例如1.0ml/min。 12、点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击“确定”。
高效液相色谱(HPLC)基础知识
高效液相色谱（HPLC）基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表： 方法项目 数量 1985年版1990年版1995年版2000年版 HPLC法 鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。 I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用
碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色 谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用 液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在 5
高效液相色谱仪(Agilent 1100型)操作步骤
一、开机 1、开机前准备：流动相使用前必须过0.45um的滤膜（有机相的流动相必须为色谱纯；水相必须用新鲜注射用水，不能使用超过3天的注射用水，以防止长菌或长藻类）；把流动相放入溶剂瓶中。A瓶：为水相；B瓶：为有机相。 2、打开电脑，选Win 2000，进入Win 2000界面。 3、双击CAG Boodp server图标，放大CAG Boodp server小图标，出现窗口，5min内打开液相各部件电源开关，等待1100广播信息后，表示通讯成功连接，关闭CAG Boodp serve窗口。 4、双击online图标，仪器自检，进入工作站。 该页面主要由以下几部分组成： ——最上方为命令栏，依次为File，Run Control，Instrumen…等； ——命令栏下方为快捷操作图标，如多个样品连续进行分析、单个样品进样分析、调用文件保存文件……等； ——中部为工作站各部件的工作流程示意图；依次为进样器-输液泵-柱温箱-检测器-数据处理-报告； ——中下部为动态监测信号； ——右下部为色谱工作参数：进样体积、流速、分析停止时间、流动相比例、柱温、检测波长等。 4、从“View”菜单中选择“Method and control”画面。 二、编辑参数及方法 1、开始编辑完整方法： 从“Method”菜单中选择“New method”，出现DEF-LC.M，从“Method”菜单中选择“Edit entire method”，选择方法信息、仪器参数及收集参数、数据分析参数和运行时间表等各项，单击OK，进入下一画面。 2、方法信息： 在“Method Comments”中加入方法的信息，如方法的用途等。单击OK，进入下一画面。 3、泵参数设定： 进入“Setup pump”画面，在“Flow” 处输入流量，如1ml/min；在“Solvent B”处输入有机相的比例如70.0，（A=100-B），也可在Insert 一行“Timetable”，编辑梯度；输入保留时间；在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。单击OK，进入下一画面。 4、DAD检测器参数设定： 进入“DAD signals”画面，输入样品波长及其带宽、参比波长及其带宽（参比波长带宽默认值为100nm）；选择Stoptime：as Pupm； 在“Spectrum”中输入采集光谱方式“store”：选All；如只进行正常检测，则可选None；范围Range：可选范围为190~950nm；步长Step可选2.0nm；阀值：选择需要的灯； Peak width（Response time）即响应值应尽可能接近要测的窄峰峰宽，可选“2s”或4s； Slit-：狭窄缝，光谱分辨率高；宽时，噪音低。可选4nm
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括： 1.高效液相色谱法（HPLC）的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼） 3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法（HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相
的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅
(干货)液相色谱基础知识大全
一、基本原理 高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。 高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。 二、高效液相色谱分析原理 （1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 （2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分 离。 开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。 三、工作原理 储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。 四、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
高效液相色谱实验
化学与材料工程学院 环境监测分析实验报告 实验名称：高效液相色谱分析苯-甲苯混合物 专业班级：应化13 学号： 150313135 姓名：朱建南 指导教师：翟春 实验地点：敬行楼A210 实验日期： 2016年 11月 28日
高效液相色谱实验 一、实验目的 1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作； 2．学习苯-甲苯混合物的定性分析方法； 3．评价色谱柱柱效； 4．了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点； 5．学习未知样品的定量分析方法。 二、实验原理 不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。 色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等 1．色谱定性分析方法 a保留时间定性 b 峰高增量定性 2．色谱定量分析方法 a 归一化法,要求所有组分必须全部出峰。 b 标准曲线法（外标法）。简单、方便, 结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。 三、仪器与试剂 LC-1602A型高效液相色谱仪、甲醇(色谱纯) 、苯、甲苯、苯－甲苯 四、高效液相色谱仪操作步骤 1. 流动相的预处理 甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。 2. 准备苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样 3. 高效液相色谱仪操作 a 依次高压输液泵和检测器电源开关； b 打开色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，并开灯； c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。 d 关闭三通阀，设置最小压力(0.1)和最大压力(20)，并设置实验需要的流速 (0.5ml/min)，启动高压泵。 e用平头微量注射器洗涤进样口后，取试液30 μL，将进样阀柄置于“Load”位置时
agilent高效液相色谱仪标准操作程序
Agilent 1200高效液相色谱仪标准操作程序 1.目的 使操作人员的操作步骤规范化. 2.适用范围 适用于仪器安装、调试、校准后正常状态下进行的操作. 3.责任者 质控科仪器分析员对此规程负责. 4.规程 4.1清洗液、流动相、封柱液预处理 4.1.1所有清洗液、流动相、封柱液在使用前均需过滤、脱气以及混合均匀. 4.1.2甲醇-水（10：90）、乙腈-水（10：90）、超净水、乙腈均需存放在棕色溶剂瓶中. 4.1.3含有乙腈的溶液以及不含乙腈但含有较高比例的其他有机溶剂的溶液在过滤时需使用有机相微孔滤膜，其它溶液在过滤时需使用水相微孔滤膜. 4.1.4存放清洗液、流动相、封柱液的溶剂瓶在每次装入溶液前需用少量过滤好的该溶液清洗数次. 4.2接通电源，开启连机电脑，再接通仪器电源，仪器自检完毕，处于准备进行状态.双击桌面图标“仪器1联机”，打开Agile nt 1200化学工作站，在左上角下拉框中选择“方法与运行控制”界面.显示如下图
标: 燈InatEU-ent I :方払和铤乔哲制 注意：一定要先双击“仪器1联机”图标，进入联机状态，方可双击“仪器1脱机”图标，同时进入脱机界面?否则，将无法联机. 4.2泵421准备清洗液并装入溶剂瓶中，将吸滤器放入瓶内.安装所需用柱子. 4.2.3将吹扫阀（即“Purge”阀）打开，单击泵图标—" 选择“设置泵”，将“流速”设置为3.00ml/min.选择清洗液所在通道（建议为A通道），单击“确定”，在“系统视图”中单击“启动” 运行泵，泵运行10分钟后，观察压力，应小于10bar,若大于此压力，应更换purge阀滤芯，调节流速1.00ml/min.
高效液相色谱基本常识
被分离组分在柱中的洗脱原理 Ⅱ 基本概念和理论 一、基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 ⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）. ⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 ⊕噪音（noise）――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 ⊕漂移（drift）基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 ⊕色谱峰（peak）--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。 ⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（symmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T<0.95为前延峰， T>1.05为拖尾峰。 ⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。 ⊕峰高（Peak height,h）――峰的最高点至峰底的距离。 ⊕峰宽（peak width,W）--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。 ⊕半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半处的峰宽。W h/2＝2.355σ。 ⊕标准偏差（standard deviation, σ）--正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 ⊕峰面积（peak area,A）――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h＝ 2.507σh=1.064Wh/2h 2.定性参数（保留值） ⊕死时间（dead time,t0）--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
安捷伦1100及液相色谱仪的基本知识
安捷伦1100液相色谱仪各项性能指标 悬赏分：5|解决时间：2010-10-16 22:13|提问者：4329211 最佳答案 朋友，直接致电agilent的800-820-3278免费电话就可以得到Agilent的满意答复了 系列Agilent 1100泵系统 ●电子流控阀(EFC)控制的毛细液相泵系统，精度高、流速范围广柱流速范围：1-20ul/min;10-100ul/min（可选件） 0.001-2.5m1/min(EFC关闭状态) ●高压制备泵系统，单元或双元高压制备泵 流速范围:0.001-100m1/min ●分析型泵系统 流速范围： 单元泵：0.001-10m1/min 二元泵：0.001-5m1/min 四元泵：0.001-10m1/min 品种齐全的Agilent 1100系列进样系统 ●标准手动进样器（分析型或制备型） ●标准自动进样器 样品瓶容量：可达100个(2mlx100) 进样量：0.1-100ul(0.1-1800ul)可选件 ●微盘式自动进样器 样品瓶容量：2x96(孔板)，2x386(孔板)或100x2ml 进样量：0.1-100ul(标准件) 0.1-1500ul可选件 ●微量标准自动进样器/微盘式自动进样器 进样量：0.01-8ul（标准）;0.01-40ul（可选） ●恒温标准自动进样器/微盘式自动进样器 温度范围：4-40℃可设定步进1℃ ● 220型微孔板式自动进样器－组合化学样品管理系统 样品瓶容量：各种规格试管多达12个微孔板（96孔板,384孔板） 进样量：0.1-5ul;0.1-20ul Agilent 1100系列检测器 ●可变波长扫描紫外检测器（VWD) 波长范围：190?600nm ●多波长检测器(MWD)
Agilent1200型高效液相色谱仪操作手册
Agilent 1200 LC （中文版 B01.01） 现场培训教材 安捷伦科技有限公司 生命科学与化学分析仪器部
一、培训目的： ●基本了解1200LC硬件操作。 ●掌握化学工作站的开机，关机，参数设定,学会数据采集,数据分析的基本操作。 二、培训准备： 1、仪器设备：Agilent 1200LC ●G1310A :(单元泵)；G1312A(二元泵)；G1311A(四元泵)。 ● G1313A（标准型自动进样器）。 ● G1316A（柱温箱）。 ● G1314A（VWD检测器）。 ● G1362A（示差检测器）。 ●色谱柱: Eclipse XDB-C18 150 x 4.6 mm, 5um column P/N 993967-902 2、溶剂准备： ●色谱级纯或优级纯乙腈或甲醇。 ●二次蒸馏水
基本操作步骤: (一)、开机： 1、打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。 2、打开 1200 LC 各模块电源。 3、待各模块自检完成后，双击“Instrument 1 Online”图标，化学工作站自动与1200LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。 4、从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面, 点击“视图”菜单中的“显示顶部工具栏”，“显示状态工具栏”，“系统视图”,“样品视图”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 5、把流动相放入溶剂瓶中。 6、打开冲洗阀。 7、点击“泵”图标，点击“设置泵…”选项，进入泵编辑画面。 8 、设流速：5ml/min，点击“确定”。 9、点击“泵”图标，点击“控制…”选项，选中“启动”，点击“确定”，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 10、点击“泵”图标，点击“控制…”选项，选中“关闭”，点击“确定”关泵，关闭冲洗阀。 11、点击“泵”图标，点击“设置泵…选项”，设流速：1.0ml/min。 12、点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击“确定”。
高效液相色谱知识收藏
高效液相色谱知识收藏 Agilent1100高压液相色谱仪差不多操作步骤Agilent1100液相差不多操作步骤 Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项： 高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法 液相色谱柱使用及保养 高压液相色谱HPLC培训教程(一)
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Agilent1100高压液相色谱仪差不多操作步骤Agilent1100液相差不多操作步骤 (一)、开机： 1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp Server程序。 2、打开 1100 LC 各模块电源。 3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。 4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 5、把流淌相放入溶剂瓶中。 6、打开Purge阀。 7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。 8 、设Flow：5ml/min，单击OK。 9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump control选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换信道接着Purge，直到所有要用信道无气泡为止。
安捷伦1260型高效液相色谱仪详细操作规程
1.目的：规范Agilent 1260高效液相色谱仪维修、保养、校正操作。 2.适用范围：本公司化验室Agilent 1260高效液相色谱仪的维修、保养。 3.有关责任：化验室精密仪器室 4.引用标准：仪器说明书及Agilent化学工作者现场操作培训教材 5.规程内容： 5.1开机前准备 5.1.1根据实验要求配制流动相，须经0.45μm滤膜过滤，之后再进行脱气处理，使用前必须用超声波振荡l0-15min，按无机相和有机相分开别装入溶剂瓶A（装有洗盐装置，最好固定盛放无机盐水相）、B中；对照品和样品溶液进样前要经0.45μm滤膜过滤。 5.1.2若流动相中含有缓冲盐,则必须以每分钟2～3滴的速度虹吸10%的异丙醇水冲洗seal-wash，以防有盐结晶在泵头产生而损坏泵头。 5.2.采样前准备 5.2.1打开计算机,进入 Windows 系统, 从上到下依次打开各模块电源。5.2.2待各模块自检完成后，双击桌面上的“仪器1联机”图标，将自动进入化学工作站画面。 5.2.3从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面,也可单击工作站画面左侧的“方法和运行控制”项，进入方法和运行控制窗口。 5.2.4打开Purge阀（逆时针），右击“泵”图标出现参数设定菜单单击“设定泵”选项进入泵编辑画面。 5.2.5设“流量”逐步增大流速至5ml/min ，A通道设到100%，单击“确
定
”。 5.2.6单击“泵”图标，出现参数设定菜单，单击“泵控制“选项选中“开”单击“确定”则系统开始Purge，直到管路内由溶剂瓶A到泵入口无气泡为止；切换B通道(B通道设到100%)继续Purge直到所有通道管路内均无气泡为止。(查看柱前压力，若大于10Bar，则应更换排气阀内滤芯/过滤白头。) 5.2.7将泵的流量设到0.5ml/min，若使用双泵则应设定溶剂配比，如A=80%，B=20%；关闭排气阀（顺时针）；再将流量设到0.8ml/min，2分钟后设定至方法所需流速，冲洗色谱柱20-30min。 5.2.8单击泵下面的瓶图标，输入溶剂瓶A、B内流动相的实际体积（为保护泵和色谱柱，请按实际体积输入）和停泵的体积单击“确定”，如果各溶剂瓶溶剂体积小于停泵体积，泵将自动停止。 5.2.9把缓冲液（用于柱子过渡的，与流动相等比例的乙腈/水、甲醇/水或10%的水溶液）换成流动相，排气后，逐步增加至所需流速，待柱压基本稳定后，打开检测器等，观察基线情况。 5.3.数据采集 5.3.1采集方法编辑 5.3.1.1编辑完整方法：从“方法”菜单中选择“编辑完整方法”项，选中除“数据分析”外的三项，单击“确定”进入下一画面。 5.3.1.2方法信息：在“方法注释”栏中加入（如方法的用途等），单击“确定”进入下一画面。