高等药物分析复习资料.doc

1、简述现代药物分析较传统药物分析的新特点。

静态分析-*动态分析

体外分析”体内分析

品质分析f生物活性分析

单i技术f联用技术

小样本分析f高通量分析

人工分析-> 计算机辅助分析

特点：（1）新的药物分析理论、方法、技术迅速发展，具有高通量、高灵做、高选择性优点；（2）分析仪器口动化、数字化、仿牛化和计算机化并向智能化、信息化方向发展；（3）药物分析测定对彖、内容亦有很大的扩展。如对药物的晶型和构熨研究、药物中存在的有关物质（含降解产物）结构研究、手性药物的分离、药物代谢研究、基因工程药物分析、复杂物质分离分析（含中药成分分析）等。

2、简述现代药物分析的新进展主要有哪些方面。

①分析领域的发展：药物质量控制、手性药物分析、临床药学、中药与天然药物分析、药物代谢分析、法医毒物分析、兴奋剂检测、药物制剂分析、创新药物研究、药需上市后的评价。

②分析技术的发展：核磁共振波谱、荧光分析法、薄层色谱法、紫外■町见分光光度法、高效液相色谱法，毛细管电泳，多维色谱及联用技术。色谱■光谱联用技术使高分离性能的液相色谱技术与能够获得丰富化学结构信息的光谱技术相结合，是现代药V研究领域中最强有力的分析工具之一。

3、常用的手性固定相有哪些？并简述其各自的原理。

①环糊精衍牛物于-性固定相：拆分机制一般认为是市于环糊精特殊的桶状结构，对与对映休形成非对映的包合物而达到拆分目的。

②冠醯类手性固定相：川手性冠醯作固定相分离手性化合物的主要依据是溶质分了与手性冠瞇环腔形成主客体络合物的稳定常数不同.冠陋的手性“臂障“越大，其手性识别能力越高.

③多糖类手性固定相：它们本身表现出一定的手性识别能力，但其直接做固定相选择性低，然而其衍生物作为CSP具有较高的手性识别能力，能拆分大量的对映体。

④Pirkle型手性固定相（刷型固定相）：该类固定相通过含末端梭基或异置酸酷基手性询体与氨基键合硅胶进行缩合反应，分别形成含豔胺或服型结构CSP,广泛用于氨基酸、乙内駄脉、内駄脉、胺类、醇类及硫醇类药物对映体拆分。

在该类CSP上的对映体分离通常通过以卜?几种作用而发生：（1）被分离溶质与CSP芳坏的a受体和儿授体之间的“作用；（2）CSP上的仲胺、按基基团与溶质的酸性质子、矩基、氨基之间的氢键作用；（3）偶极?偶极作用；（4）大体积非极性基团靠近CSP手性中心而产生的空间立体效应.

⑤配体交换型（L EC）手性固定相：是利用配体交换的分离机制而制成的固定相，即一个金属离子可结合一个配体分子和一个对映体溶质分子，形成可逆的非对映体复合物，以达到分离对映体的忖的，这类手性固定相的液相色谱多用于氨基酸或者肽类的拆分，这类色谱多用含水流动相，其中加入适量螯合的金属离子.

⑥人环抗生索类手性固定相：是将包含多个手性中心的人环抗生索固定到硅胶上形成的一类用于对映体拆分的新型手性固定相。

⑦分子印迹手性固定相：它是将功能单体，在模板分子（R标分子，乂称印迹分子）的存在卞，交联聚合，然后洗脱除去模板分子，这样制得的聚合物，在空问结构和功能基排布上与口标

分子具有互补结构的空穴，因此在分子识别中有着特殊的选择性和良好的应用前景.

⑧蛋白质类手性固定相：其具有大量不同的可与样品分子结合的部位，此外样品组分的保留和选择性易受流动相的pH、离子强度、有机溶剂等影响，因此蛋白质CSP的手性选择性较其他CSP耍高，是高效液相色谱分离中最具吸引力的手性固定相Z—

⑨手性聚合物固定相：该类固定相使用最多的有两种:一种是通过在手性条件下不对称聚合制备的，如川手性催化剂;另一种是川手性单体的方法制备的。用这两种技术可制备有手性识別功能的聚合物，如聚甲基丙烯的三苯甲酷，聚酿胺等，这类手性聚合物可涂渍或键合到硅胶上制成CSPo

4、手性高效液相色谱法的分类有哪些？并简述其各自的原理。

(1)间接法：对映体的混合物与手性试剂结合，形成一对非对映异构体，然斤以常规固定相或手性方法分离，这种方法也称为柱前衍生化法或手性衍生化试剂法(CDR)。此法主要适川于不宜直接拆分的样吊，无须使用价格昂贵的手性柱。但此法对衍牛化试剂纯度要求较高, 所使用的衍生化试剂必须具有足够的光学纯度和稳定性，在衍主化反应和色谱条件下稳定; 且衍生化条件复杂，费时费力，所得单一对映体有时不易与衍生化试剂分离。但该法仍不失为一种普遍、髙效的对映体拆分方法。

(2)直接法：不做柱前衍生化处理，直接以手性固定相或手性流动相拆分的方法，称为直接法。又分为手性固定相法(CSP)和手性流动相添加剂法(CMPA)o手性固定相(CSP)法是以手性固定相直接与对映体外消旋物相作用，因牛成的短暂的复合物稳定性不同，从而引起二者柱内保留时间不同而进行分离的方法。目前，以商品出售的手性固定相有上百种之多，具有简便、快速、立体选择性强、适用范围广等优点。手性流动相添加剂法(CMPA)又称手性添加剂法，这种拆分法是在流动相中加入手性试剂，利用手性试剂与各对映体结合的稳定常数不同，以及药物与结合物在固定相上分配系数的不同来进行分离。此法不需昂贵的手性柱, 亦无须进行柱前衍主，手性添加剂可视要求而更换，使用比较方便。

5、毛细管电泳的种类有哪些？毛细管电泳分离的驱动力是什么？

毛

细管电泳比高效液相色谱高效的原因是什么？

种类：毛细管电泳根据分离模式的不同，可以分为毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动毛细管色谱(MECC或MEKC)、毛细管凝胶电泳(CaPillary Gel Electrophoresis, CGE)、毛细管电色谱(CaPillary eleetrochromatogaphy, CEC)> 毛细管等电聚焦(CaPillary isoeleetric focusing, CIEF)、毛细管等速电泳(CaPillary Isotachophoresis, CITP)等。

毛细管区带电泳(CZE)是毛细管电泳的最基本的工作方式。它的分离机制是基丁?各被测物质在溶液中的淌度差异，影响组分淌度的因素有组分的荷质比、结构和体积。CZE是最简单也是应用最广的一种模式，可用于氨基酸、耿、蛋白质、简单离子和对映体等分析。

胶束电动毛细管色谱(MEKC)是采用表而活性剂在运行缓冲液内形成动态胶束，利用样品各组分在水相、胶束相两相间分配行为上的差异进行分离，是色谱技术和电泳技术的结合。

毛细筲凝胶电泳(CGE)是将凝胶充入毛细管中作支持物，不同体积的溶质分子在起分子筛作川的凝胶中得以分离。凝胶粘性人、抗对流、能减少溶质扩散，柱效极高，但是CGE 制备困难，易产牛空泡。后来发展了无胶筛分，用粘度低的线性聚合物溶液代替高粘度的聚丙烯瞅胺，同样起到了分子筛的作用，而且比凝胶柱便宜、寿命长，但是柱效稍低。CGE 现己广泛用于DNA 片段的分析。

毛细管等电聚焦(CIEF)川两性电解质在毛细管内建立pH梯度，使各种不同等电点的蛋口质在电场的作用下迁移到等电点的位置，形成一非常窄的聚焦区带。可用于测定蛋口质的等电

点、分离异构体和其它方法难以分离的蛋口质。毛细管等速电泳（CITP）可用较人内径的毛细管，在微制备中很有用途，可作为柱前浓缩方法用于富集样品。

毛细管阵列电泳（CapillaryArrayEleetrophoresiS, CAE）的分离模式渐渐呈现出了广阔的应川发展前景和趋势。与传统聚丙烯瞅胺凝胶板电泳相似，可以进行多道平行分析，毛细管阵列电泳即是采用多根毛细管组成的阵列进行多道分析的一种分离模式。

毛细管电泳分离的驱动力：在毛细管屮阳离子、屮性分子和阴离子自身淌度或/和分配系数不同。

在高效毛细管电泳中，电渗流是推动溶液移动的驱动力，它使柱屮溶液整体向前匀速移动，界而滞留现象很小，即以塞式移动（平流），而高效液相色谱中则是以抛物线形状流动（层流），故髙效毛细管电泳中的峰展很小，柱效要高的多。

6、H PLC-ESI-MS联用分析条件选择时需考虑的主要因索有哪些？

流动相：常丿IJ流动相为水，甲醇、乙脂及它们的混合物，需要调节pH时还可使川醋酸、甲酸或它们的鞍盐溶液，应避免磷酸盐或离子对试剂等。

流量：流量对分析也有较大的影响，要根据柱内径和接口的不同来选择流量。较小的流速可获得较好离子化效率。尽量选内径小的色谱柱。但是要兼顾分析速度的因素，因此多采用内径2.1 mm的色谱柱，0.2~0.4ml/min的流速。

离子检测模式：碱性物质选择正离子检测模式，可川酷酸或卬酸使试样酸化至pH=pKa-2；酸性物质，pH值在（pKa+2）,负离子检测。

温度：接口的干燥气体温度应高丁待分析物沸点20°C左右，同时要考虑物质的热稳定性和流动相中有机溶剂的比例。

7、在进行天然药物HPLC-UV分析时，是否可以直接对得到的单一色谱峰进行含量测定？

-?般來说是不可以直接对得到的单一色谱峰进行含量测定。HPLC-UV作定量分析，依据的是峰面积（早期也川过峰高），而峰面积会因多种因素而变化：①色谱柱②流动相③柱温。上述三个因素都会导致保留时间的变化，峰面积也会因此有大小不同的变异。另外就是UV检测器，波长的准确度会因使用时间，仪器设计（如杂散光大小），环境温湿度的改变等而变化，如果待测物的最犬吸收峰的带宽较窄，或采用末端吸收的时候，尤其明显。所以作禽量测定的时候一?般都用标准曲线法或标准对照法。

另外值得注意的是所谓单一?色谱峰，并不一定是单一?化合物，需要对峰的纯度作判断。

但是在某些情况下，也可以直接对得到的单一色谱峰，作出含量（浓度）判断。比如同一类化合物（如黄茂皂昔类，黄酮类），可以用随行的一个化合物的标样來估算别的化合物, 因为它们的紫外特征很相似，这也是归一化法的基础；再比如同一套色谱系统上测出的校止因子或工作曲线，在以后的几天内，可能变化不大，那么这几天也可以不随行标样。

8、简述高速逆流色谱的原理。

HSCCC同-般的逆流色谱技术一样，也是基F液-液分配原理，其独待之处在于它是建立在单向性流体动力平衡体系之上的一种逆流色谱分离方法C仪器工作时,互不相溶的两相溶剂在绕成螺旋管的聚四氟乙烯管内具有单向性流体动力平衡性质，即在一定的螺旋管转动（行星运动）速度下，如果从尾端送入首端相?它将穿过尾端相移向首端；同样，如果从首端送入尾端相，它会穿过首端相而移向螺旋管的尾端〉如果用其中的某一相溶剂作固定相,输液泵可以输送

另一相溶剂（流动相）载看样品穿过其中。在离心力的作用下，两相溶剂在螺旋管中实现岛效的接触、混合、分配和传递?同时彼分离组分在曲相间进行不断的分配。由于样品中各组分在两相中的分配能力不同，导致在聚四氟乙烯管中移动的速度也不同，因而能使样品中各组分得到分离。

9、简述胶束形成的条件和原理，以及胶束在分析中的特点。

条件：胶束是表面活性剂在溶液中的浓度超过某一临界值后，其分子或离子自动缔合成的胶体大小的聚集体质点微粒，这种胶体质点与离子Z间处于平衡状态。

原理：单个表而活性剂分子在溶于水后，完全被水分子包围，分子中的亲水基团有被水吸引的趋势，而亲油基团则被水排斥，因此表面活性剂分子占据溶液表面，在表而吸附，将其亲油基团伸向空气。这种表面吸附达到饱和后，如果表面活性剂的浓度继续增加，则溶液内部的表面活性剂分子将采取另一种对水进行排斥的方式，即分子中的长链亲油基团通过分子间吸引力相互缔合，口身相互抱成团，而亲水基团则伸向水中，与水分子结合，形成聚集体, 即胶朿。

特点：胶束具有增散作用，提高分析检测的灵敬度。胶束具有增稳作用，提高反应体系或分析体系的稳定性。此外胶束还具有增加对比度的作用。其中胶束液相色谱法还可以提高色谱分离的选择性。

毛细管胶束电泳色谱分离原理：MECC屮存在有两相，一相是以胶束形式存在的准固定相, 另一相是作为载体的液相，又称流动相。试样中的组分在MECC中的分离，从本质上来说, 是市它们的分子和胶束相及流动相分子Z间的相互作用的差异造成的，尽管对不同的胶束相互作川的形式不同，但是它们所反映的问题木质是一样的。具体来说，溶质在毛细管柱内受到两种力，一是胶束对它的作丿IJ力，二是流动相的溶解力，即溶质处于两个作川力场的平衡乙小，作用力强，溶解力差时，溶质有较大的保留；反么，则较早流出毛细管柱，见图4.3.

也就是说，不同组分分子和胶朿相与流动相分子相互作用的不同，最终将导致它们在两相中的浓度比不同，或者说分配系数不同。设X物质因相互作用较大，而在胶束相中的浓度较大，Y物质因相互作用较小而浓度较小，则X的分配系数大于Y的分配系数（分配系数1<=溶质在胶朿相的浓度/溶质在流动相的浓度），在这一MECC系统中，X在Y的后曲流出。

综上所述，不同组分在毛细管胶朿电动色谱中的分离，从根本上來说是由于它们的分子与胶束和流动相分子相互作用的差异造成的，而这种相互作用的差异通过分配系数的差异来反映，分配系数和上述一系列微观参量都有明确的定量关系。

10、ELISA检测试剂盒的技术和应用。

ELISA是一种免疫测定（immunoassay, IA）。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物厉，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标木中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。

ELISA的基本原理是将特异的抗原-抗体免疫学反应和酶学催化反应相结合，以酶促反应的放大作用来显示初级免疫反应，它既可测抗原，也可测抗体。ELISA用固相载体吸附抗体（抗原），加待测抗原（抗体），再与相应的酶标记抗体（抗原）进行抗原抗体的特异免疫反应, 牛成抗体（抗原）-待测抗原（抗体）-卿标记抗体（抗原）的复合物，最后再与该卿的底物反应牛成有色产物待测抗原（抗体）的定暈与有色产物量成正比，根据吸光度值计算抗原（抗体）的量ELISA法既可进行定性，又可进行定量测定。一般采用商品化的试剂盒进行测定。

完整的ELISA试剂盒包含7个组分：包被了①抗原或抗体的固相载体，②酶标记的抗原或抗体，③酶的底物，④阴性和阳性对照品，参考标准品，控制血清，⑤结介物及标木的稀释液，⑥洗涤液⑦酶反应终止液。，分类：主要技术类型有双抗体夹心法间接法捕获法竞争法

应用：由于ELISA（悔联免疫吸附试验，卿联免疫试剂盒）具有快速、敏感、简便、易于标准

化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。目前ELISA（酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒）方法己被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断、动物检疫方而、兽药残留检测中应川的、农药残留检测、动物性食品中药物残留检测、牛物毒素的检测、转基因食品女全性的检测。11、简述药物分析试验方法学验证的内容及其具体含义、表示方法等。

①准确度：指该方法准确性指的是测量值与真实值或认可的参考值之间相近程度。i般用百分回收率表示。

②精密度：在规定的条件下，用该法测得的一组测量值彼此Z间的接近程度。一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差（变异系数）來表示。

③专属性（选择性）：专属性是指在一些町能存在的组分如杂质、降解产物、基质等的存在下，对被分析物质的准确可靠的测定。专属性常用添加了杂质、降解产物、相关化合物的样品与未曾添加的样品所得的分析结果的偏离程度来表示。

④检测限：是指试样中被测物能被检测出的最低量。常用白分数、ppm、ppb表示。

⑤定量限：指样品中北侧无能被定量测定的故低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。常用信噪比法来确定。

⑥线性：是指设计的范围内，测量结杲与试样中被测物浓度玄接呈正比关系的程度。常考察浓度与信号的线性程度來衣示。

⑦范围：指能达到一定粘密度、准确度和线性的条件下，该测试方法使川的高低限浓度或量的区间。需考虑方法的具体应川、线性、准确度、粘密度结果和要求来确定。

⑧耐用性：是指在测定条件有少的变动时，测定结果不受影响的承受程度。经帘用考察不同条件进行实验结果來确定方法的耐用性。

12、简述质量标准制订的基础、原则，以及起草说明的原则。（P489）制订基础：在新药的研究开发期间，要对新药的制备工艺、结构确认、一般药理学、主要药效学、毒理学筹方面进行研究，还需要进行系统的质量研究和药品稳定性考察

原则：①药品的安全性和有效性

②方法的科学性和先进性

③控制指标的针对性和合理性

起草说明的原则：

A原料药质量标准的起草说明应包扌舌下列内容

①概况：说明本品的临床用途；我国投产历史，有关工艺改革及重大科研成就；国外药典收载情况；口前国内生产情况和质量水平。

②生产工艺：川化学反应式表明合成的路线，或川简明的工艺流程表示；要说明成品的粘制方法及可能引入成品中的杂志。如国内牛产采用有不同的工艺路线或精制方法，应分别列出，并尽可能注明生产厂家。

③标准制订的意见或理由：按标准内容依次说明（包括产品质量的具体数据或牛产厂检验结果的统计）。对鉴别、检査和含量测定方法，除已载入药典附录以外，要根据现有资料（引用文献）说明其原理，特别是操作中的注意事项应加以说明。对个别进行过方法学研究的项目，应另附专题研究报告。

④与国外药典及原标准进行对比，并对本标准的水平进行评价。

⑤列出起草单位和复核单位对本标准的意见（包括木标准屮尚存在的问题，以及今后的改进意见）。

⑥列出主要的参考文献

B新增制剂标准的起草说明还应包括

①处方：列出附加剂的品名和用量，如国内生产有多种处方时，应尽可能分别列出（注明生产厂），并进行比较。

②制法：列出简要的制备方法。

③标准制订的意见和理由：除了与新增原料药要求相同外，还应有对制剂的稳定性考察材料并提出有效建议的说明。

C上版药典已收载品种的修订说明对修订部分，根据下列情况分别说明：

①对附录方法有实质性修改的项bl （如崩解时限检查法、栓剂、气雾剂），应说明照新附录对产品进行考核的结果，并列出具体数据；

②对原标准的检验方法进行过修改的项目，或新增的检验项目，要说明增修订的理市、方法和来源，并写出产品的检验数据，含量测定方法的修改要附有专题研究材料；对原标准限度的修改，要说明理由并列表说明当时产品的检验数据，以及与国外药典相应项目的比较。对于不修订的部分，要写出综合材料说明不修订的理由。

D其他值得强调的是，起草说明屮应阐明曾经做过的有关实验，包括不成熟的、尚待完善的或失败的，暂未或不能收载于正文的检定方法的理由，并提供相关的实验资料，以便有关部门审査其实验设计是否合理，以确定为主观或客观原因，从而判定是否需要做进一步的实验。

起草说明的书写格式应按质量标准项目依次予以说明，与其研究报告不同，不能以综述性讨论代替。

13、写出4G的英文简称、中英文全称，并说明其具体含义。

①GLP：良好药品实验研究规范（Good LabonUory Practices）

含义：该规范从各个方而明确规定了如何严格控制药物研制的质量，以确保实验研究的质量与实验数据的准确可靠。

②GMP：良好药品生产规范（药品生产质虽管理规范）（Good Manufacturing Practices）含义：是药品生产和质量管理的基本准则。

③GCP：良好药品临床试验规范（GoodClinical Practices）

含义：保证药品临床试验资料的科学性、可靠性和重现性。木规范主要起两个作用：保护志愿受试者和病人的安全和权力；有助于生产厂家申请临床试验和销售许可吋能够提供有价值的临床资料。

@GSP：良好药品供应规范（Good Supply Practices）

含义：要求药品供应部门保证药品在运输、贮存和销售过程中的质量和效力，以保护消费者合法权益。

14、分子烙印技术

分子烙卬技术(Moleculeim printing technology,MIT),又口」称为分子卬迹技术，是近年来迅速发展起来的一项新型技术，利川具有分子识别能力的分子烙卬聚合物(Moleculeim printing polymer , MIP)來分离、筛选、纯化化合物的一种仿生技术.M1P的制备方法是以目标烙印分子为模板,选用能与目标烙印分子产生特定相互作用的功能性单体，在烙印分子周围与交联剂进行聚合,形成三维交联的聚合物网络.通过萃取除去烙卬分子,在聚合物网络中形成形态和化学功能团与烙印分子互补的孔穴，其对烙印分子具有特殊的亲合性.

MIT坟大的特点就是对模板分子的识别具有可预见性，对于特定物质的分离极具针对性. 具有抗恶劣坏境能力强、稳定性好、使用寿命长等优点.分子烙印技术H益受到关注，得到了蓬勃

的发展，已被应用于手性拆分、仿牛传感器、固相萃取、抗体模拟、酶样催化剂以及控释药物等领域的研究.

MIT要经过3个步骤:(1)功能单体和模板分子在一-定条件下通过共价或非共价作川形成可逆复合物;(2)加入交联剂将这种复合物通过交联聚合反应固化，制得高聚物;(3)将模板分子除去，形成的聚合物即分子烙卬聚合物(MIP),MIP依靠分子形状、大小及官能团进行选择性的分子识别。按照单体与模板分子结合方式的不同,MIT可分为共价型(预组装型)、非共价型(自组装型)及半共价型(牺牲空间法)。MIP具有构效预定性、特异识别性、广泛实用性三大特点, 此外还具有抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长等优点。这些特点使其在临床药物分析、手性物质的分离等许多领域得到应用。

15、中药指纹图谱

中药含有的活性成分是中药药效的物质棊础，任何一种活性成分均不能体现出中医临床用药的整体疗效。若以个别活性成分的含量作为中药的质量控制指标，而忽略中药的其他成分的作用，则难以确保中药及其制剂的质量。中药指纹图谱是一种多指标的质量控制模式，虽然它不能代替含量测定，但它比测定任何单一成分所提供的信息却丰富得多，可以比较全而的反映所含化学成分的种类和数量，能够更加有效地体现出中药成分的整体性和综合作川，从而更好地评价中药及其制剂的质量。

屮药指纹图谱就是借川了法医学“指纹鉴定”的概念，是指中药经过适当处理后，采川一定的分析手段，得到的能够标示该中药特性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。屮药指纹图谱作为-?种综合的、宏观的、可量化的鉴别手段，能全而的反映中药所含成分的相对关系，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一?致性的质量控制模式。整体性和模糊性是它的基木属性。指纹图谱应该反映药材的完整而貌即整体性，但是由于植物药中化学成分天然潜在的不稳定性，所以指纹图谱乂具有模糊性。

中药指纹图谱的构建方法：中药指纹图谱的测定方法种类较多，主要采用色谱法分离特征成分，采用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、核磁共振波谱(NMR)、质谱(MS)等光谱、波谱方法鉴定化合物的结构，现阶段用于构建中药指纹图谱的色谱法主要有:薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、高效毛细管电泳(HPCE)、高速逆流色谱(HSCCC),其中又以HPLC 法分离效率高、分析速度快、样品适应性广、检测器种类多、灵敏度高、稳定性强、重复性好而倍受推崇，成为中药指纹图谱的首选方法。

16、高效毛细管电泳

毛细管区带电泳、胶朿电动毛细管色谱、毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管电色谱、阵列毛细管电泳。

17、液相色谱■质谱联用的原理和应用

原理：液质联用（HLPC-MS）又叫液相色谱■质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。LC-MS技术的优点：适用范围广、检测灵敬度高、提供结构信息、高样品通量。

LC-MS技术的应用：在中药成分分析中的应用、药物代谢产物鉴定、药物动力学研究。与气质联用相比的优点：

HLPC-MS除了可以分析气相色谱■质谱（GC-MS）所不能分析的强极性、难挥发、热不稳定性

的化合物之外，还具有以下儿个方面的优点：

①分析范围广，MS儿乎可以检测所仃的化合物，比较容易地解决了分析热不稳定化介物的难题;

②分离能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离开，但通过MS的特征离子质量色谱图也能分别给出它们各自的色谱图來进行定性定量；

③定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息；

④检测限低，MS具备高灵敏度，通过选择离子检测（SIM）方式，其检测能力还可以捉高一个数量级以上；

⑤分析时间快，HPLC-MS使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析时间，提高了分离效果;

⑥自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。

LC/MS

常用接口技术有：热喷雾接口、传送帯接口直接液体导入技术。

离子化方式：大气压化学电离离子化、离子蒸发离子化

离子的分离系统：

①磁场型质量分离器：

②飞行时间质量分离器：离子被加速电场加速后，在忽略初始动能的前提，可以认为离子获得的动能相同。故不同质量的离子飞行时间不同，质量大的离子飞行速度慢，到达检测器时间晚。

③四级杆质量分离器：四级杆质量分离器是由四根两两相对的电极组成的，在四根两两相对的电极上分别施加变化的直流电压和高频交流电场，在二者的相互作用下，山加速电压加速发射出的离子，在四极杆中产生特定的震荡轨道。在一定的直流电压和高频交变电场的作用下，只有某一特定的离子才会通过四极杆，被检测到。

④离子阱分离器：和四极杆的原理非常相似，不同的是和谐的留在离子阱中，不和谐的振荡则脱离离子阱被检测到。

接口技术：

电喷雾接口ESI

电喷雾接口是将LC的流出物在大气压条件下电离，然后再将电离物送入高真空的质质谱。

ESI接口包括三个基本过程：电喷雾，离子形成和离子输送。

大气压化学电离接口APCI

APC1是将化学电离的原理延伸到人气压卜进行，与ESI同属人气压电离范畴。

粒子束接口PB

主要根据流体力学原理，将溶质转变成中性粒子,利用动量差与溶剂分开后送入质谱电离。包括：形成气溶胶，脱溶胶和动量分离。主要川于分析非极性和屮等极性的化合物。

热喷雾接口TS 是一种软电离技术，许多极性化合物和热不稳定化合物在TS接口中直接蒸发，或受大量溶剂保护，可以完整的离子形式进入气态，得到分子离子峰，准分子离子峰或分子加成物峰, 由此得到准确分子量。

移动带接口MB

对高沸点和遇热易分解的化合物分析有一定用途。优点能使用EI电离源电离。

18、手性拆分

①结晶法拆分

结晶法拆分包括直接结晶法拆分和非对映异构体拆分，分别适用于外消旋混合物和外消旋化合物的拆分。。在一种外消旋混合物的过饱和溶液中,立接加入某一对映体的晶种，即可得到一定量的该对映体,这种直接结晶的拆分方法仅适川于外消旋混合物，其应川儿率不到10%。

②动态动力学拆分

经典的动力学拆分与底物消旋化相结合的方法即为动态动力学拆分，经典动力学拆分的缺点是最大理论产率仅为50%,而动态动力学拆分的理论产率可以达到100%o底物消旋化有化学法消旋和酶法消旋，酶法较化学法副反应少、产率高、条件温和，而且无毒、易降解, 具有环境友好性，因此更适合工业化生产。

③色谱分离法拆分：

④膜拆分：本质是实现对两种对映异构体的选择性转运,依据贰转运方式可分为手性液膜拆分和手性固膜拆分两类。手性液膜拆分的机理是将具有手性识别功能的物质溶解在一定溶剂中制成有机相液膜，以膜两侧浓度弟为动力，外消旋体有选择地从高浓相向低浓相迁移,由丁液膜对两种异构体的选择性差异使二者迁移速率不同，即迁移较快的一种异构体在低浓相中得到富集，从而达到手性分离目的。固膜拆分则利用膜内外白身的手性位点对两种异构体亲和力的差异，在压力差、浓度差或电势差等推动力下造成两种异构体的选择性通过，进而实现拆分的忖的。根据手性拆分的耍求，所用的拆分膜应具有较高的对映休选择性、较大的膜通量、且选择性及通量应稳定。

⑤萃取拆分：与传统的萃取分离不同，萃取拆分技术要求互相接触的两种液相中至少有一种具有旋光性。从理论上讲，只要两个对映异构体的分离因数大于1,在足够多的级数下,即可实现拆分。口前至少存在配位萃取拆分体系、亲和萃取拆分体系以及形成非对映体异构体萃取拆分体系等3种萃取拆分体系。

⑥旋转带蒸懾技术是一种分离能力较强的新型蒸懾技术,通过选择旋转带蒸饰塔中的电机转速和加热套温度，进而控制采样速度，经过数次重复蒸饰、富集、再蒸帑來达到分离目的。

19、高速逆流色谱

高速逆流色谱的分离基础是流体动力学平衡。山于螺旋管柱的行星式运动产生了一个在强度和方向上变化的离心力场，使在螺旋柱屮互不相溶的两相不断混合从而达到稳定的流体动力学平衡。两相溶剂的流体动力学分布如图2所示。靠近中心轴的将近1/4的区域是两相混合区，在此处两相发牛剧烈的混合。在其余的区域，两相分离成两层，重相占据螺旋管的每一段的外部，轻相占据每一段的内部，并且两相沿螺旋管形成一个淸晰的线性界曲。混合和倾析区域交替出现在螺旋管中，并且两相液体在螺旋管中总是处于接触状态，没有死体积的存在。所以町以根据所用体系液体的流动趙势选用合适的模式，使得其中一相作为固定相保留在螺旋管中，另一相作为流动相带着样品在螺旋管内穿过固定相相，在此过程中使样品在两相屮不断混合和分配，从而根据样品在两相屮分配系数的不同达到样品Z间相互分离的目的。

高速逆流色谱的特点

HSCCC作为一种常用的分离纯化技术，具有以下优点：（1）无不可逆吸附。聚四氟乙烯管屮的固定相不需要载体，可以消除固■液色谱屮因使川载体而带来的吸附现象，避免样品在分离过程对能存在的变性，适用于分离极性物质和牛物活性物质；（2）回收率高。由于液休作为流动相和固定相，滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱方式予以完全回收, 能够同时完成分离纯化与制备，适于制备性分离；（3）操作简单快捷。因其固定相为液体，体系更换与平衡较常规方法方便、快捷；（4）进样量大。与HPLC相比，HSCCC 进样量最多可达到克级水平，是HPLC的数白倍。（5）分离效率高。与常压、低压色谱相比，HSCCC的分离能力强，有些样晶经一次分离即得到1个其至多个化合物，并且分离时间短，纯度高。

高速逆流色谱的影响因素：山于髙速逆流色谱是无需任何周态载体支撐的液-液色谱，其中作为固定相的液体在色谱柱中的保留程度对丁?高速逆流色谱的分离过程是I?分重要的。旨先，所选择的溶剂体系对固定相保留率有很大的影响，如两相密度差、粘度、界面张力等。通过研究表明，两相的密度差对固定相保留率的影响最大，固定相保留率和密度差基木呈线性关系。其

次，还存在一些人为可以操控的条件会对固定相保留率产生影响，如高速逆流色谱的转速、流速、以及柱温等。其中，螺旋管柱的转速以及它产生的离心力场对两相的混合程度具有决定性的影响。因此，对于界面张力较高的溶剂系统，应使用较高的转速，以使两相之间能够剧烈的混合，从而促进分配和减少质点传递的阻力。对于界面张力较低的溶剂系统，应使用较低的转速，以避免过分混合引起的乳化作用，以及固定相流失的问题。在流动相流速方血，杜琪珍等总结得出固定相保留率和流速平方根Z间的线性关系。国外学者也发现了类似的流动相线性速度的平方和固定相保留率之I'可的线性关系。仪器的柱温对固定相的保留同样也有着不可忽视的作川，其温度对于亲水性强的正丁醇溶剂体系的固定相保留率影响较大，Ito等通过研究发现升温能改变溶剂的粘度，进而影响两相的分层时间。在50°C?60°C时，正丁醇体系的分层时间最短，在该温度下可以改善固定相的保留率。然而，对于大部分的疏水性溶剂体系，山于两相分层快，柱温升髙后两相分层时间缩短不明显，因而对改善保留率的效果不明显。

20、离子液体

定义:简言Z离子液体即完全山止负离子组成的室温下为液体的盐，由于阴阳离子数1=1相等, 因而整体上显电中性。体积差异较大、对称性均比较低，阴阳离子之间的静电势低，熔点低。阴阳离子之间存在较强的相互作川，儿乎无蒸气压，化工过程屮替代易挥发易燃而造成环境污染和安全事故有机溶剂成为可能。

优点：

对有机物、无机物都有良好的溶解性，使许多化学反应得以在均相中完成，且反应器体积大为减小。

具有结构可调控性:溶解性、液体状态范圉取决于阴、阳离子及其取代基的构成和配对, 可根据需要，定向设计离子液体体系。

离子液体作为电解质具有较大的电化学窗口、良好的导电性、热稳定性和极好的抗氧化性。

应用：

在有机合成中的应用，在催化中的应用，在分离、分析及纯化中的应用（萃取分离中的应川、在色谱分析中的应用、亦液膜体系中的应用），在电化学中的应川。

离子液体在色谱分析中得到应川主要是由于其具有以下的一些特殊性质：

熔点较低，液态温度区间大、较低的蒸气压、极性范围大、良好的电导率和较高的离子迁移率、表而张力大、溶解性能好、稳定性好。

离子液体在色谱分析中的应用主要分为：离子液体在气相色谱中的应用、离子液体在高效液相色谱中的应用、离子液体在毛细管电泳中的应用

21、ELISA

ELISA是一种免疫测定(immunoassay, IA)。

某础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：

(1)固相的抗原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent)；

(2)酶标记的抗原或抗体，称为”结合物” (conjugate)；

(3)酶反应的底物。

可设计出各种不同类型的检测方法。

抗原抗体反应

①可逆性：抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：

Ag+Ab—Ag ? Ab

抗体的亲和力(affinity),可以用平衡常数K表示：K=[Ag ? Ab] / [Ag][Ab] ,Ag ? Ab 的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。

②特异性：抗丿京抗体的结合发牛在抗原的决定簇与抗体的结合位点Z间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。| A 某一特定的物质，而不需先分离待检物。

③最适比例

The precipitin reaction

④敏感性：酶反应测定法的敏感度约为5-lOng/ml,免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与臨反应法相仿，标记的免疫敏感度可提高数T倍，达ng/ml水平