分子诊断试验的方法学验证

CONTENTS
• SUMMARY OF CHANGES • UNDERSTANDING THE 2010 CAP ACCREDITATION CHECKLIST COMPONENTS • HOW TO INSPECT USING R.O.A.D INSPECTION TECHNIQUE • ADDITIONAL INFORMATION • APPLICABILITY • PROFICIENCY TESTING • QUALITY MANAGEMENT AND QUALITY CONTROL
• CAP提出了明确的要求：“实验室必须进行分析验证各项检测的性能参数”， 还对验证试验覆盖的标本范围（如不同的基因型等）、标本类型（如血液、 尿液、新鲜/冷冻百度文库织、石蜡包埋组织等）、验证的参数（如参考值、报告范 围、准确度、分析灵敏度、分析特异性和精确度等）做了相应的规定。
[5]Guzel O, Guner EI. ISO 15189 accreditation: Requirements for quality and competence of medical laboratories, experience of a laboratory I. Clin Biochem,2009,42: 274-278. [6]Yanikkaya-Demirel G. ISO 15189 accreditation: Requirements for quality and competence of medical laboratories, experience of a laboratory II. Clin Biochem,2009,42: 279-283. [7]Jennings L, Van DV, Gulley ML. Recommended principles and practices for validating clinical molecular pathology tests. Arch Pathol Lab Med,2009,133: 743755.
available for comparison. They are significantly more expensive to perform than 510(k) trials.
Verification/确证试验
• 使用范围：主要用于体外诊断（in vitro diagnostics，IVDs） 项目，指已经商业化生产，并已经通过美国FDA 510(k) clearance 或approval过程的分子诊断项目。
• 主要包括：临床敏感性（clinical sensitivity）和临床特异性（clinical specificity) 。
• 临床敏感性不同于分析敏感性：分析敏感性主要指参考方法检测结果为 阳性的结果中，用实验方法得到阳性结果的一致性（对定性试验来 说）；临床敏感性主要指结果为真阳性的人群中真正罹患某种疾病或异 常的比例，强调实验结果与临床诊断的一致性。
临床分子诊断 方法学验证要求
关明 复旦大学附属华山医院检验医学科
分子诊断面临的挑战
• 涉及方法较多，如PCR、荧光定量PCR、测序等； • 实验步骤较多，包括标本的分离保存、处理、检测； • 手工程度较高，自动化程度普遍偏低，较多依赖手工，
不同的实验室条件和操作者等因素对实验结果的影响较 大； • 尚未建立公认的质量管理标准等； • 更高的准确性要求； • 结果报告缺乏标准化； • ……
Extraction Amplification Restriction Endonucleases Sequencing Detection Methods
Agarose and Polyacrylamide Gel Electrophoresis Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Arrays
方法学验证的要求的修正和改进
“verification”和“validation”
• “确证试验-verification” • “验证试验-validation”
IVDs. And LDTs.
• In vitro diagnostics (IVDs):商业化生产；通过FDA 510(k) clearance or PMA (premarket approval)。
不同认可体系对方法学验证的要求
• 差异: CAP的“方法学验证（assay validation）”和ISO15189中的“诊断性验证（ diagnostic validation）”
• 共同点：新的检测方法应用到病人临床诊断之前必须进行方法学验证，以了 解该检测的临床表现，保证实验结果可信度[5-7]。
CONTENTS
• SUMMARY OF CHANGES • UNDERSTANDING THE 2010 CAP ACCREDITATION CHECKLIST COMPONENTS • HOW TO INSPECT USING R.O.A.D INSPECTION TECHNIQUE • ADDITIONAL INFORMATION • APPLICABILITY • PROFICIENCY TESTING • QUALITY MANAGEMENT AND QUALITY CONTROL
• FDA cleared: In vitro diagnostics that have gone through and passed a 510(k) trial. • FDA approved: An IVD that has gone through and passed a PMA trial. • 510(k) trials are designed to show that an IVD is substantially equivalent to a legally marketed
• 某些罕见的疾病，由于阳性病例的数量有限，实验室进行临床敏感性评 价存有一定难度，这时可以引用文献报道的临床敏感性和特异性作为理 论支撑。
• 临床特异性：正常对照容易收集，故容易实现。
实施具体路径指南？
• CAP还是ISO15189都没有提供医学分子诊断验证试验的 具体细节 。
• 临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）的EP文件就对实验室的分子 诊断的方法学验证做出了说明 。
• 临床特异性也不同于分析特异性：分析特异性主要指参考方法检测结果 为阴性的结果中，用实验方法得到阴性结果的一致性（对定性试验来 说）；临床特异性主要指实验结果为阴性的人群中真正没有罹患某种疾 病或异常的比例，也强调实验结果与临床诊断的一致性。如果是定量实 验，则分析敏感性的定义接近于最低检测浓度的概念。
POST ANALYSIS Results Reporting Records
PARENTAGE AND FORENSIC IDENTITY TESTING IN SITU HYBRIDIZATION (ISH)
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) Brightfield In Situ Hybridization PERSONNEL PHYSICAL FACILITIES AND EQUIPMENT INSTRUMENTS Spectrophotometers Signal Detection Instruments Film Processing/Photographic Equipment Electrophoresis Equipment and Power Supplies Pipettes Thermometers and Temperature-Dependent Equipment Space • LABORATORY SAFETY RADIATION SAFETY
GENERAL ISSUES PROCEDURE MANUAL ASSAY VALIDATION REQUISITIONS SPECIMEN HANDLING SPECIMEN PROCESSING QUANTITATIVE ASSAYS: CALIBRATION AND STANDARD REAGENTS CONTROLS ANALYSIS
方法学验证的要求的修正和改进
• ISO15189目前的版本是ISO技术 委员会ISO/TC212 (临床实验室检 验及体外诊断实验系统)标准，新 版本会对方法学验证提出更多、 更高的要求。
• 实验室自建的方法的验证；
经过验证的方法在超出原验证范围之外 经过验证的方法被修改 即使是生产商已经验证的方法，实验室 也必须重新验证 或者确证试验的分析特 性
predicate device. 510(k) trials are less involved and less expensive than PMA trials. • Premarket approval trials are required for class III medical devices or if there is no predicate device
Extraction Amplification Restriction Endonucleases Sequencing Detection Methods
Agarose and Polyacrylamide Gel Electrophoresis Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Arrays
• 与确诊试验相比相对复杂
PARR+AS+AS (precision, accuracy, reportable range, reference range, analytic
sensitivity, and analytic specificity) 其他涉及的重要的评价指标
Clinical validity/临床验证
• 使用范围：LDTs, and modified FDA-cleared/approved tests
• 主要目的：验证本试验在临床使用的各项性能指标及其实际效果
• 主要指标： 准确性、精确性、参考范围和可以接受范围（与确证实验要求相同） 分析敏感性、分析特异性（验证试验要求） 其他涉及的重要的评价指标（标本稳定性、干扰物质、线性……） （验证试验要求）
GENERAL ISSUES PROCEDURE MANUAL ASSAY VALIDATION REQUISITIONS SPECIMEN HANDLING SPECIMEN PROCESSING QUANTITATIVE ASSAYS: CALIBRATION AND STANDARD REAGENTS CONTROLS ANALYSIS
• 主要目的：确证厂家提供的数据在本实验室的的实际效果 • 主要指标：准确性、精确性、参考范围和可报告范围
（这些指标通常在厂商的说明书中提及）。
PARR (precision, accuracy, reportable range, and reference range).
Validation/验证试验
• Laboratory-developed tests (LDTs): 许多新的分子诊断实验局限于 实验室内使用（科研开展）。
• Many of these clinically important LDTs are unlikely to ever become FDA cleared or approved because low test volumes make it economically unfeasible to go through the current FDA 510(k) or PMA approval process.