免疫PCR技术研究进展及临床应用

３９４·　医学实践杂志　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｃｉ　竺　生筮Ｚ鲞箜　表５返魂草提取物对小鼠光热法的镇痛作用　（ｘ±ｓ）　

注：与空白对照组比较．　Ｐ＜０．０５；一Ｐ＜０．Ｏ１；…Ｐ＜０．００１　４讨论与结论　抗炎试验结果表明：返魂草提取物各剂量组对　二甲苯致小鼠耳肿胀、对１％角叉菜胶致大鼠足趾　肿胀均有明显的抑制作用，各剂量组返魂草提取物　对大鼠棉球肉芽肿有明显的抑制作用，且作用强度　与剂量呈一定的依赖性；解热试验结果表明：返魂草　提取物各剂量组对内毒素致家兔体温升高、对啤酒　酵母致大鼠发热均有显著的抑制作用，作用强度与　剂量呈一定的相关性；镇痛试验结果表明：返魂草提　取物各剂量组均具有显著提高小鼠热板法、小鼠光　热辐射法疼痛反应的阈值，镇痛作用确实，作用呈量　效关系。　综上所述，返魂草提取物具有显著地解热、抗　炎、镇痛作用，具有较好的应用前景。　（编辑：汪洋）　

综　述·　免疫ＰＣＲ技术研究进展及临床应用　郑姬，府伟灵，蒋天伦　【中图分类号】Ｒ４４６．６２　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６８４一Ｚ０３０（Ｚ００Ｓ）０Ｓ一０３９４—０５　免疫标记检测技术发展至今，已相继应用了多　种标记物，如酶、放射性同位素、荧光素等，这些标记　物的使用，极大地扩大了待测物的范围并提高了免　疫分析技术的检测极限，但就灵敏度而言，利用这些　标记建立的免疫学检测技术在某些方面，如极微量　循环抗原（如肿瘤相关抗原、细胞因子等）的检测尚　不能满足医学研究和ｌ临床检测的需要，所以提高免　疫分析技术的灵敏度一直是这一领域的主要研究目　标。１９８５年，诞生了聚合酶链反应技术（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ），该技术具有强大的放大能力，　能在短时间内将目的ＤＮＡ放大上百万倍，并且具有　作者单位：４０００３８重庆，第三军医大学西南医院检验科　操作简单、快速、特异、可自动化等特点，引起了分子　生物学及医学检验学的一场革命。但是ＰＣＲ技术　是一种基因检测技术，应用范围仅限于ＤＮＡ或　ＲＮＡ。由于ＰＣＲ技术对目的ＤＮＡ强大的扩增能　力，如能将ＤＮＡ标记在抗体上，再利用ＰＣＲ技术将　信号放大，将会得到灵敏度更高的全新的标记免疫　分析技术。１９９１年Ｓａｎｏ等…利用链亲和素一蛋白　Ａ嵌合体蛋白作为连接分子将ＤＮＡ与抗体接合起　来。后来，他们利用上述嵌合体蛋白将免疫反应和　ＰＣＲ扩增连接起来，建立了灵敏度相当高的免疫　ＰＣＲ技术　。从那以后，有很多学者对这一技术进　行了研究。　

维普资讯 http://www.cqvip.com 华医学实践杂志　ｃｂｉ　星　』　皇　！皇旦！　曼　璺　生箜Ｚ鲞笙　１免疫ＰＣＲ的基本原理　免疫ＰＣＲ技术的基本原理及实施与常规的标　记免疫技术相类似，只是标记物不同。常规的标记　免疫分析技术以酶、荧光素、放射性同位素等标记抗　体，而免疫ＰＣＲ技术则利用ＤＮＡ标记抗体，利用　ＰＣＲ技术可高效扩增ＤＮＡ片段的特点，从而将检测　灵敏度大大提高。具体来说，就是利用一个对ＤＮＡ　和特异性抗体具有双重结合特性的连接分子，使作　为标记物的ＤＮＡ特异地结合到抗原抗体复合物上，　从而形成抗原一抗体一ＤＮＡ复合物，再以ＰＣＲ技术　对标记ＤＮＡ进行扩增，根据产物的存在与否及量的　多少对待测抗原进行定性或定量测定。　２免疫ＰＣＲ的方法学类型　２．１原位免疫ＰＣＲ（ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｉｍｍｕｎｏ—ＰＣＲ）是一　种原位检测组织或细胞中抗原的技术。待检石蜡切　片上的非特异性结合位点经过充分封闭，内源性　ＤＮＡ和ＲＮＡ经核酸酶充分消化后，通过生物素化　单抗与亲和素系统的桥联，将生物素化的ＤＮＡ报告　分子固定在石蜡切片上，进行原位ＰＣＲ扩增，扩增　产物经原位核酸杂交，以杂交信号指示待测抗原是　否存在。Ｃａｏ等ｌ３　用原位免疫ＰＣＲ检测肝石蜡切　片上的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ），其敏感性较免疫组　化法显著提高。　２．２细胞免疫ＰＣＲ（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｏ—ＰＣＲ）　通常　用来检测细胞表面膜抗原。Ｚｈａｎｇ等　用此法成功　的检测了白血病病人血清中转移癌细胞上的肿瘤抗　原ＧＭ３。首先用抗ＧＭ３单抗制备单抗一亲和素一　生物素化复合体，然后分离病人外周血淋巴细胞，充　分洗涤封闭后，与单抗ＤＮＡ复合体共育，洗涤后抽　提细胞总ＤＮＡ，利用ＤＮＡ报告分子的特异性引物　进行ＰＣＲ扩增，扩增产物经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ显示结果，　病人外周血淋巴细胞可扩增出３００ｂｐ的特异性条　带，正常人无。　２．３多分析物免疫ＰＣＲ利用大小不同的ＤＮＡ分　子标记不同的抗体，可同时检测多种抗原。Ｊｏｅｒｇｅｒ　等　用９９个碱基的ＤＮＡ分子标记ｈＣＧ抗体，用８８　个碱基的ＤＮＡ分子标记ｈＴＳＨ抗体，同时检测　ｈＣＧ、ｈＴＳＨ两个分析物，两个ＤＮＡ报告分子共用一　对引物，但ＰＣＲ产物的分子量不同，从而使两个抗　原得以鉴别。　２．４单引物免疫ＰＣＲ即ＤＮＡ报告分子的两侧翼　含有相同的引物序列，可用单引物进行ＰＣＲ扩增。　３９５·　该法可提高ＰＣＲ扩增效率，且适合于多分析物免疫　ＰＣＲ［　２．５双相免疫ＰＣＲ双相免疫ＰＣＲ就是既检测病　原体抗原又检测病原体基因的免疫ＰＣＲ，其原理就　是一对用于扩增某病原体基因的引物，被人工加在　标记抗体的ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ的两端，使二者共用一对引　物，但产物分子量大小不同，达到免疫ＰＣＲ在检测　抗原的同时，又检测了目的基因。　２．６　Ｉｍｍｕｎｏ—ＲＣＡ在Ｉｍｍｕｎｏ—ＲＣＡ中，一段寡　核苷酸引物共价结合于抗体上，加入环状ＤＮＡ、　ＤＮＡ聚合酶和核苷，扩增的产物是一段长链的ＤＮＡ　分子，包括很多被复制的环状ＤＮＡ，扩增的ＤＮＡ可　以用很多方法检测，包括直接结合半抗原标记的或　荧光标记的核苷、用荧光标记的或酶标记的互补寡　核苷酸探针杂交。当标本抗原的浓度低于ｆｍｏｌ水　平时，特异性结合的抗体就能被离散的荧光信号检　测出。Ｉｍｍｕｎｏ—ＲＣＡ集高敏感性和宽的动态学范　围于一身，具有空前的检测单细胞的能力。如果对　不同的抗体分别标记上一种寡核苷酸引物，这种抗　原检测方法就可以进行多元的免疫分析　Ｊ。　２．７磁性免疫ＰＣＲ分析（ＭＩＰＡ）Ｍｏｎｔｅｉｒｏ等　将　磁珠技术与免疫ＰＣＲ技术相结合，设计了一种能检　测粪便中幽门螺杆菌的新方法。兔抗幽门螺杆菌免　疫球蛋白包被磁珠，从而分离出粪便悬液中的幽门　螺杆菌，通过磁力的作用将磁珠上的幽门螺杆菌和　粪便悬液中的杂质分离，抽提附着在磁珠上的幽门　螺杆菌的ＤＮＡ，其中的ＰＣＲ反应抑制物通过琼脂糖　包埋ＤＮＡ法去除后作为模板进行ＰＣＲ扩增。磁珠　免疫ＰＣＲ技术有效地去除了ＰＣＲ反应的抑制物，　保证了ＰＣＲ扩增的有效性和可靠性。因此，磁珠免　疫ＰＣＲ技术特别适宜于检测粪便、胆汁和痰液等排　泄物和分泌物中的致病微生物。　２．８　Ｔ，ＲＮＡ聚合酶扩增的免疫检测技术（ＩＤＡＴ）　Ｚｈａｎｇ等　用一种特异性抗体与含有Ｔ　启动子　的双链寡核苷酸结合，利用同位素标记的底物和Ｔ，　ＲＮＡ聚合酶扩增寡核苷酸，生成一定分子量大小的　ＲＮＡ转录物，经电泳后分析结果。该方法避免了以　往免疫ＰＣＲ技术中温度的变化。此外，和双链寡核　苷酸结合的抗体分子还可以是单链可变区（ＳｃＦｖ）　或互补决定区。该方法的敏感性是传统ＥＬＩＳＡ的　ｌ０　倍。但由于ＲＮＡ操作时需要特别关注ＲＮＡ的　降解问题，而且技术流程复杂，无法进行临床推广。　

维普资讯 http://www.cqvip.com ３９６·　华医学实　盎壶　』　皇　！　三　生箜　鲞箜　３免疫ＰＣＲ系统的组成　免疫ＰＣＲ系统通常由四个子系统组成，即抗原　抗体反应的载体系统、桥联系统、指示系统和检测　系统。　３．１载体系统作为免疫ＰＣＲ的载体主要有微滴　孔板、ＰＣＲ反应管、酶标软板、免疫磁珠４种。微滴　孔板和酶标软板优缺点相同，在免疫反应这一环节　比较方便，尤其是洗板次数多的，可同时操作，但在　ＰＣＲ扩增中需加入较多的石蜡以防反应液挥发，且　电泳加样时，这两种载体是平底的，反应物不多，又　覆盖较多石蜡，在吸样中造成误差。ＰＣＲ反应管在　免疫反应这一环节显得比较麻烦，尤其是洗板时需　分别操作，费时费力，但在ＰＣＲ扩增中则显示出优　越性，薄壁ＰＣＲ反应管使用的进口ＰＣＲ仪有盖，不　必加石蜡，普通的ＰＣＲ反应管使用普通的ＰＣＲ仪，　只需加入少量石蜡，在电泳加样时，ＰＣＲ反应管是　尖底的，减少了吸样时造成的误差。采用酶标软板　进行免疫反应后，加ＰＣＲ反应液经变性将反应液移　人ＰＣＲ反应管中扩增，这种方法结合了上述两种载　体的优点，但在移液这一环节增添了反应的误差。　免疫磁珠作为载体优点很多，如灵敏度高、特异性　强、重复性好，但是需要特殊的仪器设备，因而不易　推广。在上述４种载体中，如有配套ＰＣＲ扩增仪，　选用微滴孔板为好。如果想推广应用则采用可剪的　酶标软板为宜，该载体价廉易得，有ＰＣＲ扩增仪的　实验室均可开展免疫ＰＣＲ技术。　３．２桥联系统桥联系统是指连接指示系统即报　告ＤＮＡ分子和抗原抗体复合物之间的连接分子。　目前应用的桥联系统主要有：（１）链亲和素化抗体／　蛋白Ａ一生物素化ＤＮＡ系统：Ｓａｎｏ等用链亲和素／　蛋白Ａ基因工程融合蛋白作为连接分子来连接生　物素标记的ＤＮＡ与抗体，此种融合蛋白的链亲和素　部分可识别ＤＮＡ上的生物素，蛋白部分可识别抗体　的Ｆｃ段。但Ｒｕｚｉｃｋａ等　认为蛋白Ａ不但可以结　合特异性抗体的ＩｇＧ，而且还可以与样品中吸附于　固相的无关ＩｇＧ结合，从而降低了反应的特异性，而　且链亲和素／蛋白Ａ融合蛋白没有商品化，不易进　行推广。（２）生物素化抗体一亲和素一生物素化　ＤＮＡ系统：国内外更多的研究人员使用亲和素系统　来连接ＤＮＡ与抗体。这种桥联系统是由Ｒｕｚｉｃｋａ　等率先引入免疫ＰＣＲ技术的。其基本方法是先将　亲和素和生物素化的ＤＮＡ预结合成复合物，然后与　结合固相的生物素化的特异性抗体结合。但是１个　亲和素分子可以结合４个生物素分子，因此亲和素　和生物素化的ＤＮＡ预结合成复合物是高度不均一　哟，从而降低了准确性和可重复性。大多数学者采　用分别加入生物素化抗体、游离亲和素和生物素化　ＤＮＡ分子的方法克服了以上缺点，但延长了检测周　期，使检测步骤繁琐，增加了系统误差。（３）抗体一　叶绿素一ＤＮＡ系统：利用自然界广泛存在的叶绿素　作为连接分子进行抗体与ＤＮＡ的交联。这种方法　具有较好的稳定性，且成本低，但该法叶绿素的提取　和纯化及除交联外的其他过程均需在黑暗处进行，　而交联却需在特定光下进行，故实际操作中很不方　便。（４）抗体一ＤＮＡ系统：还有一些学者用化学交　联剂直接将ＤＮＡ与抗体连接起来。使用的交联剂　有聚乙烯亚胺和碳化二亚胺等一些双功能交联剂。　还有人用２一亚氨基生物素做配基的琼脂糖珠亲和　层析法制备ＡＢＤ复合物，克服了以上不足。　３．３指示系统指示系统即报告分子是免疫ＰＣＲ　中所采用的标记ＤＮＡ分子。理论上任何一段序列　已知、可有效扩增的ＤＮＡ片断都可作为免疫ＰＣＲ　的报告分子，但考虑到ＤＮＡ序列的同源性和用于　ＰＣＲ扩增的效率问题，该报告分子和ＰＣＲ扩增系统　必须保证有良好的扩增效果，有近似理论的扩增率，　该报告分子与反应体系中可能存在的ＤＮＡ分子不　应有同源性，以避免因ＤＮＡ污染，而出现非特异性　扩增。继Ｓａｎｏ用ＰＵＣ１９质粒后，国内外学者先后　用ＰＩＮＭ３０、入噬菌体、舌兰病毒等作为报告分子，都　取得了良好的效果。实际应用中可按以下原则对报　告ＤＮＡ分子进行选择：（１）ＤＮＡ分子具有较高的纯　度，均一性好，为满足后续工作的需要，应具有合理　的碱基分布（如Ｇ＋Ｃ含量达４０％～６０％；不具有多　个连续的相同碱基等）；（２）易于扩增，引物容易设　计，退火温度适中；（３）指示分子和待检样品中可能　存在的ＤＮＡ分子不具有同源性。因此，在选择指示　系统时可以参照实验室的传统和指示系统的选取原　则来选择。　３．４检测系统与定量技术免疫ＰＣＲ常见的检测　系统有：（１）电泳法：免疫ＰＣＲ的结果一般可以通过　凝胶电泳、ＥＢ染色来检测并定量分析，也有的是在　凝胶电泳后用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交来检测ＰＣＲ产物。其　特点是在大多数实验室均可以实施，但不能实现实　时报告检测结果。（２）放射自显影法：Ｓａｎｎａ等¨¨