优良酵母菌株的分离和筛选
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化酵母菌的分离与纯化⼩组组员: ⼀、实验⽬的1.学习分离纯化酵母菌的技术与⽅法2.了解培养基的配置与灭菌技术3.增强⽆菌操作技术的意识⼆、基本原理从混杂的微⽣物群体获得只含某⼀种某⼀株微⽣物的过程叫做微⽣物分离与纯化，酵母菌常见于含糖份⽐较⾼的环境中，如果园⼟、菜园⼟及果⽪等的表⾯。
多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌⽣长迅速，容易分离培养。
马丁⽒培养基是⼀种⽤来分离真菌的选择性培养基。
此培养基是由葡萄糖、蛋⽩胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红(玫瑰红，Rose Bengal)和链霉素等组成。
其中葡萄糖主要作为碳源，蛋⽩胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为⽆机盐，为微⽣物提供钾、磷和镁离⼦。
⽽孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌⽆抑制作⽤，因⽽真菌在这种培养基上可以得到优势⽣长，从⽽达到分离真菌的⽬的。
三、实验材料及⽤具1.⽤品：苹果、葡萄糖、琼脂、⽔、1%孟加拉红⽔溶液、马铃薯2.设备与器材：1ml的⽆菌吸管、⽆菌培养⽫等.四、实验步骤1、马铃薯培养基的配置培养基成分:马铃薯 40克、蔗糖（葡萄糖） 4克、琼脂 4克、⽔ 200毫升、 pH ⾃然。
配置⽅法:（1）配制20%马铃薯浸汁：取去⽪马钓薯40g，切成⼩块，加⽔200ml.加热煮游30 min ，⽤纱布过滤，然后补⾜失⽔互所需体积。
121Pa灭菌30min.即成20%马铃馨漫汁，贮存备⽤。
（2）配制时，按每100ml 马铃薯浸汁加⼊2g蔗糖，加热煮沸后加⼊4克琼脂，继续加热融化并补⾜失⽔。
（3）分装、加塞，包扎。
（4）⾼压蒸汽灭菌：121Pa灭菌30min（5）将灭菌培养基放⼊37C°的温室中培养24-48⼩时，观察是否有菌落⽣成，以检查灭菌是否彻底。
2、倒平板：将马铃薯培养基加热融化，冷却⾄55--50C°时，倒平板，倒三⽫3、制备苹果悬液（1）⾸先将1g苹果在研钵中磨细，放⼊装有10ml⽣理盐⽔和玻璃珠的100ml三⾓瓶中去。
菌种筛选办法
菌种筛选方法在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。
初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。
因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。
初筛的手段应尽可能快速、简单。
复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。
1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。
尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。
当然，这种鉴别方法只能用于初筛。
有人曾统计过3,484的育种中，fujikuroi）1)2) 或喷洒在已3)4)3 摇瓶培养法摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。
摇瓶与发酵罐的条件较为接近，所测得的数据就更有实际意义。
但是摇瓶培养法需要较多的劳力、设备和时间，所以，摇瓶培养法常用于复筛。
但若某些突变性状无法用简便的形态观察或平皿快速检测法等方法检测时，摇瓶培养法也可用于初筛。
初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。
4 特殊变异菌的筛选方法上述一般的筛选菌株方法的处理量仍是很大的，为了从存活的每毫升106左右细胞的菌悬液中筛选出几株高产菌株，要进行大量的稀释分离、摇瓶和测定工作。
虽然平皿快速检测法作为初筛手段可减少摇瓶和测定的工作量，但稀释分离的工作仍然非常繁重。
而且有些高产变异的频率很低，在几百个单细胞中并不一定能筛选到，所以，建立特殊的筛选方法是极其重要的。
例如营养缺陷型和抗性突变菌株的筛选有它们的特殊性，营养缺陷型或抗性突变的性状就象一个高效分离的"筛子"，以它为筛选的条件，可以大大加快筛选的进程并有效地防止漏筛。
发酵工程菌种筛选方案设计
发酵工程菌种筛选方案设计一、导言发酵工程是利用微生物（细菌、酵母、真菌等）进行代谢活动，生产有益化合物或者抑制有害化合物的一种工艺。
在发酵工程中，菌种的选择对于成品的质量和产量起着至关重要的作用。
因此，在发酵工程中进行菌种筛选非常关键。
本文将从菌种筛选的总体原则出发，设计一种适用于发酵工程的菌种筛选方案。
二、菌种筛选的总体原则在进行菌种筛选时，应当遵循一些基本原则，以确保筛选出的菌种能够在实际生产中发挥应有的作用。
具体而言，菌种筛选的总体原则可以概括为以下几点：1. 目标明确：在进行菌种筛选之前，应当明确发酵工程的目标是什么，需要生产的化合物是什么，然后以此为依据选择菌种。
2. 多样性：在进行菌种筛选时，应当考虑尽可能多的菌株，以便寻找到最适合生产目标化合物的菌株。
3. 可培养性：在实际生产中，菌种必须具有一定的可培养性，能够在发酵条件下生长繁殖。
4. 稳定性：筛选出的菌种要具有稳定的发酵特性，能够在不同的发酵条件下保持稳定的产率和质量。
5. 安全性：筛选出的菌种要具有一定的安全性，不能产生有害物质，对人体和环境造成危害。
基于以上总体原则，我们将设计一种适用于发酵工程的菌种筛选方案。
三、菌种筛选方案设计在菌种筛选方案设计中，我们将分为三个阶段：前期筛选、中期筛选和后期筛选，每个阶段将采用不同的筛选方法。
具体方案如下：1. 前期筛选前期筛选主要是为了寻找具有高产率和高稳定性的菌株，方法包括：从自然环境中分离菌株、从已知产物中分离菌株、基因工程筛选等。
（1）从自然环境中分离菌株：收集不同的土壤、水体和植物样品，通过稀释平板法、滤膜法等分离技术分离出大量的微生物菌落，然后通过对目标产物的筛选，选择具有较高产率的菌株进行进一步培养和鉴定。
（2）从已知产物中分离菌株：收集已知生产目标产物的环境样品，如发酵食品、药物中的环境微生物，通过培养和次级筛选，筛选出高产率菌株。
（3）基因工程筛选：利用基因工程技术，对目标菌株进行改造，使其产生更高产率的目标产物。
馒头酵母的分离与筛选
酵 的方 法 ，该方 法 使 面包 制 作 技 术发 生 了深 刻 的变 ７ ２ ２ Ｓ型分光 光度计 、Ｄ ｈ ３ ０数字 酸度计 。 ｅａ ２ ．． ３ 化 。２ 纪 ８ ０世 ０年代 中期 ，即发 活性 干酵母 从 国外 引 １１ 培 养基… 入 我 国市场 ，人 们开 始用酵母 发酵蒸 制馒头 ，使成 品 （）初筛培 养基 １ 馒头微甜 、 醇香 ， 维生素含量高 ，口感强 ，组织结构 Ｔ ｃ 上层培 养基 ：Ｔｒ （ ｒ ｃ 三苯 基 四氮唑 盐酸 盐） 均匀且 细腻 ；然而用 活性干酵 母生产 的馒头 与 民间发 ００ ，葡 萄糖 ０５ｇ ．５ｇ ． ，琼 脂 １ ，加入 １０ｍ ．ｇ ５ ０ Ｌ水 。
Ｊ１ ｕ．
文章编号 ：１７ — ６６ｆ ０ ８ ０ —０ ２ ０ ６ １９ ４ ２０ ） ７ ０ ８ — ３
馒 头酵 母 的分 离与筛 选
苏 东海
（ 京 电子 科 技 职业 学 院 生 物技 术 系 ，北 京 １０ ２ ） 北 ００ ９
摘 要：从 ２ ７种不 同馒头发酵剂中分离出 了 ２ 株酵母菌 ，经产酒精 能力筛选 ，获得 了 １ ｌ １株酵母 ，进一步研究酵母 的 产气能 力以及发酵速度 ，获得 ３株较好 的菌株 Ｙ ，Ｙ Ｙ １ 。和 。 ，对这 ３株酵母的抗高温能力 、耐酸能力以及面团发酵 能 力进 行 ＿研 究 。 ｒ 关键词 ：酵母 ；发酵 ；分离 ；筛选 ；
中 图分 类 号 ：Ｑ １ ８９ 文 献标 志 码 ：Ａ
Ｓ ｐ ｒ ｔ ｎ ａ ｄ Ｆ ｌ ａｉｎ ｆｒＢ ｅ ｄ Ｙｅ ｓ ｅ ａａｉ ｎ ｉ ｒｔ ｒａ ａ ｔ ｏ ｔ ｏ ｏ
Ｓｕ Ｄｏ ｇ ａ ｎｈｉ
（ ｉｏｙ ｅａｔ ｎ．Ｂ ｉｎ ｏａｏａ Ｃ ｌｇ ｆ ｌ ｔ ｎｃＳｉ ｃ ，Ｂ ｉｎ ０ ０ ９ ｈｎ ） Ｂｏ ｇ ｐｒ ｌ Ｄ ｍｅｔ ｅ ｉ Ｖ ｃｔ ｎｌ ｏ ｅｅｏ ｅ ｒ ｉ ｃ ｎｅ ｅ ｉ １０ ２ ，Ｃ ｉ ｊｇ ｉ ｌ Ｅ ｃｏ ｅ ｊｇ ａ
橙汁酿酒酵母菌株的分离筛选和发酵性能的测定
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Ａｕｇ ２ ０７ ．， ０
文章编 号 ： ０ — ２６２０ ）４ ０６ — ５ １ ０ ２８ （０７ ０ — ６５ ０ ０
橙 汁酿酒 酵 母 菌 株 的分 离筛选 和 发 酵 性 能 的测 定
陈 瑶 赖 崇德 刘 玄 倪 国荣 ， ， ，
（ ． 西农 业 大学 生 物 科 学 与 工 程 学 院 ， 西 南 昌 ３ ０４ ；２ 吉林 化 工 学 院 环 境 与 生 物 工 程 学 院 ， 林 吉 林 １江 江 ３０ ５ ． 吉
ｔｄｆ ｍ ｔｅｎｔｒｌ ｅｍ ｎａｏ ｕｃ ｆｏａ ｇ ，ｗ ｉｈａ ａｔ ｔ ｔｅｂｅ ａｅｏ ｒｎ ｅｗｎ ，ａ ｄｉ ｈ ｍ－ ｅ ｏ ａ ａ ｆ ｅｔｔ ｎｊｉ ｏ ｒｎ ｅ ｈｃ ｄｐｓ ｏ ｈ ｒｗ ｇ ｆ ａｇ ｉｅ ｎ ｓ ｕ ｒ ｈ ｕ ｒ ｉ ｅ ｏ
菌株分离——精选推荐
菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。
菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。
工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选：（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。
（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。
（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。
该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。
菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。
第一节含微生物样品的采集自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。
但总体来讲土壤样品的含菌量最多。
一、从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。
从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。
一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（1 06）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。
但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。
因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。
酵母菌培养操作
酵母菌培养操作一、引言酵母菌是一类单细胞真菌，广泛存在于自然界中的土壤、水体、植物和动物体内。
它们在生物学、医学和工业领域中具有重要的应用价值。
为了研究酵母菌的生理特性和生物学功能，科研人员经常需要进行酵母菌的培养操作。
本文将介绍一种常用的酵母菌培养方法。
二、材料和试剂准备1. 培养基：选择适合酵母菌生长的培养基，如YPD培养基（1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖）。
2. 培养器具：培养皿、试管、离心管等。
3. 酵母菌菌株：选择所需的酵母菌菌株。
三、酵母菌的分离和接种1. 从酵母菌菌株保存液中取出所需的菌株。
2. 在无菌条件下，将菌株转移到含有YPD培养基的试管中。
3. 进行适当的稀释，使培养液中的菌落数量适中。
4. 震荡培养液，使菌落均匀悬浮于培养基中。
四、酵母菌的培养条件1. 温度：酵母菌的生长温度一般为28-30摄氏度，根据不同的菌株和实验目的可以进行调整。
2. pH值：酵母菌的最适生长pH通常在5-6之间，也可以根据具体要求进行调整。
3. 培养时间：酵母菌的培养时间根据实验目的和菌株的生长速度而定，一般为24-48小时。
五、酵母菌的培养方法1. 平板培养法：将适量的酵母菌培养液均匀倒在培养皿中，待其凝固后，将所需的酵母菌菌株接种在培养基表面，然后在恰当的温度下培养一段时间，观察菌落形态和数量。
2. 液体培养法：将适量的酵母菌培养液倒入无菌的离心管中，加盖后在恰当的温度下培养一段时间，观察菌液浑浊度和细胞数量的变化。
3. 摇瓶培养法：将适量的酵母菌培养液倒入无菌的摇瓶中，盖紧盖子后在恰当的温度下进行摇床培养，可以获得大量的酵母菌菌液。
六、酵母菌的保存1. 冷冻保存：将酵母菌培养液加入等体积的甘油溶液中，混匀后分装在无菌冷冻管中，置于-80摄氏度的冷冻箱中保存。
2. 高温保存：将酵母菌培养液均匀涂布在含有蔗糖的平板培养基上，置于30-37摄氏度的恒温箱中保存。
七、实验注意事项1. 所有实验操作必须在无菌条件下进行，避免外界细菌和真菌的污染。
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种的分离与筛选来源：青岛海博一、微生物工业对菌种的要求(一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。
其中生产菌种的性能是最重要的因素。
（二）、微生物工业对菌种的要求是：（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;（4）能够高效地将原理转化为产品;（5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小;（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; （7）在发酵过程中产生的泡沫要少;（8）具有抗噬菌体的能力；（9）遗传稳定性，二、工业用微生物菌种的来源及选育（一）微生物菌种的来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；（2）从大自然中采集样品分离；（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。
当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
（二）微生物工业菌种的分离1、野生菌株的分离、筛选过程（1）新菌种分离与筛选的步骤菌种分离的流程如下：标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
②标本预处理④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。
⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。
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第３４卷第１期家畜生态学报Ｖ０１．３４Ｎｏ．１２０１３年１月ＡｃｔａＥｃｏｌｏｇｉａｅＡｎｉｍａｌｉｓＤｏｍａｓｔｉｃｉ
Ｊａｎ．２０１３
优良酵母菌株的分离和筛选刘晓辉１，张效川２，辛小玲３，白延琴４，徐文华５，蔡涛６，辛亚平ｎ，昝林森７。（１．天津市兽药饲料监察所，天津３００２１０；２．吴起县畜牧局，陕西吴起７１７６００；３．富平县畜牧兽医Ｔ作站，陕西富平７１１７００；４．子长县畜牧兽医局史家畔畜牧兽医站，陕西子长７１７３００；５．榆林市榆阳区牛家梁镇畜牧兽医丁作站，陕西榆林７１９０００；６．渭南市畜牧技术推广中心，陕西渭南７１４０００；７．西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌７１２１００）
［摘要］试验采用麦芽浸粉培养基和秸秆粉培养基，利用平板划线法，从富含酵母菌的青贮饲料和酒糟饲料中分离出酵母菌，经过培养条件的优化，从中筛选出用作反刍动物饲用的优良酵母菌株。试验结果表明，从青贮玉米和大麦啤酒糟中分离得到９号菌株生物产量最高，ＯＤ值为２．２３１，为优良酵母菌株。［关键词］酵母茵；青贮饲料；培养基；分离；筛选［中图分类号］￥８１１．６［文献标识码］Ａ［文章编号］１００５—５２２８（２０１３）０１—００４９—０４
酵母是一种肉眼看不见的微小单细胞微生物，能将糖发酵成酒精和二氧化碳，是一种天然发酵剂，分布于整个自然界，它有自己的生命现象，是一种典型的兼性厌氧微生物，在有氧气和没有氧气存在的条件下都能够存活［１］。酵母菌是人类文明史中被应用得最早的真菌类微生物。利用酵母菌发酵饲草饲料，具有成本低、原料广、周期短、产量高等优点，可提高饲料营养物质的消化率和吸收率，减少饲料原料浪费，同时缓解蛋白质饲料资源日益短缺的矛盾，促进我国畜牧业结构转型，推动畜牧业进一步发展［２］。本试验采用麦芽浸粉培养基和秸秆粉培养基，利用平板划线法，从富含酵母菌的青贮饲料和酒糟饲料中分离出酵母菌，经过培养条件的优化，从中筛选出优良酵母菌株，作为饲料酵母；为饲料酵母及发酵饲料在畜牧业生产中的应用提供理论依据［３］。１材料与方法１．１材料青贮玉米饲料、大麦啤酒糟、麦芽浸粉、秸杆粉。１．２方法采用麦芽浸粉培养基，通过平板划线法从青贮饲料和酒糟饲料中分离出酵母菌，进一步纯化，至镜鉴为稳定菌落。采用秸秆粉培养基，对分离到的酵母菌株通过正交试验探索培养条件，优化温度、初始ｐＨ、装液量和接菌量等。培养４８ｈ，并测定ＯＤ值。１．２．１培养基的制备麦芽浸粉培养基：葡萄糖１０ｇ、蛋白胨２ｇ、麦芽浸粉１ｇ、酵母膏１ｇ、琼脂粉１２ｇ、乳酸０．３ｍＬ／Ｌ、水１０００ｍＬ、ｐＨ、１２１℃灭菌
３０ｍｉｎ。
玉米秸秆粉培养基：取当年生无霉变的优质干燥玉米秸秆加工而成的０．１ｍｍ粒度细粉２０ｇ、蛋
白胨１ｇ、葡萄糖２ｇ、ＮａＣｌｌ０ｇ、琼脂粉２０ｇ、蒸溜水１０００
ｍＬ，ｐＨ
６．５～７．０，１２１℃灭菌３０ｍｉｎ¨Ｊ。
１．２．２增茵培养在无菌条件下称量饲料样品１０ｇ，放人带有玻璃珠的三角瓶中，加人麦芽浸粉液培养基，１８０ｒ／ｍｉｎ，３０℃振荡培养过夜。１．２．３分离、纯化酵母茵用２层无菌纱布过滤增菌液，取滤液１ｍＬ并稀释为１０～、１０～、１０～、１０一、１０～、１０１６个浓度梯度，各取０．５ｍＬ均匀涂在麦芽浸粉培养基平板上，在３０℃恒温下培养４８～７２ｈ，挑选与酵母菌特征菌落相似菌落转接到斜
面培养基上，平板划线纯化，分离纯化为单一菌落，无杂菌，编号后转接斜面。１．２．４观察酵母菌菌落形态在麦芽浸粉液体培
［收稿日期］２０１２—１０—２２，修回日期：２０１２—１１一０９［基金项目］国家８６３项目（２０１０ＡＡｌＯＺｌＯｌ，２０１１ＡＡｌ００３０７，２０１ｌＺＸ０８００７－００２，２０１１ＫＴＣＬ０２—１１。２０１２ＢＡＤｌ２８０７）；现代农业产业产业技术体系建设专项资金资助（ｃＡＲ孓３８）；陕西省农业攻关项目（２０１０Ｋ０２—１３）［作者简介］刘晓辉（１９６３一），女，河北保定人，硕士，高级兽医师，主要从事动物兽药管理工作。＊［通讯作者］辛亚平（１９６５一），男，陕西扶风人，博士，副教授，主要从事养牛学的教学科研和推广丁作。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉｎｙａｐｉｎｇ＠１２６．ｃｏｍ；昝林森（１９６３一），男，陕西扶风人，博士，教授，博士生导师，主要从事养牛学的教学科研和推广工作。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚａｎｌｓ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｌｌ．ｃｎ
万方数据５０家畜生态学报第３４卷
养基平板上接种纯化后酵母菌菌株，３０℃恒温培养４８ｈ，并观察菌落形态。观察是否有发酵现象，清浊
度，沉淀物的疏松度和紧密度等。观察菌落的形态大小，厚度，同心圈，辐射线，凹凸度，光滑度、光泽度、透明度、有无褶皱等，颜色及其他特征‘５｜。１．２．５观察酵母菌形态及出芽方式取１ｍＬ纯培养菌液接种在麦芽浸粉培养基平板上，３０℃培养４８ｈ计数，于高倍显微镜下观察出芽过程。１．２．６优化培养条件纯化培养菌株后，转接到装有２０ｍＬ麦芽浸粉液的１００ｍＬ锥形瓶中，１８０ｒ／
ｍｉｎ，３０℃培养４８ｈ，并进行显微镜检测，４℃保存
菌液备用。表１正交设计试验因素水平表Ｔａｂｌｅ１Ｆａｃｔｏｒｓｌｅｖｅｌｏｆ
ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎ
因子Ｆａｃｔｏｒ温度／＇ｃ初始ｐＨ接菌量／（ｍＬ／Ｌ）装液量／（ｍＬ／瓶）空列
ＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＩｎｉｔｉａｌｐＨＩｎｏｃｕｌｕｍＬｏａｄｅｄｌｉｑｕｉｄＥｍｐｔｙｃｏｌｕｍｎｓ
ｌ１１１１１２２２２１３３３３１４４４４２１４３４２２１４３２３２１２２４３２１３１３４２３２４３１３３１２４３４２１３４１２２３４２３１４４３４４１４４１３２采用正交设计试验设计Ｌ。。（４４），对培养条件的温度、初始ｐＨ、接菌量、装液量进行４个水平试验，优化培养条件，筛选出生长性能好的酵母菌菌株。然后采用玉米秸秆粉培养基，在不同条件下培养４８ｈ，并测定生物量［５］。通过正交试验Ｌ。。（４４）优化筛选出３株菌株进行生长曲线测定试验。根据正交试验的结果，按照每个菌株最适合的培养条件，在１８０ｒ／ｍｉｎ条件下培养４８ｈ。分别在０ｈ、３ｈ、６ｈ、１２ｈ、１８ｈ、２４ｈ、３０ｈ、３６ｈ、４２ｈ、４８ｈ、５４ｈ、６０ｈ、６６ｈ、７２ｈ时间点，测定其ｐＨ值，然后将样液分别分装在两个５ｍＬ试管中，冰浴使其生长停止。设３个重复，取其中一管测定ＯＤ值，绘制出生长发育曲线图。２结果与讨论２．１分离酵母菌菌落和细胞个体的形态特征在高倍显微镜下，酵母菌具有典型的真核细胞结构，有细胞壁、细胞核、细胞质、细胞膜、线粒体、微体、液泡等。酵母菌通常有球形、椭圆形、腊肠形、卵圆形或者藕节形等形态，无鞭毛，不能游动。本试验观察到酵母菌的生殖方式为出芽生殖（表３）。酵母菌比细菌大，约１～５／ｚｍ或５～３０“ｍ，呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，少数干燥，不透明。液体培养发酵，培养液变浑浊，有的形成浮膜、有沉淀物卟］。从青贮饲料和大麦啤酒糟中各分离出５株疑似酵母菌珠，进行编号１～１０。在培养过程中发现４１２３４５６７８
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万方数据第１期刘晓辉，等：优良酵母菌株的分离和筛选５１
号和７号菌发生衰退。其余各酵母菌株的形态大小、酵母细胞个体及出芽方式观察结果如表３所示。２．２培养条件优化和筛选结果采用秸秆粉培养基，对８株分离酵母菌株通过正交试验，对培养条件温度、初始ｐＨ、装液量和接菌量等进行优化。培养４８ｈ，并测定ＯＤ值，发现不同酵母菌株的最适宜培养条件很相似，为初始ｐＨ为５．５，３２℃、接菌量为１２ｍＬ／Ｌ，转速１８０ｒ／ｒａｉｎ时，测定的ＯＤ值达最高，即生物产量最高（表４）。酵母菌株不同，不同的培养条件下各因子对生物产
表３酵母菌细胞个体和菌落形态特征及出芽方式Ｔａｂｌｅ３Ｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｂｕｄｄｉｎｇｏｆｙｅａｓｔｃｅｌｌｉｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌａｎｄｃｏｌｏｎｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
表４分离酵母菌株正交试验结果Ｔａｂｌｅ４Ｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎｓ
量影响程度也不相同。在最优生长条件下，取得最高生物量的前３株优良菌株分别为３号（ＯＤ值：２．１８６）、５号（ＯＤ值：２．１７９）和９号（ＯＤ值：２．１９８）［７｜。２．３生长曲线测定用稀释培养法（ＭＰＮ）测定生物量：（１）菌种预培养。将斜面菌种１环至盛有５０ｍＬ种子培养基的２５０ｍＬ的三角瓶中，２８℃、１６０ｒ／ｒａｉｎ振荡，并培养２４ｈ；（２）将上述培养好的菌液按照１０％的比例接入另外１５瓶装有５０ｍＬ种子培养基的２５０ｍＬ
三角瓶中，并标号０～１５，２８℃、１６０ｒ／ｍｉｎ振荡培养，每间隔２ｈ取出一瓶培养液和ｌｍＬ菌液，４０００
ｒ／ｍｉｎ下离心５ｒａｉｎ，弃去上清液，加入９ｍＬ蒸馏水，使细胞重新悬浮，在６２０ｎｍ下比浊。以培养时
万方数据５２家畜生态学报第３４卷间为横坐标，ＯＤ值为纵坐标，绘制生长曲线［８］。通过正交试验结果（表４）筛选出３号、５号和９号菌，测定生长发育曲线（图１）。３号菌株的稳定期为４２～７２ｈ，生长对数期为６～４２ｈ，４２ｈ达最高生长点（０Ｄ值：２．１３２）；５号和９号菌株的生长对数期均为６～３６ｈ，稳定期为３６～７２ｈ，３６ｈ达最高生长点（５号ＯＤ值：１－９０２；９号ＯＤ值：２．２３１）。通过比较９株菌株最高生物产量时间点可知，９号菌生物量最高（图１）。９号菌送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行鉴定，结果为酿酒酵母［９］。奏２．５２１．５ｌＯ．５Ｏ—－３号．４－５号—．＿９号０３６１２１８２４３０３６４２４８５４６０６６７２时问愚Ｔｉｍｅ图１３号、５号、９号酵母菌株生长曲线Ｆｉｇ．１ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆＮｏ．３，Ｎｏ．５，Ｎｏ．９ｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎｓ３结论从青贮玉米和大麦啤酒糟饲料中分离１０ｋ酵母菌菌株，测定显微镜菌落形态，通过系列试验优化筛选，并鉴定其生长曲线，认为９号菌株属于酵母属，在初始ｐＨ为５．５，温度为３２℃、接菌量为１２ｍＬ／Ｌ，装液量为１００ｍＥ／瓶，转速１８０ｒ／ｍｉｎ，培养３６ｈ时生物产量达到最高，ＯＤ值为２．２３１。经过鉴定９号菌株为酿酒酵母。
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