结核菌分枝杆菌涂片抗酸染色
蛋白芯片技术与涂片染色技术检测结核分枝杆菌的探讨
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用医技 杂志 ２ １ ０ ２年 ６月第 ｌ ９卷第 ６期
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以上人群 ， 中涂 阳肺结核患者 １０万 ， 其 ５ 每年约有 ｌ ３万人死 于结核病 ， 死亡平均年龄为 ５ ． ５ ２岁Ⅲ 。据研究 ， 受结核菌感染 的人群中 ，０ １％的人会发展为结核病 ， 因此结核病 的防控工作 依然面临着严峻 的挑 战１ ２ １ 。结核病 的检查 是临床上明确结核 病诊断和化学治疗方案 的重要依 据 ， 也是 考核和评价疗效 的
１ ． 试验方法 ： ．２ ４ ①在芯片上标记 样品编号 。 ②在 芯片盒窗 口 内滴加 ２０Ｉ ０ Ｌ试剂 Ａ液 ， ｘ 使膜表面完全浸湿 。 ③待完全渗入
可靠标准。结核病 的确诊和治疗方案很大程度上依赖 于实验
室 检 查 ， 速 、 确 地 检 测 对 于结 核病 的 快 速 诊 断 ， 至 对 结 快 准 乃
后， 室温放置 １ ｉ， ｎ加待检血清 １０Ｉ 。④待血清完全渗入 ｍ ０ Ｌ Ｌ
后， 及时滴加 ３ ０Ｉ ０ Ｌ试剂 Ｂ液。⑤待试剂 Ｂ液完全 渗入后 ， Ｌ
结核分枝杆菌
结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，
简称结核杆菌，首次由德国科学家Robert Koch于 1882年由肺结核病人的痰液中分离得到，并被证实为结 核病的病原菌核杆菌在分类上隶属于放线菌目、分支杆 菌科、分支杆菌属，是种不能运动、不产芽孢、专性需 氧的短小杆菌。菌体-般细长、略弯曲，端极钝圆，多呈 单个或分枝状排列，大小约1-4×0.4μm。
革兰氏染色呈阳性；Ziehl -neelsen抗酸染色呈红色 ，非抗酸性细菌则呈蓝色。结核杆菌的抗酸性主要取决 于其胞壁内所含的分枝菌酸残基，亦和其胞壁固有层的 完整性有关。
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02 治疗性结核病疫苗的种类 2.1 活载体疫苗 2.2 亚单位疫苗 2.3 DNA疫苗 2.4 全菌灭活疫苗 2.5 其他疫苗 03 结核病治疗性疫苗的研究现状 04 结核病治疗性疫苗的展望
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04 展望
结核疫苗快速发展，并能对致病性结核杆菌产 生保护性免疫应答，为TB的防治带来了希望。然而， 迄今还没有一个重组疫苗能达到BCG的免疫水平。 其原因在于，重组疫苗虽可激活免疫系统，但不能 引起长期特异性的细胞免疫记忆，所以开发一种与B CG协同的、可产生长效免疫应答的疫苗十分重要。 初免-加强免疫策略的出现，有效联合了BCG与新型 结核疫苗，为预防结核、诱导机体产生长期免疫保 护作用提供了可能。
等
MTB肝素结合血凝
素
DNA疫苗
HG85 A/B
临床前 中国人民解放军军事 嵌合 DNA疫苗 A 医学科学院（吴雪琼） g85A/Ag85B 等
抗酸染色——标准操作
抗酸染色一、原理本试剂盒采用WHO推荐的Ziehl-Neelsen法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。
但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。
齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。
当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。
二、试剂石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液三、方法1.涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰2.固定：常用高温进行固定。
即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。
要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色3.染色3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色10分钟或更久，无需加温3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色30秒钟3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块四、结果判定1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色2. 报告方式2.1 未找到抗酸杆菌2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野2.3 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野2.4 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野2.5 找到抗酸杆菌3+:发现抗酸杆菌1-9条/1视野2.6 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野五、注意事项1.每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热7. 染色时勿使玻片上的染液干燥六、临床意义分支杆菌属（结核分支杆菌、麻风分枝杆菌、非典型分支杆菌）、放线菌抗酸染色阳性，可初步鉴定细菌。
三种抗酸染色法检测痰结核分枝杆菌结果分析
三种抗酸染色法检测痰结核分枝杆菌结果分析郑浩;柳晓金;齐海亮;冯建纯;朱桂云;郑立恒【摘要】Objective:To assess the value of applying three diverse techniques(direct smear method,flotation smear,centrifuging the liquored sputa and collecting bacteria method) to detection of the mycobacterium in sputum for diagnosis of pulmonary tuberculosis.Methods:The sputum samples were ob-tained from 1 500 suspected tuberculosis patients and respectively detected by the direct smear ,flotation smear and centrifuging the liquored sputa and col-lecting bacteria method for comparison of the positive sputum .Results:Direct smear,flotation smear,and centrifuging the liquored sputa and collecting bac-teria method revealed positive rate of 22.0% (244/1 500),22.0% (330/1 500) and 22.4% (336/1500),respectively.The difference was significant between direct smear and flotation smear,and direct smear and centrifuging the liquored sputa and collecting bacteria method .Of the three techniques,flo-tation smear and centrifuging the liquored sputa and collecting bacteria method led to higher detection rate (χ2 =78.68,P<0.001 for the former;χ2 =2.50,P>0.05 for the latter).However,the positive results were not significant between flotation smear and centrifuging the liquored sputa and collecting bacteria method(χ2 =2.50,P>0.05).Co nclusion:Centrifuging the liquored sputa and collecting bacteria method can be rapid and simple in detection of the mycobacterium in sputum with higher positive findings,thus it is worthy of wider clinical recommendation for diagnosis of pulmonary tuberculosis.%目的：探讨涂片法、漂浮集菌法和夹层杯法三种方法检测痰中结核分枝杆菌对于肺结核的诊断价值。
结核病实验室涂片镜检技术
理治疗带来新的希望。
结核病细菌学诊断
结核病细菌实验室布局原则
• 1、结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得 与其他实验室混用，最好为P3级实验室；
• 2、培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片 镜检、培养前处理、药敏试验等污染操作要有独 立分开的场所，最好分别在专用的房间进行；
盐类
• 钙、钾、镁、铁、磷等，约占菌体成 分的 6％。
营养与发育
• 结核菌是需氧菌，但在含有比较低氧的环 境下也能生存，比如骨结核，淋巴结核。
• 在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。 • 结核菌生长的适宜温度和人体相近为370C • 结核菌生长所必需的元素有氧、碳、氮、
氢、磷、钾、镁等。
结核分枝杆菌形态
抗酸性
抗酸性是分枝杆菌的重要特征。其化学 基础是分枝菌属的细胞壁脂质含量较高， 并含有大量分枝菌酸。
抗酸性与细菌细胞壁的完整性关系密切， 若菌体自溶（如标本保存时间过长、温度 过高）、结核菌的异型相（如：L-型菌、 干酪或脓液中的结核菌）可能失去抗酸性。
生长特性
生长适宜温度37C，PH6.8-7.2。营养要求较高。 在常用的罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基上 生长的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皱折， 呈颗粒、结节或菜花样，乳白色或米色，不透 明。
是国家结核病控制规划（NTP）的重要组成部分 是发现传染源的最主要途径和手段 是考核疗效、评价防治效果的可靠指标
分枝杆菌 生物学基础
概述
结核分枝杆菌是1882年郭霍（Robert Koch） 从肺结核病人痰标本中发现。是人类结核 病的主要病原菌。
分类
抗酸染色原理
抗酸染色原理抗酸染色是一种常见的生物组织学技术，广泛应用于医学、生物学、动物学等领域。
它的原理是利用酸性染料与切片中的细胞组织相互作用，并通过特定的处理过程来使染料显色。
本文将介绍抗酸染色的原理、应用及技术流程等方面。
一、抗酸染色的原理抗酸染色的原理是利用酸性染料与细胞中不同的生物化学结构发生反应。
在酸性条件下，酸性染料带有负电荷，能够结合细胞质中的阳离子，如核蛋白、粘多糖等。
这些阳离子结合后，染料被固定在细胞质中，从而形成可见的色彩。
一般来说，抗酸染色会选择一些带有芳香环结构的染料，如苏木精、伊红等，它们能够与细胞核及其他结构中的核酸、蛋白质等有机物结合，从而显色效果更为明显。
二、抗酸染色的应用抗酸染色在医学、生物学及动物学等领域中有广泛应用。
其中，它在组织学领域应用最广泛。
在组织切片染色中，抗酸染色被用于显示特定的细胞和组织结构，如细胞核、细胞膜、细胞质等。
通过观察染色后的组织切片，可以更好地了解细胞内各种结构的分布和形态，进而推断细胞的生理、病理过程。
因此，在组织学研究中，抗酸染色技术是必不可少的。
除此之外，抗酸染色还可以用于检测肿瘤、感染、免疫反应等病理过程中的细胞或病原体。
比如，在肿瘤组织切片染色中，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的染色可以帮助诊断和分级恶性淋巴瘤。
在感染组织切片染色中，抗酸染色可以检测到结核菌和分枝杆菌等病原体。
在免疫反应研究中，抗酸染色技术也有着重要的应用价值。
三、抗酸染色技术流程抗酸染色技术流程包括以下几个步骤：1. 取得组织样本组织样本可以是活体组织、死亡组织或培养细胞等。
对于取得的组织样本，需要进行必要的处理，如切片、固定、包埋等，以便后续处理。
2. 染色在抗酸染色中，主要选择苏木精、伊红等抗酸性染料。
通常先将切片置于染液中浸泡一定时间，使染料渗入组织样本内部，然后进行洗涤，以去除多余的染料。
洗涤后，还可以进行酸性解剖和再次染色等操作，以增强显色效果。
3. 脱水、清洁与封片通过脱水、透明化和封片等步骤，可以将染色后的切片制成玻璃片，并用石蜡或树脂等物质固定切片。
结核分枝杆菌
（1）原发感染
结核分枝杆菌 侵入肺泡 被肺泡中 吞噬细胞吞噬 在吞噬细胞内繁殖 导致 巨噬细胞裂解释放出的细菌 释放出大量细 菌在肺泡内引起渗出性炎症即为原发性灶。细菌 随淋巴管到达肺门淋巴结，引起淋巴结肿大称原 发综合征 感染3-6周，机体产生特异性细胞免疫，同 时也产生迟发超敏反应
机体免疫力低下时，原发感染灶恶化，结核 分枝杆菌经气管淋巴道或血流播散，形成全身性 粟粒性结核 。 当机体抵抗力强时，使感染灶形成结核结节。 淋巴结病灶逐渐纤维化和钙化，不治自愈。但病 灶内常有一定量的细菌长期潜伏，不断刺激机体 产生免疫。也可成为以后内源性感染的来源
2 肺外感染 结核杆菌可经血液循环引起肺外感染， 如脑、肾、结核，痰被咽入可引起肠结核、 结核性腹膜炎等。一般认为血中播散的大 多是L细菌
(三) 免疫性 人类对结核分枝杆菌的感染率甚高，但发病率 不高。这表明人体对结核分枝杆菌有相当强的 免疫力。 （1）结核的免疫为有菌免疫或称传染性免疫 。这种免疫系指结核分枝杆菌(或BCG) 进入机 体后使机体对细菌再次入侵有免疫力；而当细 菌或其成分从体内彻底消失后机体的免疫力也 随之消失。遗传因素决定对结核病的易感染性 ， HLA-Bw15为易感个体。
（三）抵抗力 结核分枝杆菌因细胞壁含有大量脂类，故对 理化因素抵抗力较强。耐干燥，在干燥的痰内 可存活6-8个月。含有结核分枝杆菌痰液的尘埃 经8-10d仍有传染性。此菌对化学消毒剂的抵抗 力也较一般细菌强，在3%HCl或6%H2SO4中不被杀 死。因此常用于处理有杂菌污染的检材，以便 进行分离培养。对湿热敏感，60℃30min可杀死 细菌；在70%-75%乙醇中数分钟即被杀死 ，对 紫外线敏感
抗酸染色液说明
抗酸染色液说明【产品名称】通用名称：抗酸染色液【包装规格】100ml*2/盒、250ml*2/盒、500ml*2/盒【预期用途】抗酸染色液用于分枝杆菌、诺卡菌等细菌抗酸染色，包括荧光染色。
【检验原理】结核菌、麻疯杆菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质之皮膜而不易着色，但一经着色后，酸性酒精的作用亦是不容易把它脱色。
利用此特性并以增强的染色液予以染色，然后再以酸性酒精加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色(红色)，也就易于鉴别。
【主要组成成份】试剂组成：抗酸染色液包括石碳酸复红染色液、亚甲基蓝染色液。
【贮存条件及有效期】有效期：未开封试剂有效期为24个月。
贮存条件：本试剂应贮存于相对湿度不大于80%，无腐蚀性气体和通风良好的5~30℃室温环境。
【样本要求】待检标本应为菌株或有菌株的标本。
【检验方法】涂片经固定水洗后或石蜡切片脱蜡水洗后：1、将石碳酸复红染色液滴加于切片上，然后在微火加热至有蒸汽出现，水洗；2、用0.5%盐酸酒精分化至无红色染料脱落，水洗；3、亚甲基蓝染色液作对比染色20～60秒，水洗；4、酒精脱水，二甲苯透明、中性胶封固、镜检。
【检验结果的解释】抗酸杆菌呈红色，其他组织呈浅蓝色。
【检验方法的局限性】有些细菌有染色嗜变性，不一定完全是染色原因，应根据菌体形态加以确定。
【注意事项】1.该该染色液仅用于体外诊断。
2.涂片厚薄要均匀，自然干燥后再加热固定。
3.试剂贮存时，尽量避免高温及光亮环境，以免影响品质和效果。
标示有效期过后，请不要使用。
4.本品应由专业人士使用及进行结果的判断。
5.所用标本应视为具有传染性物质。