结核菌分枝杆菌涂片抗酸染色
结核分枝杆菌的核酸检测
荧光染色
结核菌需要先培养出来（2-6周） 再加入不同浓度抗菌药物的培养基中继续培养4-8周报告药敏结果
2014年WHO关于结核诊断的标准
肺结核 ✓所有患者，包括儿童，当疑似肺结核并可咳痰时，应送2份痰做 涂片镜检 或 1份痰做Xpert MTB/RIF检测 ✓对于涂阴疑似肺结核患者，应当使用Xpert MTB/RIF 或培养 进行 诊断
（1）采集标本前，应清洗外生殖器，推荐连续采集3天清晨中 段尿于无菌容器中，用于培养的尿液标本至少需要40ml
（2）只有在不能获得中段尿时，可以使用导尿术采集标本。
（3）标本运送不及时，应冷藏保存。
5. 无菌采集的体液（脑脊液、胸水、腹水、心包积液、 关节液、骨髓）
（1）临床医生采用抽吸技术或外科操作无菌收集体液标 本于无菌容器。
（3）福尔马林溶液浸泡过的标本不能用于培养检查。
（4）极少量的活检标本可以浸泡在少量无菌盐溶液中。
7.血液 （1）如果血液标本接种培养基之前需要运输，肝素成柠檬
酸盐可以用于抗凝。EDTA抗凝和凝固的血不能做培养。 （2）血液和脑脊液标本培养推使且MYCO／FLYTIC瓶（BD）
血培养瓶。（暂时不做）
结核分枝杆菌核酸检测
增加分子生物学阳性可以作为确诊标
准，及强调病原学检查的重要性。
3.4.2 分子生物学检查 结核分枝杆菌核酸检测阳性。 4 诊断原则 肺结核的诊断是以病原学（包括细菌学、 分子生物学）检查为主，结合流行病史、 临床表现、胸部影像、相关的辅助检查 及鉴别诊断等，进行综合分析做出诊断。 以病原学、病理学结果作为确诊依据。 5.3 确诊病例 结核分枝杆菌核酸检测阳性，及胸部影 像学检查支持即可确诊。
6．无菌采集的组织（淋巴结、皮肤和其他活检标本）
抗酸染色——标准操作
抗酸染色一、原理本试剂盒采用WHO推荐的Ziehl-Neelsen法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。
但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。
齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。
当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。
二、试剂石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液三、方法1.涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰2.固定：常用高温进行固定。
即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。
要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色3.染色3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色10分钟或更久，无需加温3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色30秒钟3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块四、结果判定1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色2. 报告方式2.1 未找到抗酸杆菌2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野2.3 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野2.4 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野2.5 找到抗酸杆菌3+:发现抗酸杆菌1-9条/1视野2.6 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野五、注意事项1.每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热7. 染色时勿使玻片上的染液干燥六、临床意义分支杆菌属（结核分支杆菌、麻风分枝杆菌、非典型分支杆菌）、放线菌抗酸染色阳性，可初步鉴定细菌。
T-SPOT.TB与痰涂片抗酸染色技术诊断肺结核的效能分析
Mod Diagn Treat 现代诊断与治疗2020Dec 31(23)肺结核是由于患者感染结核分枝杆菌所引起的慢性传染性疾病,目前对肺结核主要的辅助诊断方式包括结核分枝杆菌培养、结核菌素试验、涂片抗酸染色检查、常规聚合酶链反应检测和其他实验室检查,这些方式在诊断肺结核疾病中具有重要诊断价值,但也存在着较多不足,如痰培养周期较长、结核菌素实验易受到患者免疫力因素等影响或者部分检测方法的检测标本不易获得,这些不足一定程度上限制其应用于肺结核辅助诊断[1,2]。
T-SPOT.TB 是根据感染结核杆菌后体内T 细胞诱导出γ干扰素释放反应而设计的检查方式,可准确检测出机体内是否含有对结核分枝杆菌反应的特异性效应T 细胞,对肺结核具有较高的诊断价值[3],但目前缺少关于T-SPOT.TB 与痰涂片抗酸染色技术诊断肺结核效能比较的研究与报道,鉴于此本研究通过将77例高度疑似肺结核患者作为研究对象,旨在分析T-SPOT.TB 与痰涂片抗酸染色技术诊断肺结核灵敏度、特异度、准确度的差异,及其对不同年龄患者的检验效能。
道如下。
1资料与方法1.1一般资料选取2018年1月~2020年4月我院收治的高度疑似肺结核患者77例,其中男40例、女37例;年龄29~69(49.24±3.51)岁。
纳入标准:(1)经患者临床常规检查及患者临床表现初诊为高度疑似肺结核;(2)无身体其他组织器官严重损伤;(3)患者及家属均知情同意,且签署知情同意书;排除标准:(1)认知障碍或者精神疾病患者;(2)临床资料缺损;(3)妊娠期或哺乳期女性。
本研究经我院医学伦理委员会审核批准。
1.2方法所有患者均接受T-SPOT.TB 与痰涂片抗酸染色技术及其他帮助临床最终诊断的检查如胸部X 线检查、结核分枝杆菌培养等。
T-SPOT.TB :所用试剂盒购自上饶美康盛德医学检验所,取患者静脉血5ml ,混入肝素抗凝摇匀,培养于结核特异抗原靶蛋白A 管、非特异性从健康元植物雪球凝集素B 管和空白对照C 管,离心后对单个核细胞进行洗涤并计数,混合抗原加入到抗γ-干扰素的反应孔,孵育后洗涤并加标记二抗,最后加染色液干燥后镜下记录每个反应孔中酶联斑点数,当C <0.5时,若A-C/B-C ≥0.16判为阳性,否则为阴性;当0.5≤C ≤2.5时,若A-C ≥1.5判为阳性,否则为阴性。
肺结核病人的护理
肺结核病人的护理张荣结核病是由结核分支杆菌感染所致的传染病，全身各脏器都可受累，以肺结核最为常见，最近几年本病的发病呈增加趋势。
肺结核是呼吸系统传染病，由于结核菌侵犯肺组织所致。
传染源为病人和带菌者，主要过呼吸道传播。
是国人咯血的常见原因。
1.病因结核分枝杆菌①染色：涂片抗酸染色（+）；②分型：分枝杆菌有人、牛、鼠、非洲型，致病主要人型及少数牛型；③培育：生长缓慢，培育需2～8 周才长出菌落；④抵抗力：对外界环境抵抗力强，完全灭菌-焚烧痰纸。
2.机制人感染结核菌后是不是发病决定于结核菌数量、毒力、机体免疫力及变态反映。
肺结核类型一、原发型肺结核(Ⅰ型)：为原发结核感染引发的临床病征。
包括原发综合征及胸内淋巴结结核。
并发淋巴结支气管瘘时，如淋巴结肿大比较显著，两肺内只有较少的播散性病变时，仍归本型。
二、血行播散型肺结核(Ⅱ型)：包括急性血行播散型肺结核(急性粟粒型结核)及亚急性、慢性血行播散型肺结核。
三、浸润型肺结核(Ⅲ型)：是继发型肺结核的主要类型。
肺部有渗出、浸润及/或不同程度的干酪样病变。
可见空洞形成。
干酪性肺炎和结核球也属于本型。
四、慢性纤维空洞型肺结核(Ⅳ型)：是继发型肺结核的慢性类型。
常伴有较普遍的支气管播散性病变及明显的胸膜增厚。
肺组织破坏常较显著，伴有纤维组织明显增生而造成患处肺部组织收缩和纵隔、肺内的牵拉移位，临近肺组织常呈代偿性肺气肿。
五、结核性胸膜炎(Ⅴ型)：临床上已排除其他原因引发的胸膜炎。
临床表现：一、全身症状：全身毒性症状表现为午后低热、乏力、食欲减退，体重减轻、盗汗等。
当肺部病灶急剧进展播散时，可有高热，妇女可有月经失调或闭经、。
二、呼吸系统：一般有干咳或只有少量粘液。
伴继发感染时，痰呈粘液性或脓性。
约1／3病人有不同程度的咯血。
当炎症波及壁层胸膜时，相应胸壁有刺痛，一般并不剧烈，随呼吸和咳嗽而加重。
慢性重症肺结核，呼吸功能减慢，出现呼吸困难。
实验室和其他检查：一、结核菌检查痰中找到结核菌是确诊肺结核的主要依据。
免疫荧光染色与传统抗酸染色在肺结核病理诊断中的应用分析
免疫荧光染色与传统抗酸染色在肺结核病理诊断中的应用分析摘要：背景：肺结核是一种由结核分枝杆菌感染引起的呼吸系统传染病，发病率和死亡率均居于传染类疾病第二位。
目前对于肺结核的病理诊断方法主要有传统的抗酸染色和新兴的免疫荧光染色，不同的方法各有其优缺点。
目的：探讨免疫荧光染色与传统抗酸染色在肺结核病理诊断中的应用价值，得出最适合于病理实验室的抗酸杆菌检测方法。
方法：收集2021年8月至2022年8月在眉山市中医医院就诊时临床怀疑为肺结核的病人进行肺穿刺且组织学诊断为肉芽肿性炎伴干酪样坏死的组织学标本183例，每例由科室技术老师按标准操作制作两张切片后分别进行传统抗酸染色和免疫荧光染色，比较两种方法的镜检表现和阳性检出率。
结果：结核分支杆菌在免疫荧光染色法时镜检更清晰，阳性检出率更高。
关键词：肺结核；免疫荧光染色；抗酸染色；病理诊断结核病已经成为我国重大的传染病之一，是严重危害人类健康的呼吸道传播疾病。
据WHO的数据统计报告,我国不仅仅是世界范围内22个结核病流行最严重国家之一，同时也是27个耐结核病药物流行严重的国家之一。
目前,我国结核病的年发病人数高达130万，约占全球发病人数的14.3%，位居全球的第二位。
因此，结核病已经成为我国危害人们健康最严重的呼吸道传染病[1]。
因此积极诊治肺结核，预防其传播和流行具有重大意义，而准确的诊断肺结核是临床进行有效抗结核治疗的基础和前提。
在病理诊断中，肺结核的确诊依靠肺组织学标本进行抗酸染色找到确切结核分枝杆菌,但其阳性率低，易漏诊误诊,目前科室新开展了免疫荧光染色来辅助诊断抗酸杆菌，我们有必要进行相关的对比实验,分析两种方法的优缺点,找到最佳实验方法，提高抗酸分枝杆菌检出率及病理诊断的准确率,指导临床合理用药和精准治疗,争取消除肺结核,保障广大人民群的生活质量。
1 资料与方法1.1一般资料参与研究的对象为2021年8月至2022年8月眉山市中医医院就诊时临床怀疑为肺结核的病人进行肺穿刺且组织学诊断为肉芽肿性炎伴干酪样坏死的组织学标本183例。
结核分枝杆菌痰培养方法
结核分枝杆菌痰培养方法结核病是一种大家较为熟知的慢性传染性疾病，由结核分枝杆菌感染引起。
可通过空气传播，且感染剂量很低，人吸入很少的结核分枝杆菌即可引起感染。
该疾病会在任何年龄发病，而免疫力低下的患者更容易感染结核分枝杆菌。
近年来，随着艾滋病发病率的增加，耐药性结核分枝杆菌的出现，吸毒人群的增多以及免疫抑制剂的应用等，我国结核病发病率仍然较高。
结核病已成为威胁人类健康的全球性的严重的公共卫生问题。
如何知道自己得了结核病呢？当人体感染结核杆菌后，因感染的部位不同，会出现不同的临床症状。
例如肺结核患者主要会表现出咳嗽，咳痰，咯血，胸痛，低烧，盗汗，乏力等一些呼吸道疾病症状。
而感染肾脏时，患者会出现尿急，尿痛，血尿等泌尿系统症状。
大部分患者感染结核杆菌后会出现不同程度的低热，盗汗，虚弱等等。
当人体出现以上症状时，即可高度怀疑为结核病。
出现自觉症状后，就医后医生首先会建议患者进行影像学诊断，以此来确定结核分枝杆菌感染的脏器部位，同时也会进行体液培养来进一步确定患者是否感染了结核杆菌，通常会采取患者的痰液来进行检验。
让我们进一步来了解一下吧。
一、什么是结核杆菌？结核杆菌即为结核分枝杆菌。
它是引起结核病的病原体，而结核杆菌是一种较为古老的细菌，早在4500年前的古埃及，人们就已经发现了这种细菌的存在。
古代时大家将肺结核患者称为肺痨患者。
在1882年，该病菌由一名德国的细菌学家郭霍发现后，才被正式命名为结核菌。
结核分枝杆菌是一类专性需氧菌，它生长较为缓慢。
对干燥，冷，酸碱等抵抗力非常的强，在紫外线的照射下，痰液中的结核杆菌需要经过六个小时左右才会被彻底杀死。
目前痰培养是确定结核杆菌感染的主要检查项目，经过痰液培养分离细菌可以发现，结核分枝杆菌革兰染色不易着色，需用特殊染色方法荧光染色或萋—尼抗酸染色。
经抗酸染色后菌体为红色细长直或略弯的杆菌，该细菌没鞭毛，无芽孢，有荚膜，多数有异染颗粒。
荧光染色、抗酸染色如图：从致病性角度分析可见，结核杆菌本身不会产生内外毒素，其致病物质主要是他的荚膜、脂质以及蛋白质。
分枝杆菌
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2、分离培养
（3）接种培养
取0.1ml处理的各种标本悬液和沉淀物，接种固体培养基 35-37℃
5%-10%CO2培养 一周内每天观察，以后每周观察一次，直到8周 根据生长时间、菌落形态、产生的色素等特点加以判定 报告方式：培养阳性 （斜面上20个菌落以下，报菌落数） 培养阴性 必须观察8周
（多用于尿标本的前处理）
胰酶-新洁尔灭：1g/L胰酶消化后，再用0.3%新洁尔灭处理5min以液化
和杀灭杂菌
NALC-2%NaOH（N-乙酰-L-半胱氨酸，2%氢氧化钠 ）适用各种标本处理
31
2、分离培养
（2）培养基选择 鸡蛋为主的培养基 L-J培养基 曲氏 小川 琼脂为基础的培养基 米氏7H10和7H11 液体培养基 米氏7H9和吐温白蛋白肉汤，主要用 与药敏试验
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标本 涂片检查 分离培养 处理过的标本 或无污染标本
核酸检测
抗体检测
直接涂片
5
结核分枝杆菌扫描电镜照片
L-型结核分枝杆菌扫描电镜照片
Ziehl-Neelsen 抗酸染色（痰直接涂片）
Ziehl-Neelsen 抗酸染色（纯培养）
6
金胺“O”染色，荧光显微镜下菌体发出黄绿色或橙黄色荧光
7
2、培养特性
专性需氧，8-12%CO2刺激生长，最适温度 35-37℃，
PH6.5-6.8，需要一定的湿度 生长缓慢， 18～24h分裂一代，在固体培养基上2-4周才 能长出菌落。菌落呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄 色，表面粗糙，形似菜花样 液体培养基生长较快，多表面生长，形成菌膜，易碎沉于 管底。有毒力菌株在培养液中呈索状生长 营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及 含某些无机盐类的特殊培养基（如罗氏培养基）上才能生 长
抗酸染色对肺结核的诊断价值
ｂ ｒ ｕｏ ｉ． Ｍ ｅ ｏ ｓ Ｎｉ ｅｙ ｅ ｇ ｔ ｃ ｓ ｓ ｏ ｅ ｏ ｄ ｒ ｕ ｍｏ ａ ｙ ｔ ｂ ｒ ｕｏ ｉ ｎ ｈ ｍａ ｏ ｅ ｏ ｓｄ ｓ ｅ ｎ ｔｄ ｐ ｌ ｎ ｒ ｕ ｅ ｃ ｌｓｓ ｅ ｃ ｌ ｓｓ ￣ ｄ ｎ ｔ — ｉｈ ａ ｅ ｆ ｓ ｃ ｎ ａｙ ｐ ｌ ｎ ｒ ｕ ｅ ｃ ｌ ｓｓ ａ ｄ ｅ ｔｇ ｎ ｕ ｉｓ ｍｉ ａｅ ｕ ｍｏ ａｙ ｔ ｂ ｒ ｕ ｏ ｉ
者 或 基 层 医 院 ， 法 较 难 普 遍 开 展 。抗 酸 染 色 仍 是 最 常 用 的 该
抗酸染色抗酸菌 （＋ ： ９条／ ０视 野 ，— ＋ ） １～ １ ＺＮ抗酸染 色抗酸菌 （ ） ３～ 卅 ： ９条／ 每视 野 ， － Ｚ Ｎ抗 酸 染色抗 酸 菌 （Ｈ） ≥１ 十 ： ０条／ ｛
ｍ ｎ ｕｍ ｎ ｒ ｅ， ｈ ７ ｔ Ｈ ｓｉ ｌ Ｐ ， ｈ ｎｚｏ ，Ｆｊ ｎ ３３ ０ ，ｈｎ ｅｔｆＰ ｌ ｏａｙｄ ｅ ｓ Ｔ ｅ１５ｈ ｏ ｔ Ｚ ａｇｈ ｕ ｕａ ６ ０ ０ Ｃ ｉ ｏ ｐａｏ ｆ ｉ ａ 【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊ ｔ ｅ ｏ ｘｌｅｔ ｌ ｆｃ —ｓｓｉ ｔｔｆ ｙｏａｔｉ ｂｒ ｌ ｉｉｔ ｉｎｓ ｆｕ ｏａ — Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂ ｃｖ Ｔ ｐ ｒ ｈ ｖｕ ｏａｉ ｆｔｔｎｅ ｃｂｃ ｒｍｔ ｅ ｕ ｓ ｅ ａ ｏｉｏｐｌ ｎｒ ｔ ｅｉ ｅ ｏ ｅ ａ ｅ ｄ ａ ａ ｓｏｍ ｅｕ ｕ ｃ ｏ ｓｎ ｈ ｄ ｇ ｓ ｍ ｙｕ