黏液型铜绿假单胞菌的毒力基因、产金属酶检测与耐药性研究
铜绿假单胞菌的耐药性与金属β-内酰胺酶检测
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铜绿假单胞菌生物学特性、实验室检查、生化鉴定、临床症状、耐药性及预防措施
铜绿假单胞菌生物学特性、实验室检查、生化鉴定、临床症状、耐药性及预防生物学特性铜绿假单胞菌是常见条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。
菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。
菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。
铜绿假单胞菌为专性需氧菌，最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。
在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，绿脓素与带荧光的水溶性荧光素等。
在血平板上会有透明溶血环。
含有O抗原以及H抗原。
O抗原包含两种成分：一种是其外膜蛋白，为保护性抗原；另一种是脂多糖，有特异性。
O抗原可用以分型。
实验室检查标本来源。
采自不同感染部位的各种标本，包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。
还包括来自医院环境中的各种标本如水、空气、物体表面采样等。
染色镜检。
为革兰阴性杆菌，菌体大小(1.5~5.0)um×宽(0.5~1)um，细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。
菌体的一端有单鞭毛，无芽胞，无荚膜。
分离培养本菌生长对营养要求不高。
对有正常菌群存在的临床标本或来自环境中的标本应接种选择性培养基如麦康凯琼脂培养基(MAC)；对无正常菌群存在的临床标本如血液、脑脊液、穿刺液等可接种普通全营养型培养基或血琼脂培养基、铜绿假单胞菌培养基。
普通琼脂培养基上生长18~24h可以见到扁平、湿润的菌落，该菌所产生的带荧光的水溶性青脓素与绿脓素相结合将使得培养基呈亮绿色；在血琼脂平板上生长时可以见到在菌落的周围有溶血环，菌落呈金属光泽；在铜绿假单胞菌培养基上呈蓝绿色或者红褐色菌落，365nm紫外灯下显荧光。
如果是在液体培养基中则呈浑浊状生长，在液体表面形成菌落，而在培养基底部的细菌生长不良。
生长实验。
铜绿假单胞菌在4℃不生长而在42℃可以生长。
生化鉴定分型(1)噬菌体分型：所应用的噬菌体现有24株，分型率达90%。
铜绿假单胞菌氨基糖苷类药物产酶耐药机研究
铜绿假单胞菌氨基糖苷类药物产酶耐药机研究张玉云;吴金英;范小莉;闫博;马智刚【期刊名称】《世界感染杂志》【年(卷),期】2008(8)4【摘要】Objective To investigate the 16SrRNA methylases gene and AMES of 30 strains of multi-resistant pseudomonas aeruginosa isolatted from patients in our hospital.Methods Collecting 50 strains of pseudomonas aeruginosa from two hospitals(30 strains of multi-resistant pseudomonas aeruginosa from Yantai,Shandong,20 strains of pan-drugresistant from Jiangsu),and analysing 6 kinds of 16SrRNAmethylases(armA,rmtA,rmtB,rmtC,rmtD,npmA)and 6 kinds of AMEs gene aac(3)-Ⅰ,aac(3)-Ⅱ,aac(6')-Ⅰ b,aac(6')-Ⅱ,aac(3")-Ⅰ,and aac(2")-Ⅰ by PCR and sequence analysis.Results In 30 strains of multi-resistant pseudomonas aeruginosa from Yantai,the positive rate of 4 kinds of genes aac(3)-Ⅱ,aac(6')-Ⅱ,aac(3")-Ⅰ,a nd aac(2")-Ⅰ were20%(6/30),46.7%(14/30),36.7%(11/30)and 3.3%(1/30)separetely.The 8 kinds of the rest genes were all tested negative.The total positive rate of AMEs gene was 46.7%(14/30).In 20 strains of pan-drugresistant from Jiangsu,the positive rate of 4 kinds of genes aac(3)-Ⅱ,aac(6')-Ⅱ,aac(3")-Ⅰ,and aac(2")-Ⅰ were 55%(11/20),60%(12/20),35%(7/20)and60%(12/20),50%(10/20),45%(9/20)separetely.The 6 kinds of the rest genes were all tested negative.The total positive rate of AMEs gene was95%(19/20).Conclusions It is the first report that 16SrRNA methylases gene existed in pseudamonas aeruginosa;There was very high positive rate of AMEs genotypes in pseudamonas aeruginosa;There Was different gene from two hospitals.%目的了解我院临床分离的30株多重耐药铜绿假单胞菌中16SrRNA甲基化酶基因及氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因存在状况.方法收集山东和江苏两地医院临床分离的铜绿假单胞菌共50株(山东烟台多重耐药30株,江苏泛耐株20株),采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析6种16SrRNA甲基化酶(armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA)和6种AMEs基因aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ b、aac(6')-Ⅱ、ant(3")-Ⅰ和ant(2")-Ⅰ.结果山东烟台30株多重耐药铜绿假单胞菌中4种基因aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅱ、ant(3")-Ⅰ和ant(2")-Ⅰ的阳性株数分别为6株(20%)、14株(46.7%)、11株(36.7%)和1株(3.3%),其余8株基因均为阴性;AMEs基因总阳性率为50%(15/30).江苏20株泛耐株中6种基因rmtB、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ b、aac(6')-Ⅱ、ant(3")-Ⅰ和ant(2")-Ⅰ的阳性株数分别为11株(55%)、12株(60%)、7株(35%)、12株(60%)、10株(50%)和9株(45%),其余6株基因均为阴性;AMEs基因总阳性率为95%(19/20).结论铜绿假单胞菌存在16SrRNA甲基化酶基因为国内首次报道;铜绿假单胞菌AMEs基因携带率很高;二家医院检出酶基因种类有差别.【总页数】6页(P266-271)【作者】张玉云;吴金英;范小莉;闫博;马智刚【作者单位】Dept.of Health Protection and Prevention,Yuhuang-ding Hospital of Yantai City,Shandong Province 264000;Dept.of Health Protection and Prevention,Yuhuang-ding Hospital of Yantai City,Shandong Province 264000;Dept.of Health Protection and Prevention,Yuhuang-dingHospital of Yantai City,Shandong Province 264000;Dept.of Health Protection and Prevention,Yuhuang-ding Hospital of Yantai City,Shandong Province 264000;Dept.of Health Protection and Prevention,Yuhuang-ding Hospital of Yantai City,Shandong Province 264000;Dept.of Health Protection and Prevention,Yuhuang-ding Hospital of Yantai City,Shandong Province 264000;Dept.of Health Protection and Prevention,Yuhuang-ding Hospital of Yantai City,Shandong Province 264000【正文语种】中文【中图分类】R9【相关文献】1.多重及泛耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌医院感染调查及产碳青霉烯酶表型研究 [J], 区云枝;刘春林;韩福郎;黄德兵;关幼华2.耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药情况及其产金属酶的相关基因VIM-2的研究 [J], 马晓波;杜艳;穆玉姣;郭翀;陈端3.黏液型铜绿假单胞菌的毒力基因、产金属酶检测与耐药性研究 [J], 谢国艳;高志生;李星军;钱敏健;李小兰4.重症监护室多重耐药铜绿假单胞菌产OXA酶基因的研究 [J], 彭咏麟;杨良勇;刘立君5.ICU多重耐药铜绿假单胞菌产氨基糖苷类修饰酶基因的研究 [J], 彭咏麟; 刘立君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
黏液型铜绿假单胞菌感染实验鉴定和病例回顾分析
黏液型铜绿假单胞菌感染实验鉴定和病例回顾分析铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，Pa）在由各种原因所致的人体抵抗力低下时引起皮肤感染、呼吸道感染、泌尿道感染、烧伤感染等，亦可导致菌血症、心内膜炎、囊性纤维变性，该菌引起的慢性肺部感染占有较大的比例。
其临床表型分为黏液型及非黏液型。
黏液型铜绿假单胞菌（mucoid pseudomonas aeruginosa，mPa）与非黏液型在生长特点、致病性及药物敏感方面均存在差异。
现对我院分离的一株mPa进行回顾性分析，以此为临床诊疗提供一些帮助。
实验室鉴定一、研究对象临床微生物室分离的一株mPa，药敏试验同时采用纸片琼脂扩散法（K-B法）和肉汤稀释法（MIC法），作对照比较。
二、试剂和仪器深圳迪尔DL-96细菌测定系统及其提供的NE鉴定板条，普通公司的MH肉汤和MH琼脂平板，英国OXOID公司生产的药敏纸片，质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923均购自湖北省临检中心。
三、方法1.菌株鉴定及药敏试验取病患留取的晨痰做涂片和接种哥伦比亚血平板、含万古巧克力平板（三区划线），痰涂片一张行革兰氏染色，一张行萋-尼抗酸染色。
镜检为合格痰（上皮细胞25个/LP），未发现抗酸阳性杆菌。
平板在35℃、C02孵箱培养24h后观察，均长出水滴样菌落，在血平板的第三区，水滴样菌落>5个，半定量判定为4+，具有临床意义。
取巧克力平板上水滴样菌落分纯，第二天做氧化酶试验：阳性。
刮取黏液型菌落接种于营养肉汤，35℃孵育5h后，调节菌液浓度至0.5麦氏单位，按照试验要求接种迪尔公司提供的NE板条；无菌棉拭子蘸取MIC法多余的药敏液接种MH平板，贴药敏纸片。
35℃孵育48h判读结果。
2.结果48h后，利用迪尔DL-96细菌测定系统判读为铜绿假单胞菌（P：99.58），两种方式的药敏结果如下（以2017年更新的CLSI为判读标准）：3.比较发现哌拉西林、头孢他啶的药敏结果不相符，美罗培南的K-B抑菌圈直径过大（标准菌株ATCC27853对美罗培南的抑菌圈直径为27～33mm）。
铜绿假单胞菌的抗生素耐药性及其机制分析
铜绿假单胞菌的抗生素耐药性及其机制分析铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的革兰氏阴性杆菌，具有广泛的分布和高度耐药性。
在医疗机构中，铜绿假单胞菌感染已成为严重的问题，对于治疗该菌引起的感染，抗生素耐药性的了解至关重要。
抗生素耐药性是指细菌对抗生素的抵抗能力，常见的耐药机制包括基因突变和外源性基因的水平传递。
铜绿假单胞菌对多种抗生素呈现耐药性，包括β-内酰胺类抗生素（如氨基苄青霉素、头孢菌素等）、氨基糖苷类抗生素、大环内酯类抗生素、喹诺酮类抗生素以及碳青霉烯类抗生素。
以下将对铜绿假单胞菌的抗生素耐药性及其机制进行分析。
首先，铜绿假单胞菌的内源性抗性机制是其耐药性的基础。
该菌种具有外膜结构以及多种封闭性的药物外排泵，这些结构可以拦截或排出抗生素，阻碍抗生素进入细胞或使其失效。
此外，铜绿假单胞菌具有自由基清除系统和外泌体的产生，这些机制有助于保护菌体免受抗生素的影响。
其次，铜绿假单胞菌的耐药性还可通过激活或抑制特定的耐药性相关基因来实现。
研究发现，菌体中的多个基因（如mexAB-oprM、mexXY-oprM、nfxB和ampR）在抗生素耐药性中起到关键的调控作用。
这些基因编码的蛋白质参与了药物外排泵系统或抗生素降解酶的表达，从而使菌体对抗生素的作用降低。
此外，外源性基因的水平传递也在铜绿假单胞菌的抗生素耐药性中发挥着重要作用。
许多耐药性基因以质粒或整合子的形式存在，它们可以通过转染、共同耐药岛（Resistance Island）或转座子的介导而传递给铜绿假单胞菌。
这种方式使菌体获得多样的抗生素耐药基因，从而增加了其对不同类别抗生素的耐药性。
在临床实践中，铜绿假单胞菌的抗生素耐药性对治疗选择带来了挑战。
然而，通过深入了解其耐药机制，可以为抗生素的合理使用提供指导。
当前，一些新型抗菌药物（如环丙沙星类）在对抗铜绿假单胞菌感染中显示出较好的效果，是一种潜在的治疗选择。
铜绿假单胞菌致病机制的研究进展
铜绿假单胞菌致病机制的研究进展铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性杆菌，它可以引起各种感染疾病，特别是对于免疫系统功能低下的患者而言，其致病性更强。
铜绿假单胞菌致病机制的研究是为了更好地了解该菌种的生物学特性和致病原理，从而帮助发展新型的预防和治疗策略。
以下是铜绿假单胞菌致病机制研究的一些进展。
1. 黏附和侵入机制铜绿假单胞菌能通过鞭毛、胞外多聚物等因子在宿主上黏附并侵入细胞，其侵入机制与凝冻酶、胞外蛋白酶等多种分子因子的相互作用密切相关。
此外，它还能通过细菌表面上的外膜囊泡（OMVs）向宿主释放大量的毒力因子。
2. 毒力因子的分泌铜绿假单胞菌通过分泌多种外毒素，如细菌溶解素、外膜蛋白酶等来造成宿主细胞的损伤和溶解。
其中，热变性蛋白酶（Elastase）是其主要的外毒素之一，它可破坏宿主的胶原蛋白和弹性蛋白，导致组织坏死和细胞死亡。
3. 生物膜的形成铜绿假单胞菌能够形成生物膜，这是一种由菌体聚集形成的粘稠物质，能够保护细菌免受抗生素和宿主免疫系统的攻击。
研究发现，生物膜中的菌体能够相互交流和合作，形成复杂的群体结构，增加了抗药性和致病性。
4. 毒力调控系统铜绿假单胞菌有多种复杂的毒力调控系统，如系统共同调控因子（virulence-associated gene regulators，VgrG）、配体依赖性转录激活因子等，这些调控因子能够调节菌体的致病性和适应性，使得该菌种在宿主体内能够更好地存活和繁殖。
5. 耐药性铜绿假单胞菌对多种抗生素具有高度的耐药性，这是其致病机制研究中一项非常重要的问题。
近年来的研究表明，该菌种的耐药性主要与多重耐药泵和耐药基因的表达调控有关。
此外，铜绿假单胞菌还具有突变和水平转移等机制，使得其耐药基因能够迅速传播和适应不同的环境。
总之，铜绿假单胞菌的致病机制研究是一个复杂而重要的课题。
随着各项研究的进行，对该菌种和宿主相互作用的理解将不断深化，科学家们将不断寻找更好地预防和治疗该菌种感染的方法。
铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶及耐药性的研究
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为预防临床感染及治疗提供重要指导。 方法 ： 临床收集 ２ ０ １ ０ — ２ ０ １ ２ 年患者标本并分离培养铜绿假单胞菌 ， 菌株耐药性采用纸片扩散法进行检测 ，
而金属 Ｂ 一内酰胺酶采用双纸片协 同法检测 ，运用 聚合 酶链反应的方法检测其耐药基 因。结果 ： 在２ １ ６ 株铜绿假单胞 菌中检测出 ８ ０ 株产金
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铜绿假单胞菌的耐药性机制研究进展
铜绿假单胞菌的耐药性机制研究进展铜绿假单胞菌是一种常见的致病菌，它具有广泛的耐药性，对临床治疗和公共卫生构成了重大挑战。
为了应对这一问题，科学家们开展了大量的研究，旨在揭示铜绿假单胞菌耐药性的机制。
以下是铜绿假单胞菌耐药性机制研究的最新进展。
铜绿假单胞菌耐药性机制的研究表明，它主要包括两个方面：基因水平的变异和外源基因的横向传播。
首先，在基因水平上，铜绿假单胞菌通过基因突变或基因重排来获得耐药性。
例如，研究发现，铜绿假单胞菌中一些耐药基因的上调与药物靶点的改变密切相关。
此外，铜绿假单胞菌中的耐药性基因还可以通过点突变、插入元件、DNA修复等方式进行表达调控，从而提高对抗药物的能力。
其次，外源基因的横向传播也是铜绿假单胞菌耐药性机制的重要组成部分。
外源基因的横向传播可以通过垂直传输（传给后代）或水平传输（通过质粒转移等途径）进行。
研究发现，质粒在铜绿假单胞菌中起到了重要的传播作用，它们可以携带多种耐药基因并在不同的菌株之间传递。
此外，外源基因的横向传播还可以通过细菌间的接触，如生物膜形成和细胞共生等过程实现。
除了上述机制外，铜绿假单胞菌耐药性的研究还揭示了其他几个重要的方面。
首先，环境因素对耐药性的发展起到了重要作用。
研究发现，环境中的生长条件和压力可以诱导菌株产生耐药基因，从而提高其对药物的耐受能力。
因此，控制环境因素对耐药性的发展具有重要的临床意义。
其次，铜绿假单胞菌的生物膜形成也与其耐药性密切相关。
生物膜不仅可以为菌株提供保护，降低药物的渗透性，还可以促进基因水平的耐药基因传播。
因此，阻断生物膜形成可能是减少耐药性发展的一种策略。
最后，铜绿假单胞菌耐药性机制的研究还揭示了一系列的免疫逃逸机制。
铜绿假单胞菌可以通过改变表面抗原或减少免疫感应分子的表达来逃避宿主的免疫监测。
此外，铜绿假单胞菌还可以通过分泌外毒素或调控宿主免疫细胞的功能来干扰宿主的免疫反应。
因此，探索和研究铜绿假单胞菌的免疫逃逸机制对于治疗和预防感染具有重要的意义。
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黏液型铜绿假单胞菌的毒力基因、产金属酶检测与耐药性研究谢国艳;高志生;李星军;钱敏健;李小兰【摘要】Objective To comparison in virulence genes,metallo-β-lactanase-producing(MBLs)and drug-resistance between mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa(PAE),and provide reference for the clinical use of antimicro-bial agents.Methods All strains were identified by ATBstrip,drug-resistance by K-B method,virulence genes exoS、exoU and exoY by PCR,and MBLs by modified Hodge Test(MHT).Results Of 13 kinds of antimicrobial agents,Non-mucoid PAE were higher resistance than mucoid PAE,and were significantly higher than mucoid PAE in gentamicin, aztreonam,levofloxacin,imipenem and meropenem.The detection rates of MBLs,exoU+/exoS-/exoY-and exoU-/ex-oS-/exoY-of 6 kinds genotyopes in non-mucoid PAE were significantly higher than mucoid PAE.The detection rates of 3 kinds of virulence genes in mucoid PAE were higher than non-mucoid PAE,but they were not significant.Conclusion For avoiding non-mucoid turn into mucoid,we must select the sensitive antibiotic early and quikly to remedy PAE in-fection.%目的比较两种表型铜绿假单胞菌(PAE)毒力基因、产金属酶(MBLs)及耐药性,为临床治疗和医院感染控制提供依据.方法采用ATB鉴定系统进行菌株鉴定,筛选出两种表型菌株;纸片扩散法检测耐药性;PCR方法检测毒力基因exoS、exoU和exoY;改良Hodge试验(PAE-MHT)法检测MBLs.结果非黏液型PAE对各种抗生素的耐药率均高于黏液型,其中对庆大霉素、氨曲南、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南的耐药率明显高于黏液型;同时非黏液型MBLs阳性率明显高于黏液型;3种毒力基因阳性率黏液型均高于非黏液型,但两者比较无显著性差异;6种基因型中,除exoU+/exoS-/exoY-和exoU-/exoS-/exoY-两种基因型非黏液型明显高于黏液型外,其余四种基因型的比较无显著性差异.结论针对PAE感染,应尽早尽快选择敏感药物治疗,以免非黏液型转化成黏液型后,增加治疗难度.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2018(022)001【总页数】4页(P121-124)【关键词】毒力;铜绿假单胞菌;黏液型;毒力基因;金属β-内酰胺酶【作者】谢国艳;高志生;李星军;钱敏健;李小兰【作者单位】上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科,上海 202150;上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科,上海 202150;上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科,上海 202150;上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科,上海 202150;重庆市两江新区第一人民医院检验科,重庆401121【正文语种】中文【中图分类】R446.5铜绿假单胞菌(PAE)是医院感染的主要致病菌之一，根据其菌落形态及是否产生藻酸盐形成生物膜分为黏液型和非黏液型。
近年来黏液型PAE不断增多，其易黏附在组织黏膜上并且不易被吞噬，使其逃避机体免疫清除和增强了对抗菌药物的耐药性[1]，常出现体外药敏结果与临床治疗不一致的现象，而产金属β-内酰胺酶(MBLs)且携带毒力基因的黏液型PAE菌株的不断增多，更给临床治疗带来更大的难题。
PAE致病机制与Ⅲ型分泌系统(T3SS)密切相关[2]，T3SS主要分泌ExoS、ExoT、ExoY、ExoU 4种毒素，exoU和exoY具有快速而独特的细胞毒作用，危害最大，exoS和exoT基因感染相对较轻，而ExoT是所有菌株都会产生的，因此本研究拟分析两种表型PAE的毒力基因exoS、exoU、exoY的携带情况、MBLs的流行及耐药情况，为本地区临床诊断治疗提供帮助。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株来源收集自我院2014年6月至2016年11月临床非重复分离的200株PAE(筛选出82株黏液型和118株非黏液型菌株)，菌株经ATB细菌鉴定仪进行菌种鉴定，以甘油肉汤-20℃保存备用。
铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC70063购自上海市临检中心。
1.1.2 仪器及试剂 ATB细菌鉴定仪与ID 32 GN鉴定板(法国梅里埃)、7000型荧光定量PCR扩增仪(美国Applied Biosystems)、凝胶成像系统(美国BIO-RAD)、MH琼脂平皿(上海科玛嘉)、药敏纸片(英国OXOID)；引物和探针及测序由上海生工公司完成。
1.2 方法1.2.1 细菌鉴定及药敏试验采用ATB细菌鉴定仪进行菌种鉴定。
表型分型则选取生长缓慢(35℃培养48 h后血平板可见湿润、透明似小水滴样、黏稠，麦康凯平板上形成无色半透明、嵌入培养基中不易挑起的黏液状菌落)，进一步氧化酶阳性、挑丝试验阳性者判定为黏液型PAE[3]。
采用纸片扩散法进行药敏试验[4]，铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控菌株。
1.2.2 MBLs检测改良Hodge试验(PAE-MHT)法[5]。
1.2.3 毒力基因的检测根据参考文献[6,7]设计引物(由上海博亚公司合成)。
细菌DNA的制备采用煮沸裂解法，取上清液2 μl用于PCR扩增。
PCR反应体积为50μl，包括25 mmol/LMgCl24 μl，10×PCR缓冲液5 μl，上、下游引物各0.5 μl，dNTP 1 μl，Taq酶3 μl，模板2 μl，无菌蒸馏水34 μl，石蜡油覆盖。
扩增条件：94℃5 min；续以94℃30s；exoS、exoY和exoU退火温度分别为55℃、55℃和59℃，30 s；72℃1 min,35个循环；72℃延伸5 min。
取5 μl PCR产物采用20 g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析。
未加模板的无菌蒸馏水作为阴性对照。
毒力基因引物序列和目的产物长度见表1。
PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察分析结果。
选取扩增阳性产物纯化后测序，结果与GeneBank中已知序列对比分析。
表1 引物序列表目的基因引物序列产物大小(bp)参考文献exoSP15’-CCGGCATTCACTACGCGG-3’573[6]P25’-GTTCGTGACGTCTTTCTTTTA-3’exoUP15’-GGGAATACTTTCCGGGAAGTT-3’428[6]P25’-CGATCTCGCTGCTAATGTGTT-3’exoYP15’-CGGATTCTATGGCAGGGAGG-3’289[7]P25’-GCCCTTGATGCACTCGACCA-3’1.2.4 统计学分析用SPSS 13.0软件进行。
组间比较采用χ2检验，以P<0.05为有统计学意义。
2 结果2.1 两种表型的菌落对15种抗生素的耐药情况见表2。
表2 不同表型对13种抗生素的耐药情况(%)抗菌药物黏液型(n=82)非黏液型(n=118)P值阿米卡星16.218.3>0.05庆大霉素10.526.3<0.05哌拉西林35.246.1>0.05头孢他啶21.629.8>0.05头孢哌酮21.526.7>0.05氨曲南41.167.6<0.05亚胺培南4.814.4<0.05左氧氟沙星22.648.4<0.05美罗培南2.411.6<0.05哌拉西林/三唑巴坦8.311.6>0.05头孢哌酮/舒巴坦7.510.6>0.05头孢吡肟11.314.6>0.05妥布霉素02.6>0.052.2 MBLs检测 PAE-MHT法检测200株PAE，其中82株黏液型阳性率为3.7%(3/82)，118株非黏液型阳性率为13.6%(16/118)，非黏液型MBLs阳性率明显高于黏液型(P<0.05)。
2.3 毒力基因检测 PCR扩增82株黏液型的exoS、exoU、exoY，阳性率分别31.6%，12.7%，72.3%；118株非黏液型的exoS、exoU、exoY，阳性率分别23.3%，8.2%，65.1%。
黏液型与非黏液型3种毒力基因阳性率均无显著性差异(P>0.05)。
几个毒力基因电泳图谱见图1。
2.4 基因型的分布共存在6种基因型，两种表型菌株的基因型比较见表3。
3 讨论T3SS是PAE致病性的重要毒力系统，其中exoS和exoU的临床意义尤为重要，Hauser等[8]研究显示，exoU+为细胞毒型基因，表达蛋白exoU引起细胞坏死、凋亡，危害最大；exoS+为侵袭型基因，是PAE在感染过程中实现增殖和传播的主要毒力因子，表达蛋白exoS能抑制宿主细胞吞噬作用、破坏肌动蛋白细胞骨架重排、导致细胞凋亡和抑制细胞分裂等，感染相对较轻；exoU+基因型的PAE毒力更强，感染后症状更严重，患者病死率更高。
本研究共检测3种毒力基因，获得6种基因型。
3种毒力基因阳性率黏液型均高于非黏液型，但两者比较无显著性差异；比较两种表型的6种基因型，除exoU+/exoS-/exoY-和exoU-/exoS-/exoY-两种基因型非黏液型明显高于黏液型外，其余四种基因型的比较无显著性差异。
未发现三种基因同时存在或exoU、exoS这两种基因同时存在的菌株，与exoS和exoU具有排它性、不同时存在于同一菌株的结论[9]相吻合。
注：M为DNA Marker(DL 1000)；3为阴性对照；5为阴性株；1，4为exoY基因阳性分离株；2，7，8为exoU基因阳性分离株；6为exoS基因阳性分离株。