微生物学实验指导(10.10)
微生物实验指导书-教材
微⽣物实验指导书-教材微⽣物学实验指导书⽬录实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术 (3)实验⼆培养基的配制 (8)实验三从⼟壤中分离微⽣物及纯化 (11)实验四微⽣物的接种技术 (14)试验五细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察 (17)实验六细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊ (20)实验七⼤肠杆菌⽣长曲线的测定 (23)实验⼋实验室环境和⼈体表⾯微⽣物的检查 (25)实验九乳酸菌的检测 (28)实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术【⽬的要求】1. 学习并掌握棉塞制作的⽬的、原理及⽅法；2. 学习并掌握玻璃器⽫清洗及包扎⽅法；3.掌握⾼压蒸汽灭菌的基本原理及操作⽅法。
4.了解其它常⽤消毒灭菌技术原理及技术【基本原理】棉塞的作⽤有⼆：⼀是防⽌杂菌污染，⼆是保证通⽓良好。
因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较⼤的影响。
微⽣物学实验所⽤的器⽫，⼤多数要进⾏清洗、消毒、灭菌，才能⽤来培养微⽣物。
玻璃器⽫的包扎⽅法正确合理，在使⽤过程中才能有效防⽌杂菌的污染。
玻璃器⽫包扎好后，⼀般⽤⾼压蒸⽓灭菌法进⾏灭菌。
⾼压蒸⽓灭菌是将待灭菌的物品放在⼀个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的⽔沸腾⽽产⽣蒸⽓。
待⽔蒸⽓急剧地将锅内的冷空⽓从排⽓阀中驱尽，然后关闭排⽓阀，继续加热，此时由于蒸⽓不能溢出，⽽增加了灭菌锅内的压⼒，从⽽使沸点增⾼，得到100℃以上的⾼温，导致菌体蛋⽩质凝固变性⽽达到灭菌的⽬的。
此外，常见灭菌⽅法还有⼲热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。
对空间灭菌常使⽤甲醛加⾼锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌⽅法。
【实验⽤品】棉花，试管，培养⽫，纱布，三⾓瓶，棉线，量筒，⽜⽪纸（或旧报纸），LDZX-50KBS ⽴式⾼压蒸⽓灭菌锅，常⽤灭菌⽤具、药剂等等。
【⽅法步骤】⼀、棉塞的制作正确的棉塞要求形状，⼤⼩，松紧与试管⼝（或三⾓瓶⼝）完全适合，过紧妨碍空⽓流通，操作不便；过松则达不到滤菌的⽬的。
制作过程见图1，包括取棉花、整理、折⾓、卷紧、成形、塞试管等步骤。
医学微生物学试验指导
（１）观察４号标本荚膜的特点，如大小、颜色、与菌体的关系。
（２）观察５号标本鞭毛的特点，如鞭毛的形态、数目及位置。
（３）观察６号标本芽胞，注意芽胞的形状、颜色及位置。
３、左眼观察标本的同时，右眼将图画在实验报告纸上，并加以适当地描述。
四、实验报告
图示细菌基本形态及特殊结构，并加以适当描述。
相差显微镜人的肉眼，只在光波的波长（颜色）和振幅(亮度)有变化时才能看到被检物体。因活的生物体多为无色透明，光波通过时，波长和振幅均不发生变化，故普通显微镜检查很难观察清楚；用暗视野检查也只能看到发光的菌体外形，看不清内部结构。相差显微镜能弥补这两种方法的不足。其原理是利用被检物体的光程(折射率与厚度的乘积)之差进行镜检。如被检物体与媒质之间，或被检物体各部分的折射率或厚度不同，或双方都不同，光线通过时引起光相的差异；相差显微镜通过相差板的光栅作用，改变了直接光的光相和振幅，将光相的差异转换成光的强弱的差异使细胞某些结构比其它部分深暗，衬托出鲜明的对此。因此，这种方法不仅不需要标本的染色，还能充分利用物镜的镜口率，是做活体标本检查最好的方法。
内容：一、悬滴法
二、压滴法
三、暗视野显微镜检查法
一、实验目的与原理
了解细菌动力的显微镜检查法，观察有鞭毛与无鞭毛菌运动的特点。
有鞭毛的细菌运动称真正运动或固有运动，其特点是细菌从一个地方游到另一个地方，可以改变位置，无鞭毛的细菌运动叫布朗运动，特点是不能改变位置，只在局部闪动，是因液体分子的冲击，致使细菌在局部颤动，这种运动也称分子运动。
二、实验方法及实验结果
（一）悬滴法
１、材料
（１）菌种：变形杆菌、葡萄球菌８－１２小时幼龄培养物。
（２）凹玻片、盖玻片、凡士林。
微生物学实验指导(10.10)
实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色一、实验目的和内容（一）实验目的1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。
2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤（二）实验内容1．学习油浸系物镜的使用方法。
2．制作细菌染色装片。
3．进行革兰氏染色法操作。
4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。
二、实验原理（一）油镜的基本原理普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。
油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。
油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。
在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。
图1-1 显微镜物镜参数图显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。
D值愈小表明分辨率愈高。
D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。
数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。
影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。
当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。
当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。
（二）革兰氏染色革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
(完整版)微生物学实验指导书
03微生物在自然界和人类生活中的作用阐述微生物在生态系统、工业生产、医疗卫生等领域的重要性。
01微生物的定义与分类包括细菌、真菌、病毒等微生物的基本概念和分类方法。
02微生物的生物学特性介绍微生物的形态、结构、生理生化特性等。
微生物学概述01实验室安全制度包括实验室安全守则、危险标识识别、紧急情况下的应对措施等。
02实验操作规范介绍实验前准备、实验过程中的操作规范、实验后清理等注意事项。
03生物安全阐述生物安全的概念、生物安全级别的划分及相应防护措施。
实验室安全与规范介绍显微镜的种类、使用方法和维护保养。
显微镜介绍离心机的类型、使用方法和维护保养。
离心机阐述培养箱和摇床的工作原理、使用方法和注意事项。
培养箱与摇床包括分光光度计、电泳仪、PCR 仪等设备的简要介绍和使用方法。
其他常用设备常用仪器与设备实验报告格式包括标题、作者、摘要、正文、结论、参考文献等部分的撰写要求。
数据处理与图表制作介绍数据处理的方法、图表的制作规范及注意事项。
实验结果分析与讨论阐述实验结果的分析方法、讨论实验结果的合理性及可能存在的问题。
实验报告提交与评审说明实验报告的提交方式、评审标准及相关注意事项。
实验报告撰写要求03根据实验需求，选择适当的培养基类型，如营养琼脂、马丁氏琼脂等。
选择合适的培养基按照培养基配方准确称量各成分，加入蒸馏水或去离子水，加热溶解后调整pH 值。
配制培养基将配制好的培养基分装到试管、培养皿等容器中，采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法进行灭菌处理。
培养基分装与灭菌培养基制备与灭菌微生物接种与培养接种前准备准备好无菌操作台、无菌接种环、酒精灯等接种工具，确保无菌操作环境。
微生物接种采用划线法、倾注法等方法将待测微生物接种到培养基上。
培养条件设置根据微生物的生长需求，设置好培养温度、湿度和光照等条件。
观察前准备准备好显微镜、载玻片、盖玻片等观察工具，确保无菌操作环境。
微生物形态观察通过显微镜观察微生物的形态、大小、排列方式等特征，记录并描述观察结果。
微生物学实验指导
微生物实验守则微生物学实验的目的是：加深对微生物学理论知识的理解；扎实掌握实验的基本操作，并牢固建立无菌操作的概念；培养学生认真观察、发现问题、分析问题和解决问题的工作能力；树立学生实事求是、严肃认真的科学态度和勤俭节约、协作攻关的优良作风。
为了提高教学效果，保证实验质量和实验室安全，特提出如下注意事项。
1.每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验的目的、原理和方法，熟悉实验操作中的主要步骤和环节。
2.非必要的物品不要带入实验室，必须带进的物品应放在不影响实验操作的地方。
3.实验时认真听教师的讲解，仔细观察示范操作。
4.许多微生物有潜在的致病能力。
实验中要严格无菌操作，以免培养的微生物进入外界环境，并保证所培养的微生物不受污染。
①实验室内严禁餐饮。
②实验前洗手并用酒精棉球擦拭手和台面。
③实验操作过程中，要严格进行无菌操作，以防止菌体间交叉感染或致病菌对人体造成危害。
④在进行接种操作时，要关闭门窗，以防止空气对流，要尽量减少走动和讲话，以防止尘埃飞扬和唾沫四溅。
⑤用过的带菌吸管、滴管、玻片、涂布棒和移液器枪头等，用酒精或来苏尔等浸泡以后再进行清洗。
⑥离开实验室之前要用肥皂洗手。
⑦实验室中的菌种和物品等，未经教师允许，不得携带出实验室。
凡需进行培养的材料，都应注明菌种名、接种日期、处理方法及操作者姓名（或组别），放在制定的培养箱中进行培养。
5.如发生培养菌的器皿打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况时，应立即报告指导教师，及时处理，菌液污染实验台面或其他物件时，应及时用3％的来苏尔或5％的石炭酸液擦拭消毒。
6.爱护仪器、设备，严格按照操作规程使用仪器、设备，以确保仪器的安全和学生的人身安全，并做好使用记录，确保仪器的正常使用。
7.按时观察实验现象，认真及时的做好实验记录，对于当时不能得到实验结果而需要连续观察的，则需记下每次的实验结果，以便分析。
清晰填写实验报告作业，科学阐述实验结论。
8.节约水、电，适量取用药品等耗材。
微生物学实验指导
实验一：微生物形态观察实验学时：2实验类型：验证实验要求：选修一、实验目的1．巩固和掌握显微镜油镜的正确使用；2．学习细菌制片和单染色技术；3．观察几种微生物的基本形态。
二、实验内容熟悉掌握显微镜的结构及油镜的使用方法。
掌握几种微生物（枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、单细胞藻、原生动物等）的形态。
三、实验原理、方法和手段1．原理：细菌的涂片和染色是微生物实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能清楚地观察到其形态和构造。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染科和中性染料三大类。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合，因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的培养基中时常带负电荷．所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合，当细菌分解糖类产酸使培养基PH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
中性染料是前两者的结合，又称复合染料，如伊红美蓝和伊红天青等。
简单染色法即仅用一种染料使细菌着色。
此法虽操作简便，但一般只能显示其形态，不能辨别其构造。
染色前必须先固定细菌。
其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上，二是增加其对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
四、实验组织运行要求采用集中授课形式。
五、实验条件(1)菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)原生动物：盾纤毛虫单细胞藻类：盐生杜氏藻(2)仪器：显微镜。
(3)染色液：草酸铵结晶紫或石炭酸复红。
(4)材料：载玻片，擦镜纸．二甲苯．香柏油和玻片搁架等。
六、实验步骤1 涂片在洁净无油腻的玻片中央放一小滴水(或用接种环桃1—2环水)，用无菌的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀．涂成极薄的菌膜。
微生物学实验指导MICROBIOLOGYEXPERIMENT微生物学实验指导微生物学实验
接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，让温度逐渐上升。当温度升至 100℃时，关闭排气孔。调节温度控制器旋钮，直至箱内温度达到所需要温度（ 160～170℃）位置会自动控制调节温度，保持此温度 2h。注意不可再拨动调节旋钮和通气孔 。
4．降温
切断电源、自然降温。
干热灭菌的原理
• 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固 变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与 其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细 胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水 量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热 灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～ 2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器 皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
塞有棉花的吸管：用水将棉花冲出，然后冲洗 吸过含有微生物培养物的吸管：2%来苏尔或0.25%新洁尔灭 消毒液中浸泡24小时然后洗 吸管内壁有油垢：洗涤液中浸泡数小时，再冲洗
培养皿的包扎： 牛皮纸或旧报纸包紧，一般以5～8套培养皿包成1包
吸管的包扎： 1 在上端约0.5cm处，塞入一小段1.5 cm长的棉花（勿用
三、实 验 器 材
玻璃仪器： Ａ每人: 培养皿 4套； 大试管 4只。 Ｂ每组：三角瓶 5只； 烧杯（500ml）1只； 烧杯（1000ml）1只； 中试管 7只； 吸管（ 0.5ml 3支，5ml 2支）共5支
洗涤用品： 去污粉、肥皂、清洗剂、毛刷等。
包扎用品：棉花、扎绳、包扎纸等。
四、实验步骤
• 掌握对玻璃器皿的清洗、包扎方法与干 热灭菌的操作过程。
二、实验原理
• 微生物学实验要求较高的无菌状态，因此， 实验所用的器皿，大多数要进行消毒、灭 菌从而用以培养微生物，所以对其质量、 规格、洗涤和包扎方法均有一定要求。清 洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决 条件，包扎方法要能保证防止污染杂菌。 空的玻璃器皿一般用干热灭菌.
微生物实验指导
实验一微生物培养基的配制和灭菌培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。
它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件：(1)适当组分和比例的营养物质；(2)适宜的pH值；(3)合适的渗透压；(4)保持无菌状态。
所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。
培养基的配制是微生物工作者的主要技术操作之一。
一、实验目的与耍求：1．了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
2．了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3．熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。
二、实验原理与材料：(一) 培养基的种类根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。
天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。
从培养基的物理状态来分：液体培养基：不加凝固剂。
固体培养基：在液体培养基中加2％左右的凝固剂。
半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％一0.5％凝固剂。
微生物最常用的凝固剂为琼脂(其次为明胶)，又叫洋菜、冻粉。
它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。
琼脂是从海藻中(主要是石花菜)提取而制成的。
是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96℃以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃以下，又凝固为固体。
表3-1 琼脂与明胶特性比较（二）实验材料1．药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂；马铃薯，蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KN03，MgS04·7H20、FeSO4·7H20、等。
2．高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌。
3．其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。
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4．停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
注意：当压力不为零时，不能开盖取物否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。
（二）高压蒸汽灭菌
1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。
2．放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装得太挤，以免妨碍汽流通影响灭菌效果，三角瓶口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋温包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个棉栓，使螺栓松紧一致，，勿使漏气。
三、材料与仪器
（一）菌种
大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、青霉菌
（二）缓冲葡萄糖肉汤培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤半固体培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基试管斜面；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基平板；察氏培养基试管斜面；察氏培养基平板。
（三）接种环、接种针、接种钩。镊子、酒精灯、火柴、酒精棉、试管架、浆糊、标签纸、恒温培养箱等。
（六）显微镜用后处理
1、上升镜筒，取下载片。
2、用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。
4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。
微生物学实验指导书
微生物学实验指导书生物技术教学部初立业编重庆邮电学院生物信息学院2003年12月30日前言一、本课程的性质和任务微生物学实验是生物学重要的基础课之一，特别是随着分子生物学的发展与拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。
此外，医学、农学、林学等学科，甚至地质学、太空学等也需微生物的方法与技术。
因此，熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。
无菌操作技能和无菌概念的建立是微生物学实验中最重要的内容，微生物学实验课主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。
与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。
提高学生分析问题和解决问题的能力。
根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。
二、教学要求与教学方法1.教学要求1)注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的倾向；2)实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤；3)在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象；4)树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间的密配合。
2.教学方法1)以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示；2)对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与理论知识有机结合；3）根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意思；4）严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练。
三. 教学学时分配与安排本课程按每周3学时安排，共6个实验，总学时18。
目录实验一细菌的革兰氏染色 (3)实验二根霉、酵母菌形态结构的观察 (4)实验三培养基制备 (6)实验四灭菌与消毒 (9)实验五微生物的分离和纯化 (12)实验六微生物的生理生化反应 (14)实验七水中细菌总数的测定 (19)实验八放线菌形态的观察 (21)实验九细菌的芽胞染色 (22)实验十微生物菌种保藏 (24)实验一细菌的革兰氏染色法实验目的：1．学习并初步掌握革兰氏染色法。
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实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色一、实验目的和内容（一）实验目的1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。
2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤（二）实验内容1．学习油浸系物镜的使用方法。
2．制作细菌染色装片。
3．进行革兰氏染色法操作。
4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。
二、实验原理（一）油镜的基本原理普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。
油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。
油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。
在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。
图1-1 显微镜物镜参数图显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。
D值愈小表明分辨率愈高。
D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。
数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。
影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。
当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。
当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。
（二）革兰氏染色革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
三、实验材料和用具1. 菌种大肠杆菌(Escherichia coli)、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)。
2. 试剂革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等）、香柏油、二甲苯。
3. 仪器及用具显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。
四、操作步骤(一) 细菌的革兰氏染色1. 制片（1）涂菌用无菌操作方法从平板中沾取菌苔一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1 cm的菌膜。
涂菌后将接种环火焰灭菌。
（2）干燥于空气中自然干燥。
亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥（温度不宜过高）。
（3）固定将细菌涂片向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。
目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色。
2. 染色（1）初染于制片上滴加结晶紫染液，染1 min后，用水洗去剩余染料。
（2）媒染滴加卢戈氏碘液，1 min后水洗。
（3）脱色滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30 s 至1 min)，立即水洗。
（4）复染滴加石炭酸复红液复染1 min，水洗。
（5）镜检用滤纸吸干，油镜镜检。
（二）镜检1. 观察前的准备（1）将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4 cm。
坐正。
（2）调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。
观察染色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。
2. 低倍镜观察染色装片首先上升镜筒，将细菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至装片0.5 cm处，适当缩小光圈，然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下降）至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。
移动装片，把合适的观察部分移至视野中心。
3. 高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。
再用目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。
用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。
将最适宜观察部分移至视野中心，绘图。
不要移动装片位置，准备用油镜观察。
4. 油镜观察（1）提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。
在玻片标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。
（2）从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。
（3）将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，直至视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。
如因镜头下降未到位或镜头上升太快未找到物像．必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。
仔细观察并绘图。
（4）再次观察，提起镜筒，换上另一块细菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察。
绘图。
重复观察时可比第一次少加香柏油。
5. 镜捡完毕后的工作（1）移开物镜镜头。
（2）取出装片。
（3）清洁油镜油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯，擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。
（4）擦净显微镜，将各部分还原；将接物镜呈“八“字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。
最后套上镜罩，对号放入镜箱中，阴凉干燥处存放。
(三) 结果革兰氏阳性菌染成蓝紫色, 革兰氏阴性菌染成淡红色。
五、注意事项1．细菌涂片务求均匀．切忌过厚。
2．在染色过程中，不可使染液干涸。
3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。
4．老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。
5．使用油镜必须先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察的程序操作；6．下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作．以免压碎玻片而损坏镜头。
7．使用二甲苯擦镜头时，二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。
8．注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。
六、实验报告1. 分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率。
2. 记录革兰氏染色法步骤，并进行结果分析。
七、问题和思考1．涂片后为什么要进行固定，固定时应注意什么?2. 用油镜便于观察细菌的依据是什么?3．使用油镜应特别注意哪些间题？4．当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求?实验二放线菌、酵母菌和霉菌的形态观察一、实验目的和内容（一）实验目的1. 辨认放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的形态，学习放线菌的观察方法。
2. 了解酵母菌形态结构。
3. 了解霉菌形态，掌握微生物载玻片湿室培养方法。
（二）实验内容1. 用插片法和水封片法观察放线菌的形态特征。
2. 观察酵母菌的个体形态和假菌丝。
3. 曲霉、青霉、根霉形态观察。
二、实验原理放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的革兰氏阳性细菌，常见放线菌大多能形成菌丝体。
紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝（简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝（简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。
有的放线菌只产生基丝而无气丝。
在显微镜下直接观察时，气丝处在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。
孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。
在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。
能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。
通过设计各种培养和观察方法如插片法、搭片法、玻璃纸法、印片法等，可保持放线菌自然生长状态下的形态特征，便于观察上述3种菌丝和孢子。
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，通常比常见细胞大几倍甚至十几倍。
大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。
用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。
因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。
霉菌可产生分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。
霉菌菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，可用低倍显微镜观察。
霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。
霉菌自然生长状态下的形态，常用载玻片观察；此外，为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。
三、实验材料和用具1. 菌株细黄链霉菌（Streptomyces micuoflavus）（又称5406），棘孢小单孢菌（Micromonuspora echinospora），酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），热带假丝酵母（Candida tropicalis），产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黑根霉（Rhizopus nigricans）。
2. 试剂0.1％美蓝染色液、石炭酸复红染色液、0.05％美蓝染色液（以pH6.0的0.02 mol/L磷酸缓冲液配制）、碘液、0.04％的中性红染色液、5％孔雀绿，0.5%沙黄液、95％乙醇、乳酸苯酚固定液、棉蓝染色液、20％甘油。
3. 仪器及用具盖玻片、载玻片、镊子、接种环、显微镜、涂布器、玻璃纸、打孔器。
透明胶带、剪刀、圆形滤纸片、细口滴管、镊子。
四、操作步骤(—) 放线菌的形态观察1. 观察自然生长状态的放线菌用镊子小心取出用插片法培养的5406菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净，然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，分别用低倍镜、高倍镜观察, 找出3类菌丝及其分生孢子。