生殖毒性试验流程及意义
8-2 生殖毒性及其评定
第二节生殖毒性及其评定一、生殖毒性表现外来化合物对生殖过程的损害作用可以表现为性淡漠、性无能或各种形式的性功能减退。
雌性可出现排卵规律改变、月经失调或闭经、卵巢萎缩、受孕减少、胚胎死亡、生殖力降低、不孕或不育等。
雄性可表现为睾丸萎缩或坏死、精子数目减少等。
二、生殖毒性作用的评定外来化合物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行，过去也称为繁殖试验。
生殖毒性试验可以全面反映外来化合物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断奶后生长发育可能发生的影响。
评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育情况（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。
此外还可同时观察出生幼仔是否有畸形出现，但畸形观察主要在发育毒性评定中进行。
（一）试验方法原则生殖毒性试验多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔。
大鼠自然受孕率较小鼠为高，较为理想。
一般设三个剂量组，另设对照组。
最高剂量组剂量应该超过预期人类实际接触水平，希望能使亲代动物出现轻度中毒，但不出现死亡或死亡率不超过10%，也不能完全丧失生育能力。
低剂量组的亲代动物不应观察到任何中毒症状。
另设中间剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。
中间剂量与高剂量和低剂量应呈等比级数。
最高剂量组轻度中毒的概念是进食量显著减少，体重明显下降。
要求最高剂量组出现轻度中毒的目的是表明在已能引起中毒剂量下，如仍不致影响正常生殖过程，则表示该受试物确实不具有生殖毒性作用。
反之，如剂量过低，则难于确定受试物是否确实不具有生殖毒性，有可能因剂量不足，未达到最小有作用剂量。
剂量的确定可用少数动物进行预试，如已进行过亚慢性和急性毒性试验，则最高剂量也可略高于亚慢性毒性试验中最大无作用剂量，或相当于LD50的1/10左右。
最低剂量可相当于最高剂量的1/30。
如经多次试验确实证实1 000mg／kg体重剂量对生育力无损害作用，或最高剂量可引起亲代动物表现一般毒性作用，但对生育力无不利影响，则可不进行其它剂量试验。
食品毒理学--第八章--生殖毒理学精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版第八章生殖毒理学和发育毒理学第一节概述一、哺乳动物的繁殖过程--生殖发育过程，是哺乳动物繁衍种族的生理过程生殖发育其中包含生殖细胞发生，即精子发生和卵细胞发生、配子的释放、性周期和性行为、卵细胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或着床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生（或称器官形成）、胎仔发育、分娩和哺乳过程、直至性成熟的整个过程。
二、外源化学物对生殖发育的影响➢干扰生殖发育的任何环节并造成损害作用。
➢可以通过对内分泌系统特别是对性腺的作用，发生间接的影响。
➢神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下丘脑-垂体-睾丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴)两条途径作用于生殖发育过程。
外源化学物对生殖发育损害作用的特点➢生殖发育过程较机体其他系统更为敏感➢外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远➢生殖毒理学(reproductive toxicology)主要研究外源化学物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害作用及其评定，评定方法即为生殖毒性试验。
➢发育毒理学(developmental toxicology)主要研究外源化学物对胚胎发育、胎仔发育以及出生幼仔发育的影响及其评定，评定方法称为发育毒性试验，其中主要为致畸试验。
第二节生殖毒性及其评定一、生殖毒理学历史。
二、生殖毒性外源化学物对生殖的过程的损害作用可以表现为性淡漠，性无能或各种形式的性功能减退。
雌性可出现排卵规律改变，月经失调或失经，卵巢萎缩，受孕减少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等；雄性可表现为睾丸萎缩或坏死，精子数目减少。
1、外源化学物的雄性生殖毒性对睾丸生精细胞的影响对内分泌功能的影响对性功能和生殖功能的影响1）对睾丸生精细胞的影响●棉酚影响睾丸功能的典型外源化学物CS2 工业污染物引起睾丸萎缩，精子生成障碍；对生殖细胞有致突变作用。
●重金属铅、镉、汞、锰等损害形态、功能，如精子畸形率↑、精子数和精子活动率↓●农药生精↓、精子畸形率↑、睾丸萎缩、性功能减退等2）对内分泌功能的影响精子数目、精子的发育成熟、活动率、活动能力等3）对性功能和生殖功能的影响性欲功能降低、阳痿、雄性不育等2、外源化学物的雌性生殖毒性●对卵细胞的影响●对内分泌的影响●对子代生长发育的影响环境因素尤其是化学物工业污染物、农药、重金属、毒素等三、生殖毒性的评价外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行。
生殖毒性试验与评定
确定是否受孕的方法是每日清晨进行雌性动物阴道涂片， 检查有无精子；亦可检查阴道有无阴栓出现，以确定受精 日期。小鼠阴栓可在阴道口存留较长时间，但在大鼠极易 脱落，次晨检查时往往在笼下粪便盘中检出。发现阴栓或 检出精子，即为受孕0日，也有作为受孕第1日。
亲代动物（F0）所生仔鼠为第一代（F1）。出生后应检查每窝幼仔数、死 亡数以及肉眼可见幼仔畸形。出生后第4天和第21天逐个称取重量，仔鼠 断奶后，母鼠休息10天，再与雄鼠交配一次，并生出第二窝仔鼠，亲代共 生出仔鼠两窝，分别为F1a和F1b。F1b出生后，将雄性亲鼠淘汰，雌性亲 鼠继续喂受试物，直至F1b出生后21天断奶为止。F1a断奶后观察其发育情 况，不再喂受试物。F1b断奶后，继续接触受试物8 ～12周，直到性发育 成熟，选出雌雄各16～20只，按前法进行交配。F1b所产第一窝幼仔为F2a， F2a断奶后，其母鼠F1b休息10天，再次交配，所生幼仔为F2b，F2b断奶后， 将F1b淘汰。F2b交配处理方法与F1b相同。但F2b也可只交配一次，所产仔 鼠为F3a，不再进行第二次交配，试验结束。
F0（断奶或出生８周）
第一次交配 第二次交配
给予受试物8到12周
F１a
观察三个月，喂饲普通 饲料，观察其生长发育
情况
F２a
观察三个月，喂饲普通饲 料，观察其生长发育情况
F１b
断乳后给予受试 物８到１２周
F２b 断乳后给予受试
物８到１２周
F３a
F３b
2．两代一窝和一代一窝生殖试验
近年来许多国家与机构多规定采用两代一窝或一代一 窝试验法。 两代一窝生殖试验法基本程序与三代两窝试验法相同， 但只进行到第二代F2，每代只交配一窝。
发育毒性研究的目的是通过计数胚胎或胎仔 吸收或死亡数，测量胎仔的重量和性别比， 检查外观、内脏和骨骼的形态，来识别受试 物有无对胚胎或胎仔的致死、致畸或其他毒 性作用。
09生殖毒性作用081215
二、评价方法
生殖毒性试验是以阐明外来化合物对整个生殖过程是否 产生影响为目的而进行的试验。 采用病理生理、细胞遗传、组织形态、生物化学、内分 泌学等学科的基本原理，从不同角度观察外来化合物对正常 生殖功能的影响，它们彼此联系，互为补充。
（一）三段生殖试验（three segment reproduction test） 一阶段试验 检测对生殖能力、早期胚胎发育的影响。 在动物交配前给药 大鼠 雄性给药60天 （精子发生周期） 雌性给药14天 （卵子成熟周期）
（二）对性功能、排卵、受精及着床的影响 氯化汞给予刚出生雌性大鼠，发现汞沉积在卵巢的巨噬 细胞、粒细胞，导致动情周期紊乱，间情期延长。 镉、汞、镍 影响下丘脑－垂体功能，进而排卵受阻。
（三） 结 局 不育、流产、畸形。 原因：配子形成受阻；抑制受精；抑制孕卵发育、着床；胚 胎发育不良；生殖细胞突变。
血睾屏障（blood testis barrier，BTB）
组成：以支持细胞的紧密连接为主要结构，此外还包括 曲精小管基膜和其外面的结缔组织及毛细血管壁等。 作用：限制血液内大分子物质进入曲精小管的管腔，使 进行减数分裂的生精细胞处于适宜的微环境，避免与血源性 有害物质接触，有利于其分化发育。
作用机理
1960－1962 反应停(thalidomide)灾难事件 1961年，怀疑短肢畸形与妊娠母亲服用反应停 有关。经调查发现，每位生有短肢畸形的母亲，均 在妊娠第3～8周时服用了反应停（一次 50mg 亦可 引起胎儿畸形）。
生殖毒理学（reproductive toxicology） 生殖毒理学 指研究外来化合物损害生殖过程的机制、规律 及其毒作用对后代影响的学科。 生殖毒性（reproductive toxicity） 生殖毒性 指外来化合物对生殖系统产生损害的能力。它 包括：生育力与一般生殖行为、致畸形、孕后期与 哺乳期。广义的生殖毒性涉及对亲代（父母双方） 和对子代（胚胎、胎儿和新生儿）的损害。
食品安全国家标准生殖毒性试验(三)
食品安全国家标准生殖毒性试验（三）三代生殖毒性实验法暗示图见图3。
图3 三代生殖毒性实验暗示图4.5.4 亲代、一代、二代、三代繁殖实验 4.5.4.1 亲代、一代、二代、三代繁殖实验可参考4.5.2.2,4.5.2.3举行。
4.5.4.2 按照状况可繁殖两窝以上。
5 观看指标 5.1 对试验动物做全面的临床检査,记录普通健康情况、受试物的全部的毒性和功效作用所产生的症状、相关的行为转变、分娩困难或延迟的迹象、全部的毒性体征及死亡率,通过每日检查(F0，F1代雌鼠)阴道和子宫颈以及雌鼠的发情周期有无异样。
5.2 F0、F1代和F2代动物在赋予受试物的第1天称重，以后每周称重2次,母鼠应在受孕的第0天、第7天、第14天和第21天称重,在哺乳期应同时称仔鼠的窝重。
5.3 在交配前及受孕期,记录每周摄食量,如经饮水赋予受试物,还应记录每周饮水量。
5.4 实验结束时,按照实验设计,各代雄鼠均应对附睾的精子举行检查,对精子的外形、数量以及活动能力举行评价。
精子的活动能力和精子形态,可只检查对比组和高剂量受试物组的各代雄鼠,每只动物起码检查200个精子。
5.5 在分娩后(哺乳0d)应尽快检查记录每窝仔鼠的数量、性别、死产数、活产数及肉眼可见的异样,在诞生当天死亡的,应尽可能检查其缺陷和死亡缘由。
记录活产数量、性别，并在诞生当天对单个活产仔鼠称重,此后在哺乳期的第4天、第7天、第14天和第21天，以及阴道开放或龟头包皮分开和实验结束时对仔鼠举行称重。
用来举行交配的Fl代断乳鼠,观看并记录阴道开放或龟头包皮分开的日龄,观看性成熟状况。
5.6 实验结束时全部F0、F1代动物脏器称重:子宫(包括输卵管和子宫颈)、卵巢；睾丸、附睾；脑、肝、肾、脾和已知的靶器官。
5.7 实验结束时和实验期间死亡的全部F0代动物均应作大体解剖和组织病理学检查，观看各种形态结构异样及病理转变,特殊注重生殖器官。
假如每窝仔鼠的数量足够，F1代、F2代(和F3代)每窝每种性别起码取3只仔鼠举行同样检查。
生殖毒性
1.3.5 雄性激素测定
1.1.1 睾丸与附睾的解剖结构
曲精小管 白膜 鞘膜脏层 鞘膜腔
输出小管 睾丸网 直精小管 附睾管 输精管
1.1.2 人生精小管扫描电镜像 ×180
血管 间质细胞 支持细胞 初级精母细胞
精原细胞 精子细胞 精子
1.1.3 精子的发生过程
精子的发生是精原细胞发育成为成熟精子的过程。 精子的发生过程始于胎儿期的原始生殖细胞。出生后分化成
曲细精管内的精原细胞。 精原细胞在促性腺激素作用下依次进一步分裂成熟为初级精
母细胞、次级精母细胞、精细胞和精子。 精子由间质细胞包裹释放入直精细管，并移入附睾内进一步
成熟，再经输精管送入精囊贮存。 从精原细胞分化为成熟的精子，不同物种所需时间不同。人
64天、小鼠32天、家兔43天Wistar大鼠53.2天、牛54天。
1.3.4 体外试验
体外试验较在体试验具有简便的优点。 体外试验主要将哺乳动物的生殖细胞在体外条件下
进行培养，观察受试物是否引起生殖细胞改变。
也可通过分离培养睾丸支持细胞和间质细胞，测定 支持细胞的乳酸含量和乳酸脱氢酶活性的变化以及 测定间质细胞分泌的雄激素含量来判断受试物是否 对所培养细胞功能有影响。
支持细胞分泌的抑制素和间质细胞分泌的雄激素，又可反馈 抑制下丘脑GnRH和腺垂体FSH及LH的分泌。
正常情况下，各种激素的分泌量是相对恒定的，其中某一种 激素分泌量升高或下降，或某一种激素的相应受体改变，将 影响精子发生，并致第二性征改变及性功能障碍。
1.2 化学物的雄性生殖毒性
睾丸的功能主要是生成精子和合成雄激素。并受神 经内分泌调节。能影响睾丸、附睾、输精管、精囊 腺的结构和功能及内分泌调节功能的因素，均可致 雄性生殖系统损害。
安全性评价及生殖毒性医学PPT
VS
详细描述
体内实验包括动物繁殖试验和围生期发育 试验等，而体外实验则利用细胞培养和分 子生物学技术来研究物质对生殖细胞的直 接作用。综合这些实验结果，可以对物质 的生殖毒性进行全面评估。
03 安全性评价的实验设计
实验动物的选择
01
实验动物应选择与人类生理和代 谢机制相近的哺乳动物，如大鼠 、小鼠、兔子等。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
02
药物对胎儿和新生儿的毒性作用
研究药物在母体妊娠期间和哺乳期对胎儿和新生儿的潜在毒性作用，以
确保药物在怀孕和哺乳期的安全性。
03
药物的致畸作用
研究药物对胚胎和胎儿发育的致畸作用，包括对骨骼、内脏器官、神经
系统等方面的畸形影响。
化学品安全性评价
化学品的生殖毒性
01
研究化学品对生殖系统的潜在毒性作用，包括对性腺、生殖细
胞、妊娠和分娩等方面的影响。
化学品的致畸作用
02
研究化学品对胚胎和胎儿发育的致畸作用，包括对骨骼、内脏
器官、神经系统等方面的畸形影响。
化学品对胎儿和新生儿的毒性作用
03
研究化学品在母体妊娠期间和哺乳期对胎儿和新生儿的潜在毒
性作用，以确保化学品的安全性。
医疗器械安全性评价
医疗器械的生殖毒性
评估医疗器械对生殖系统的潜在影响，包括对性腺、生殖细胞、妊娠和分娩等方面的影响 。
安全性评价及生殖毒性医学
目 录
• 安全性评价概述 • 生殖毒性研究 • 安全性评价的实验设计 • 生殖毒性医学的应用 • 安全性评价与生殖毒性医学的未来发展
01 安全性评价概述
定义与目的
定义
安全性评价是指对药物、食品、 化学品等物质在正常使用或误用 时可能对人类健康产生的危害进 行评估的过程。
10.生殖毒性
外源化学物对雌性生殖系统的毒作用及表现
对下丘脑－垂体系统的损害: 闭经/动情抑制,受孕力降低
卵母细胞数↓/突变 生长卵泡和成熟卵泡 排卵抑制,受孕力↓ 对卵巢的损害 卵巢功能提前衰退 干扰卵巢内分泌 影响受精/着床/胚胎发育
生殖道的损害: 影响运送卵子/受精/受精卵发育
常见生殖损害的表现
性欲和性交能力↓,受孕力↓,月经紊乱,闭经,异常的妊 娠结局(流产、早产和死产,子代发育异常,低出生体重,围 产期死亡等)
睾酮 雌二醇 抑制素
Leydig 细胞 Leydig 细胞
Sertoli细 垂体前叶 胞
中枢神经系统
下丘脑 GnRH Leydig cell ICSH 睾酮 Sertoli cell FSH ABP,抑制素 调节雄激素含量 垂体 ICSH FSH 睾丸 附睾 受精 精细胞 n 精细胞转变成成熟精子的 过程精子生成或精子发生 (spermatogenesis) 精 子 发 生 精子形成或精子分化 (spermiogenesis) 精原细胞(休止状态) 2n 有丝分裂(青春期) 初级精母细胞 2n
器官重量
组织病理学 精液分子
睾丸、附睾、精囊、前列腺，垂体
睾丸、附睾、精囊、前列腺，垂体 精液量及精液特征分析
精子评价
激素水平
精子数量(计数、活率)及质量(形态、 活动度)
LH、FSH、睾酮、雌激素、催乳激素
睾丸功能
性行为
睾丸标志酶活性检测
跨上、插入、射精
发育效应
睾丸下降、包皮分离、精子产量、肛
殖距离、外生殖器结构
生殖毒作用的机理
细胞毒性、致癌或致突变性 直接作用 生殖毒物 作用方式 间接作用
结构与内源性分子的相似性
生殖发育毒性
1992年以来，Carlson等相继报道近 年来成年 年以来， 等相继报道近50年来成年 年以来 等相继报道近 男子的平均精子数减少近一半, 男子的平均精子数减少近一半 同时男性生殖系统 发育异常如隐睾、尿道下裂、 发育异常如隐睾、尿道下裂、睾丸癌等疾患的发病 率升高; 女性乳腺癌的发生率近年来每年以1%的速 率升高 女性乳腺癌的发生率近年来每年以 的速 度增长。另外,许多野生动物生殖器官发育异常 许多野生动物生殖器官发育异常, 度增长。另外 许多野生动物生殖器官发育异常 如 睾丸和外生殖器变小, 生育力下降。 睾丸和外生殖器变小 生育力下降。 并认为这些异 常改变与环境化学因素有关, 提出了环境雌激素、 常改变与环境化学因素有关 提出了环境雌激素、 环境内分泌干扰物等概念 1996年Theo Colborn等著 年 等著Our Stolen Future 指出 等著 环境激素” 对人类生存的地球的危害， “环境激素” 对人类生存的地球的危害，该书被 译成15种语言在世界各地销售 种语言在世界各地销售。 译成 种语言在世界各地销售。
母体毒性出生前1天处死母鼠检查胚胎毒性和胎儿毒性部位脊柱腹部肛门脑突出露脑颅脊柱裂单纯性脑膜膨出单鼻孔鼻孔扩张小眼无眼开眼眼异位脊柱膜膨出脊柱骨缺失脊柱侧凸脐疝短尾卷尾角形尾螺旋尾无尾肛门闭锁常见畸形及部位常见畸形及部位外观畸形部位颅顶骨枕骨颈椎骨胸骨肋骨腰椎四肢骨尾椎骨缺损骨化迟缓缺损骨化迟缓缺损骨化迟缓缺损错位骨化迟缓多肋少肋短肋分叉肋波状肋融合肋缺失分裂变形多骨缺失缺失缺失椎弓不连续融合常见畸形及部位常见畸形及部位骨骼畸形骨骼畸形部位心血管气管食管子宫脑积水脑室扩大短舌分叉舌少眼小眼无眼右位心室中隔缺损单房室心主动脉弓肝异位少叶马蹄肾肾积水肾积水肾缺失肾异位子宫缺失常见畸形及部位内脏畸形在妊娠终止期常规测定的终点着床位点数黄体数着床前胚胎丢失数吸收胎和死胎数有畸形和变异的活仔数受影响的胎仔数非存活和畸形的胎儿体重在出生后测定的终点死产数活仔生存数出生时第一周断乳时活仔生长出生时出生后不同时间发育的生理标志如阴道开口等神经行为发育和功能发射发育运动发育活动性感觉功能社会生殖行为认知功能神经病理学和脑重量其它器官功能如肾脏心血管放射原子武器放射性碘放疗感染巨细胞病毒疱疹病毒和细小病毒b19风疹病毒梅毒弓形体水痘病毒委内瑞拉马脑炎病毒母体代谢失衡酒精中毒绒毛膜采样60天前地方性呆小病糖尿病叶酸缺乏高热苯丙酮尿症和sjogrens综合征风湿病和先天性心脏传导阻滞virilizing肿瘤人类致畸物肯定的人类致畸物肯定的人类致畸物一一药物和环境化学物氨基喋呤和氨甲喋呤雄性激素可卡因香豆素抗凝剂环磷酰胺己烯雌酚enalapriletretinate碘化物和甲状腺肿有机汞美赛唑和头皮缺陷羊膜腔内注射美蓝青霉胺13顺式视黄酸四环素甲苯滥用355三甲基24二氧恶烷唑丙戊酸人类致畸物肯定的人类致畸物肯定的人类致畸物二二酰胺咪嗪香烟秋水仙素双硫仑戒酒硫维生素a大剂量喹宁自杀剂量链霉素锌缺乏可能的人类致畸物致畸物最常见的主要畸形表现反应停酒精己烯雌酚三甲双酮氨基喋呤和氨甲喋呤链霉素四环素短肢畸形肢带发育不良耳畸形生长迟缓睑裂缩小小头智力低下阴道腺病宫颈糜烂和宫颈嵴阴道腺癌鼻软骨发育不良cns缺陷先天性钙化性软骨发育不良生长迟缓异常颅面容貌特征小头畸形精神发育迟缓发育迟缓v型眉低耳唇腭裂流产脑积水生长迟缓精神发育迟缓耳聋或听力损害牙斑齿釉质发育不良已确定的人类致癌物引起的畸形表现一致畸物最常见的主要畸形表现电离辐射糖尿病碘缺乏苯丙酮尿
化学毒物的生殖毒性
完整的生殖发育过程细分为如下阶段。
A阶段 交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能， 配子的发育与成熟，交配行为，受精。
B阶段 受孕到着床：检查成年雌性生殖功能，胚胎着 床前发育、着床。
C阶段 着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能，胎 体发育，主要器官形成。
D阶段 硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、 胎体的发育与生长，器官的发育与生长。
人是第3～8周（又称胚期）。这期的特点是细胞移动 和组合，形成器官原基，四肢和颜面形成等。这时期 特别容易诱发器官结构的缺陷，即结构畸形，故又称 敏感期；也可能引起胚胎死亡。
啮齿类胚胎死亡后被吸收，称为吸收胎 （resorption），在人则以流产告终，人的胚 胎约50％死亡。
畸形的发生取决于化学毒物的性质、剂量 以及给予的时间。在胚胎期中不同日给予致畸 物会诱发不同器官畸形，因为不同器官的敏感 期有差别，过早或过迟反而不引起畸形。
(二)精子穿透试验：
(三)睾丸中标志酶活性的测定：
一类为透明质酸酶、山梨醇脱氢酶(SDH)、乳 酸脱氢酶同工酶x(LDH-x)、5-核苷酸酶、α磷酸甘油脱氢酶等，在精母细胞和精细胞中 首先出现，其含量和活性随精子的形成、成 熟而达到高峰。
另一类为6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、 三磷酸甘油醛脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、γ谷氨酰转肽酶、尿苷二磷酸酶、鸟氨酸脱羧 酶等，在睾丸足细胞、间质细胞或精原细胞 内含量最高，其含量和活性在性成熟前达到 高峰，并随精母细胞、精细胞和精子的形成、 成熟而降低。
4、发育毒性(development toxicity)：化学毒物 在着床前胚泡、器官形成，胎儿和新生儿各发 育阶段干扰正常发育过程，称为发育毒性。
不同的化学毒物作用于不同发育阶段。过早或过迟接
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
啮齿类动物生殖毒性I、II、III段实验流程及意义
1.概述
生殖毒性试验（Reproductive toxicity study）是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。
包括：生育力与早期胚胎发育毒性实验（I段）、胚胎—胎仔发育毒性试验（II段）、围产期毒性试验（III 段）。
生殖毒性试验中，为方便实验一般可将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段如下图所示：
图1. 动物生命周期划分
A. 从交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育和成熟、交配行为、受精）。
B. 从受孕到着床（成年雌性生殖功能、着床前发育、着床）。
C. 从着床到硬腭闭合（成年雌性生殖功能、胚胎发育、主要器官形成）。
D. 从硬腭闭合到妊娠终止（成年雌性生殖功能、胎仔发育和生长、器官发育和生长）。
E. 从出生到离乳（成年雌性生殖功能、幼仔对宫外生活的适应性、离乳前发育和生长）。
F. 从离乳到性成熟（离乳后发育和生长、独立生活的适应能力、达到性成熟的情况）。
各段试验研究阶段如下：
生育力与早期胚胎发育毒性实验（I段）：A-B
胚胎—胎仔发育毒性试验（II段）：C-D
围产期毒性试验（III段）：C-F
1一般试验设计简介
1.1受试物
生殖毒性试验的受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品。
1.2实验动物
首选啮齿类动物为大鼠。
在胚胎-胎仔发育毒性研究中，一般还需要采用第二种哺乳动物，家兔为优先选用的非啮齿类动物。
1.3给药
1. 3.1计量选择：至少应设三个剂量组，必要时可增加剂量组。
高剂量：应出现一些轻微的母体毒性反应，或为最大给药量/最大耐受量。
低剂量：应为生殖毒性方面的“未观察到不良反应的剂量（NOAEL）”。
1.3.2给药途径：给药途径应与临床拟用途径一致（不用腹腔注射途径，因腹腔注射会对胎儿及子宫产生直接影响）。
1.4对照组
应设赋形剂对照组。
当赋形剂可能产生作用或影响受试物的作用时，应另设空白对照组。
二、生育力与早期胚胎发育毒性试验（I段）
生育力与早期胚胎发育毒性试验是对雌雄动物由交配前到交配期直至胚胎着床给药，以评价受试物对动物生殖的毒性或干扰作用（生殖细胞接触药物后对受胎能力、生殖系统及子代有无不良影响）。
评价内容包括配子成熟度、交配行为、生育力、胚胎着床前阶段和着床等。
研究阶段包括生命周期的A 阶段和B 阶段如下图所示：
图2. 生育力与早期胚胎发育毒性试验研究阶段示意图*
注*：引自《生殖毒性发育试验设计和实施中应该注意的问题》，作者：常艳
1.试验流程如下图所示：
图3. 生育力与早期胚胎发育毒性试验流程图
2.试验流程图解：
2.1 分组及饲养：首先雌鼠、雄鼠分别按体重随机分为给药组和对照组，常规饲养，每天观察并记录动物体征和死亡情况；
2.2给药期：
雄鼠：交配前给药4-10周，给药期持续整个交配期，至处死；
雌鼠：交配前两周开始给药，并持续至胚胎着床（GD6-GD7）；
2.3阴道涂片检查：合笼交配前2周须每天对雌鼠进行阴道涂片检查，观测每只雌鼠的性周期变化，以检查其是否对交配和交配前时间有影响；
2.4合笼：雌鼠、雄鼠1：1合笼交配，交配期2周。
交配结束后雌鼠、雄鼠分别进行不同处
理：
雄鼠：交配成功后即可处死，并进行剖检，保存睾丸、附睾、异常组织器官；
检测项目主要包括：附睾精子计数、精子活力检查、精子畸形检查；
统计项目：摄食量、体重、生育率；
雌鼠：未交配成功的雌鼠：交配结束后处死；
交配成功孕鼠：每天观察并记录体征、死亡情况；每3天测定体重、摄食量；并于GD13-GD15日处死，进行剖检。
保存子宫、卵巢及异常组织器官；
检测项目：计数黄体数、活胎、死胎、吸收胎数，并计算着床数；
统计项目：摄食量、体重、受孕率、妊娠率、着床前丢失率、着床后丢失率；
三、胚胎-胎仔发育毒性试验（II段）
胚胎-胎仔发育毒性试验是研究妊娠动物自胚胎着床至硬腭闭合给药，评价药物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响。
实验动物包括大鼠和家兔。
评价内容包括妊娠动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、胚胎-胎仔死亡、生长改变和结构变化等。
研究阶段主要包括生命周期的C 阶段至D 阶段如下图所示：
图4. 胚胎-胎仔发育毒性试验研究阶段示意图*
注*：引自《生殖毒性发育试验设计和实施中应该注意的问题》，作者：常艳
1.试验流程如下图所示：
图5. 胚胎-胎仔发育毒性试验流程图
2.实验流程图解：
2.1制备孕鼠/孕兔，并按体重平均分为给药组和对照组，常规饲养，每3天测定摄食量、体重；每天观察并记录体征、死亡情况；
2.1给药期：给药期设定在怀孕动物胚胎着床至硬腭闭合期。
孕鼠给药期：GD6-GD15；孕兔给药期：GD6-GD18；
2.3剖检：动物饲养至分娩前处死，剖腹取仔。
孕鼠剖检日期：GD20/GD21；家兔剖检日期：GD28/GD29；
母鼠/母兔：进行大体尸检观察胎盘是否异常；保存异常组织器官；计数：黄体数、活胎、死胎、吸收胎；计算：摄食量、体重、着床数；
胎仔：胎仔清洗干净后分别测定每只胎仔体重、顶臀长，并进行大体外观检查。
该过程以后胎鼠与胎兔处理是有区别的。
胎鼠：50%胎仔制作骨骼标本，进行骨骼检查；50%胎仔制作内脏标本，进行内脏检查；胎兔：全部胎兔首先进行剖检，进行内脏检查，然后将剖检后胎兔剥离皮肤组织，并剔除脂肪，全部制作成骨骼标本，进行后期骨骼检查。
四、围产期毒性试验（III段）
围产期毒性试验是检测从胚胎着床到幼仔离乳给药对妊娠/哺乳的雌性动物以及胚胎和子代发育的不良影响；
评价内容包括妊娠动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、出生前和出生后子代死亡情况、生长发育的改变以及子代的功能缺陷，包括F1代的行为、性成熟和生殖功能。
研究阶段包括生命周期中的C 阶段至F 阶段如下图所示：
图6. 围产期毒性试验研究阶段示意图*
注*：引自《生殖毒性发育试验设计和实施中应该注意的问题》，作者：常艳
1.试验流程如下图所示：
图7. 围产期毒性试验流程图
2. 试验流程图解：
2.1制备孕鼠，按体重平均分为给药组和对照组，饲养至分娩，该阶段为怀孕期，每天对孕鼠进行体征及死亡情况观察；每3天进行体重、摄食量测定；
2.1给药期：设定在胚胎硬腭闭合至哺乳结束期，一般为孕鼠怀孕15日至子鼠离乳
（GD15-PND21）进行给药。
2.3分娩：孕鼠一般于GD21-GD23分娩；在大鼠分娩结束后进行观察（不能打扰其分娩，以免产生食仔现象），计数死胎数、活胎数、雌胎仔数和雄胎仔数；计算F1代大鼠畸形率、成活率、性别比例；对胎鼠进行外观畸形检查，并分别测定每窝雌、雄胎仔总体重；后进入哺乳阶段。
2.3哺乳期：P代大鼠：每天进行体征及死亡情况观察；每3天进行体重、摄食量测定，饲养至离乳；
F1代胎鼠：每天计数雌、雄胎鼠数量；每3天分别测定雌、雄胎鼠总体重；于PND4进行窝仔数调整（减少由于每窝胎仔数目不同而产生的对胎鼠身体发育等指标的影响）；哺乳期至离乳后还需根据身体发育、反射发育等检测指标日程安排对F1代胎鼠进行身体发育检测和反射发育检测；
2.4离乳：F1代大鼠于PND21离乳，代表哺乳期结束。
此时对P代雌鼠及F1代大鼠分别进行相应处理：
P代大鼠：哺乳期结束后（PND21）进行大体剖检；保存:异常组织器官；统计摄食量、体重、哺乳成活率；
F1代大鼠：每窝留存雌、雄仔鼠各1只，数量不够时同剂量组仔鼠补齐，饲养至性成熟。
该阶段每天观察并记录F1代大鼠体征、死亡情况；每周测定摄食量、体重；据F1代仔鼠行为指标检测日程安排进行转棒试验和穿梭箱试验。
2.5F1代大鼠合笼交配：F1代大鼠性成熟后同剂量组雌鼠与雄鼠1:1配对，合笼交配，交配
期为2周。
交配结束后对雄鼠、雌鼠分别进行相应处理：
F1代雄鼠：处死，计算生育率；
未孕雌鼠：处死，并进行大体剖检，保存异常组织器官；
孕鼠：饲养至胚胎硬腭闭合（GD13-GD15），怀孕期每天观察并记录F1代孕鼠体征、死亡情况，每3天测定摄食量、体重；
2.6 F1代雌鼠于GD13-GD15处死，大体尸检，检查有无胎盘异常，保存异常组织器官；计数黄体数、活胎、死胎、吸收胎数；计算摄食量、体重、妊娠率；活胎率、死胎率、着床前丢失率、着床后丢失率；
. .
.。