间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制作方法
所述人血白蛋白注射液（浓度20%），用于维持胶体渗透压，保持干细胞活性。
所述榄香注射液、羟喜树碱、鹿瓜多肽注射液的组合物，可以促进间充质干细胞向肝系细胞 转化，可以激活和保持注射液中干细胞活性，极大提高了临床效果。
优选的，复方电解质注射液和羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液的体积比为1:1。
肝纤维化是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，严重影响肝脏的功能，是慢性肝病 发展到肝硬化必经之阶段。引起肝纤维化的病因很多，在国内以病毒性肝炎，尤其是慢性乙
型和丙型肝炎所致的肝纤维化最为常见，慢性感染患者中40％可能发生肝硬化或者肝癌，是 正常人群的100-200倍。肝纤维化的治疗成为现今人们关注的焦点，但现代医学并无治疗肝
本技术注射液中的间充质干细胞由于来源广泛，不受伦理限制、免疫原性低使其成为肝纤维 化治疗的新的有效手段，应用前景十分广阔。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器药品试剂皆可 通过商业途径获得。
实施例1
一、制备本技术间充质干细胞保存和诱导液A 100ml
无菌条件下，依次取47ml的复方电解质注射液（商品名称：勃脉力A，上海百特医疗用品有 限公司，国药准字H20000475 ）、47ml羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液（商品名称：贺斯， 北京费森尤斯卡比医药有限公司，国药准字H20030494，规格型号 500ml：15g羟乙基淀粉 200/0.5与氯化钠4.5g）、5ml人血白蛋白注射液(成都蓉生，国药准字 S10940024,50ml:10g,20%)、0.3ml榄香注射液(大连华立金港,国药准字H10960114,20ml:0.1g)、 0.3ml羟喜树碱（贵州汉方，国药准字H52020516，2ml）、0.4ml鹿瓜多肽注射液（誉衡药 业，国药准字Z23020001,2ml），混匀，置0-8℃冷藏存储。
表格1可以看出，本技术的优选的间充质干细胞抗肝纤维化注射液A，对干细胞保存效率明 显高于其他。本技术中如果去除榄香注射液、羟喜树碱和鹿瓜多肽注射液即注射液D，效率 明显下降。本技术的优选的充质干细胞抗肝纤维化注射液A，细胞存储36h后，细胞活率仍
实施例2
一、制备本技术间充质干细胞保存和诱导液B 100ml
同实施例1，无菌条件下，依次所述注射液由45.85ml的复方电解质注射液、45.85ml羟乙基 淀粉200/0.5氯化钠注射液、7ml人血白蛋白注射液、0.4ml榄香注射液、0.4ml羟喜树碱、 0.5ml鹿瓜多肽注射液组成，混匀，置0-8℃冷藏存储。
优选的，所述注射液由47%的复方电解质注射液、47%羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、5% 人血白蛋白注射液、0.3%榄香注射液、0.3%羟喜树碱、0.4%鹿瓜多肽注射液组成。
所述注射液中加入的间充质干细胞的浓度为1×105-4×106/ml。
所述注射液使用静脉输注或者肝脏动脉介入输注的方式，按照间充质干细胞(2-4)×106/kg体
二、制备间充质干细胞抗肝纤维化注射液D 100ml
同实施例1，通过上述配置的间充质干细胞保存液D重悬细胞，调整每ml注射液中含有间充 质干细胞1×106；
实施例5
效果对比:将上述实施例中配置的间充质干细胞抗肝纤维化注射液A、B、C、D以及新鲜配 置的每ml含有间充质干细胞1×106的生理盐水悬液E，共5份样本，置于4℃的温度环境下保 存，在保存4h、8h、12h、24h、36h、48h时取样，并测定细胞存活率。
纤维化的特异性药物，多采用休息、加强营养、补充维生素等对症治疗方式，严重者需被迫 停止用药，以免加重肝纤维化。
目前有大量利用干细胞移植的方法治疗肝纤维化的临床报道。单纯输注间充质干细胞，由于 干细胞多向分化潜能，真正能分化成目的肝脏细胞的数量极少，造成临床效果不佳。而细 胞的增殖和分化是基因选择表达的结果，受到多种信号通路的联合调控。一般来说，体外诱 导干细胞分化都是采用含有组织特异性的细胞因子的选择性培养基来实现的。肝脏细胞的增
技术内容
本技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种间充质干细胞抗肝纤维化注射液，其具 有疗效好、安全性高、稳定性高、便于储存和运输，适应临床大规模使用，应用前景广 阔的特点，本技术可为肝纤维化患者带来福音，为临床上干细胞的使用开辟了新的道路。
本技术提供的间充质干细胞抗肝纤维化注射液，该注射液由45%-50%的复方电解质注射液、 45-50%羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、3%-7%人血白蛋白注射液、0.2%-0.4%榄香注射 液、0.2-0.4%羟喜树碱、0.3-0.5%鹿瓜多肽注射液组成。
本技术注射液所有成分均为临床上常用的药品，安全无副作用，制备成临床级注射液，安全 可靠。
本技术注射液稳定性高，同时也较好的解决了细胞运输时间短、活力低的问题，增加了注射
液保存及运输过程稳定性。本技术注射液24h内细胞活率维持在99%以上，36h后干细胞活率 仍然高达98%，极大提高了临床使用安全性。
本技术公开了一种间充质干细胞抗肝纤维化注射液，该注射液由45% 50%的复方电解质注射 液、45 50%羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、3% 7%人血白蛋白注射液、0.2% 0.4%榄香注 射液、0.2 0.4%羟喜树碱、0.3 0.5%鹿瓜多肽注射液组成，其中人血白蛋白注射液的浓度为 20%，复方电解质注射液和羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液的体积比为1:1，每ml注射液中 含有人脂肪间充质干细胞1×105 4×106个。本技术的注射液疗效显著，稳定性高，便于保存
二、制备本技术间充质干细胞抗肝纤维化注射液A 100ml
(1)从细胞库液氮中取出含有第3-4代临床级间充质干细胞的冻存管；
(2)将冻存管立即投入37℃ 温水中轻轻晃动，直至冻存液完全融解；
(3) 用75%酒精擦拭冻存管，将冻存管中细胞悬液转移至加含有9mL生理盐水的15ml离心管， 轻轻吹打均匀。可将多个同一批次的冻存管内细胞悬液及其洗涤液合并入1个50mL离心管内
所述复方电解质注射液，主要成份为醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化镁、葡萄糖酸钠，为无 色或几乎无色的澄明液体。可作为水、电解质的补充源和碱化剂。本品与血液和血液成分相 容，可作为细胞的稀释液。在本技术注射液中用于维持晶体渗透压。
所述羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液，为无色或微黄色澄明液体，临床上一般用于容量替
重注入患者体内。
本技术与现有技术相比，具有以下优点：
本技术首次发现榄香注射液、羟喜树碱、鹿瓜多肽注射液的组合物具有促进干细胞向肝系祖 细胞转化的作用，注射液添加上述组合物后，临床效果极大提高。
本技术解决了现有技术在干细胞输注过程中细胞活率低，保存时间短，长期保存细胞活性
差的问题，并且延长了待使用细胞的保质时间，36小时内细胞活率仍维持在98％以上，疗效
好、使用更安全，适于较长时间的保存及运输，用后无任何毒副作用，为临床大规模使用奠 定了基础。
本技术提供的注射液可分化成有功能的肝脏细胞，具有再生修复实质器官和发挥免疫调 节的双向作用，改善肝脏的微环境以及降低炎性细胞因子分泌的能力，减轻炎症反应；抑制 肝星状细胞活化、阻止细胞外基质的生成，逆转肝纤维化；激活肝脏细胞，促进肝脏细胞再 生，修复实质器官和慢性肝损害，间接地提高了抗病毒治疗疗效。
二、制备本技术间充质干细胞抗肝纤维化注射液C 100ml
同实施例1，通过上述配置的间充质干细胞保存液C重悬细胞，调整每ml注射液中含有间充
质干细胞1×106；
实施例4
一、制备不含榄香注射液、羟喜树碱和鹿瓜多肽注射液的干细胞保存液D 100ml
同实施例1，无菌条件下，依次所述注射液由47.5ml的复方电解质注射液、47.5ml羟乙基淀 粉200/0.5氯化钠注射液、5ml人血白蛋白注射液，混匀，置0-8℃冷藏存储。
殖和生长需要多种细胞因子来调控，其中就包括肝脏细胞生长因子（HGF），成纤维细胞生 长因子（FGF），制瘤素M（OSM），表皮生长因子等。在以往的研究中，有采用HGF、 OSM和DMSO联合使用，HGF、FGF4和FGF1联合使用，HGF、EGF和TNF-α联合使用等方
法，都可以将干细胞成功诱导为肝脏细胞。而本技术首次发现榄香注射液、羟喜树碱、鹿瓜 多肽注射液的组合物具有促进干细胞向肝系祖细胞转化的作用，本技术在注射液添加上述三 种组合物后，起到预诱导干细胞向肝系祖细胞转化的作用，可以使临床效果极大提高。
（注意：合并的细胞须为同一批次的，不同批次细胞禁止合并），同时吸出少许细胞用于细 胞计数；
(4) 离心洗涤：1000rpm离心8min，弃上清液；
(5)根据细胞计数结果，通过上述配置的间充质干细胞保存液A重悬细胞，调整每ml注射液中 含有间充质干细胞1×106；
三、制备好的间充质干细胞抗肝纤维化注射液A需要在0-8℃避光环境下保存和运输，自分 装之时起有效期为48小时。本技术的注射液适用于静脉输注或者肝脏动脉介入输注的方式， 按患者体重公斤数计算，推荐用量间充质干细胞(2-4)×106/kg体重。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞抗肝纤维化注射液，其特征在于，所述注射液由 47%的复方电解质注射液、47%羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、5%人血白蛋白注射液、 0.3%榄香注射液、0.3%羟喜树碱、0.4%鹿瓜多肽注射液组成，其中人血白蛋白注射液的浓 度为20%。
3.如权利要求2所述的间充质干细胞抗肝纤维化注射液，其特征在于，所述注射液使用静脉 输注或者肝脏动脉介入输注方式，按照间充质干细胞(2-4)×106/kg体重使用。
本技术由复方电解质注射液、羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、人血白蛋白注射液、榄香 注射液、羟喜树碱、鹿瓜多肽注射液组成，其中人血白蛋白注射液的浓度为20%，复方电解 质注射液和羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液的体积比为1:1，每ml注射液中含有间充质干细 胞1×105-4×106个，制备成临床级注射液形式。
间充质干细胞及其迁移的研究进展
临床医学研究与实践2021年2月第6卷第6期综述DOI :10.19347/ki.2096-1413.202106064基金项目：国家自然科学基金委员会资助项目（No.81903949）；浙江省基础公益研究计划项目（No.LQ19H290004）。
作者简介：戚亚钦（1999-），女，汉族，浙江绍兴人。
研究方向：临床医学。
*通讯作者：方燕，E -mail :fangyan@.间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs ）是具有自我更新能力并表现出多向分化潜能的成体非造血干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、外周血、脐带、胎儿组织、肌肉等中。
MSCs 具有来源丰富、获取方便、增殖率高等特点，已成为组织工程和临床研究的理想种子细胞[1]。
近年来，随着国内外对MSCS 的研究越来越深入，以MSCs 为基础的细胞移植替代治疗显现出良好的效果，MSCs 在临床试验中的安全性和有效性也已得到了更好的证明[2]。
1MSCs 的临床应用1.1MSCs 在神经系统疾病中的临床研究与应用目前，许多神经系统疾病如缺血、缺氧性脑病、恶性脑胶质瘤、神经系统退行性病变等仍无有效治疗方法，预后较差。
脑缺血后神经元的坏死将导致永久性神经功能缺陷，现有治疗手段尚不能逆转神经元和神经胶质细胞变性引起的神经功能障碍[3]。
MSCs 通过旁分泌作用，增加神经生长因子和脑源性神经营养因子的释放，促进神经障碍中丢失或损坏的神经元的恢复，减少神经元细胞的凋亡[4]。
MSCs 还可通过增加血管生成因子的分泌，促进病灶区新生血管生成；通过抑制血管内皮的凋亡和氧化应激，减少血管炎性损伤，增加脑血管的完整性[5]。
Xu 等[6]通过建立缺血缺氧性脑病的大鼠模型，证实MSCs 的脑内移植可减小脑梗塞体积，有效改善神经损伤，进而改善大鼠运动功能，为临床进一步研究提供实验依据。
但研究发现，缺血区局部不利的微环境使得能够迁移并存活在损伤区的MSCs 数量很少，严重限制了MSCs 的应用前景[7]。
骨髓间质干细胞培养上清液调控肝细胞的体外研究
【 关键词 】 骨髓间质干细胞 培养 上清液 ；肝细胞生长 因子 ；肝细胞 ；肝纤维化
【 中图分类号】Ｒ １ ６７ 【 文献标志码】Ａ 【 文章编号】１７４ ４ ２ １）０— ０ １０ ６４ ４５（０２ ４ ０１． ８
Ｅ ｔ ａ ｒｍｒ ａ ｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ｕ ｔ ｒ ｕ ｅ ｎ ｔ ｎ ｆｂ ｎ ｒ ｏ ｍｅ ｅ ｃ ｍａ ｔ ｍ ｅｌ ｏ ｒ ｇ ｌ ｔ ｇ ｘ ｒ ￣ ｌ ｅ ｉｒ ｓ ａ ｃ ｆｃ ｌ ｅ ｓ ｐ ｒ ａ ａ ｔ ｏ ｏ ｅ ｍａ ｒ ｗ ｓ ｎ ｈｙ ｌ ｓｅ ｃ ｌ ｎ ｅ ｕ ａ ｉ ｕ ｓ ｎ
ｈ ｐ ｔｃ ｔ Ｔ Ｎ ｅ ‘， ＨＵ ｎｐ ｎ ｅ ａ ｏ ｙｅ Ａ Ｌｉ Ｋｕ －ｅｇ，ＸＵ ｉｌ ｎ Ｙ ｈ—ｈ ｎ Ｌ—ａ ， ＡＯ Ｚ ｉ ｅｇ，ＸＵ ｉｎｌ ｎ ＇ ｔ ｃ Ｊａ —ｉ ｇ，Ｌ Ｎ ｎ Ｌ ｉ ａ Ｉ Ｎａ ， Ｕ Ｙ ，
ＸＵＲ ｉ ｕ ． ’ ｅａｔ ｅｔｏ ｅａ ｂｉｒ ｕｇｒ，ｔｅ 砌 Ａ ｌ ｔ ｏ ｉ ｌ ｕ ａ— ｎ Ｕ ｉ ｎ＠， ｕ— ｎ Ｄ ｐ ｒ ｎ Ｈｐ ｔ ｉａｙＳ ｒｅ ｙ ｍ ｆ ｏｌ ｙ ｈ ｆ ｉ ｅ Ｈ ｓ ｔ ，Ｓ ｎ Ｙｔｅ ｎｖ ｉ ｉ ｆ ａｄ ｐａ ｓ ｅ
检测 Ｂ Ｃ旁 分泌肝细胞生长 因子 （ ｅ ａ ｃｔ ｒｗｈｆｃ ｒ ＭＳ ｈｐｔ ｙｅｇｏ ｔ ｔ ，ＨＧ ） 情况及 培养时 间对 其 的影响 ；用 ｏ ａｏ Ｆ
流式细胞仪观察肝细胞细胞分期 和检测凋 亡细胞数 ；用 蛋 白免 疫印迹 法 （ ｓ ｒ—ｌ ）检 测样 本上 Ｗｅｔ ｎｂ ｔ ｅ ｏ 清液 中自蛋 白的表达 。结果 Ｂ Ｃ分泌 Ｈ Ｆ ＭＳ Ｇ ，其含量变化具有 时间依赖性 。加入 Ｂ Ｃ培 养上清液 ＭＳ
１ 组为完全 Ｂ Ｓ Ｍ Ｃ培养上 清液 （ 含肝细胞的 ６孔板中每孔加入 Ｂ Ｃ上 清液 ２ ｍ ） 处理肝细胞 ；实验 ＭＳ １ ２组为部分 Ｂ Ｃ培养上清液 （ ＭＳ 每孔加 Ｂ Ｓ Ｍ Ｃ上清液 １ｌ Ｉ ｌ １４ ｌ＋ ６０培养基 １ｍ ）处 理肝细胞 ；对 照组 １ 为完全细胞培养基 （ 每孔加 １４ ６ ０培养基 ２ｍ ） 处理肝 细胞 。用酶联 免疫 吸附试验 （ ＬＳ １ Ｅ ＩＡ）试 剂盒
间充质干细胞和单个核细胞异种移植治疗小鼠肝损伤的研究
首 次换液 ， 以后 每隔 ２— ３ｄ换液 １ ， 次 去除悬浮生长的 细胞 。待贴壁细胞 生长 占瓶底 面积 的 ８ ％ ～ ０ ０ ９ ％时 ，
用 ０ ２ ％胰酶／ ．２ Ｄ Ａ（ ： ） ．５ ０ ０ ％Ｅ Ｔ １ １ 消化 并 以 １ ２比例 ：
传代 。取生长 良好 、 形态 上呈 较为 均一梭 形 的第 ３代 培养细胞 ， 消化 后配 成 １×１ － Ｌ 的单 细胞 悬 液 ， ０ ｍ 加入 ＦＴ ＩＣ标记 的 Ｃ ４ Ｄ ４抗 体 、 Ｄ ０抗 体和 Ｐ Ｃ９ Ｅ标记 的 Ｃ４ Ｄ ５抗 体 染 色 ， 流 式 细 胞 仪 检 测 ， 取 表 型 为 以 选
ＭＳ ｓＣ ４ 、 Ｄ ０均表达 阳性 ， Ｃ ４ Ｃ Ｄ ４ Ｃ ９ 而 Ｄ ５表 达阴性 ； ２个细胞移植组在 Ｔ ～ 时点 Ａ Ｔ和 Ａ Ｔ浓度差异 有统计 ｌ Ｌ Ｓ
学意义 （ ０ ０ ） 与肝损伤 对照组比较 ， Ｃ 移植 组 Ａ＿ 和 Ａ Ｔ浓度在 Ｔ 一Ｂ 时点均 降低 ；ＭＳ ｓ Ｐ＜ ． １ ； ＭＳ ｓ Ｉ Ｔ Ｉ Ｓ １ Ｃ 移植 组肝 损
目前 ， 治疗肝 损伤引起 的肝纤 维化及 各种终 末期
肝 病主要 方法有肝 脏移植 、 肝细胞 移植 和干细胞 移植
ＭＮ ｓ细胞 悬液 按 ４ ｍ
等， 但都 面临供体来源 困难 和免疫排 斥等 问题 。为此 ， 人们一直努力 寻求一种 理想 的生物人 工肝或新 型种子 细胞。研究显示 ， 具有 多 向分 化潜 能 的问充 质干 细胞 （ Ｃ） ＭＳ ｓ 有体外 易获得 、 源可靠 、 疫原 性很 弱且 异 来 免 体移植不 易发生免疫排斥 等优 点 Ｊ异体 Ｍ Ｃ 有望 ， Ｓｓ 成 为一种新 型的种 子细胞 ， 为治疗 各种终末 期肝病 提 供新策 略。 自２０ ０ ９年 １ 至 ２ １ 月 ０ ０年 ２月 ， 研究拟 比 本 较大 鼠骨髓 ＭＳ ｓ Ｃ 和单 个核 细胞 （ Ｃ ） 四氯化 碳 ＭＮ ｓ 在 （ Ｃ 诱 导性小 鼠肝损 伤治疗 中的作用 。 ＣＩ ）
间充质干细胞的免疫学特性与系统性红斑狼疮的治疗
·综述·间充质干细胞的免疫学特性与系统性红斑狼疮的治疗丘美兰陈建DOI ：10.3877/cma．j．issn．1674-0785．2012．22．065作者单位：350025福州，福建医科大学福总临床医学院（丘美兰）；南京军区福州总医院肾内科（陈建）通讯作者：陈建，Email ：doctorj1@163．com 系统性红斑狼疮（SLE ）是一种以多器官或多系统病变和血清中出现多种自身抗体为特征的自身免疫性疾病。
SLE 传统的治疗方案，如糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗，虽能有效提高SLE 患者的长期存活率，但部分患者仍然复发，部分患者治疗无效，这类SLE 被称为难治性SLE ，而糖皮质激素及免疫抑制药物不良反应大，骨髓抑制和感染的发生率高。
SLE 目前尚无特效的治疗方法，近10年来大量实验与临床证据显示干细胞包括间充质干细胞（MSC ）、［脐带血MSC （UC-MSC ）或其他来源的MSC ］具有显著的组织与细胞修复、抗纤维化、免疫抑制与免疫调节功能。
MSC 在治疗SLE 上取得了一定的疗效，而理论上MSC 的生物学作用可用于治疗SLE 。
一、SLE 的发病机制SLE 有明显的免疫紊乱，其基本病理改变是免疫复合物介导的血管炎，具体机制尚未完全清楚，目前认为其发病是在多种因素作用下，引起机体免疫调节功能紊乱，出现造血干细胞、B 淋巴细胞、T 淋巴细胞、巨噬细胞和NK 细胞功能异常，细胞因子分泌异常，机体失去正常的免疫耐受性，发生自身免疫反应，产生自身抗体。
1．SLE 存在MSC 异常：研究发现，SLE 患者MSC 存在异常，表现为MSC 生长较正常缓慢，易衰老，传代过程中活力会逐渐丧失［1］，因此有些学者认为，SLE 是一种MSC 异常性疾病［2］。
Papadaki 等［3］研究表明SLE 患者骨髓MSC 不能正常支持造血。
2．SLE 的发病与免疫紊乱：SLE 是一种免疫复合物病［4］。
骨髓间充质干细胞在肝硬化中的应用研究进展
５ ７
综 述
骨 髓 间 充 质 干 细 胞 在 肝 硬 化 中 的应 用 研 究 进 展
曹会 娟 林 炳 亮
［ 摘
要 ］ 骨髓 间充 质干 细胞 向肝 细胞 的 分化及 对肝 脏 炎 症及 纤 维化 的修 复作 用越 来越 受到 人
经过 ２ ０～３ ０个 培养 周 期 ，仍 能 保 持其 多 向分 化 潜 能 。后 来 相继 在脐 带 、脐血 、脂 肪 及胎 盘等 多种 组
Ｄ Ｉ ０ ３６ ／ｇｉ ｎ０ ５ Ｏ ：１ ． ９ ９ ｊ． ｓ ． ２ ３—９ ０ ． ０ １ ０ ． ２ ｓ ８２ ２ １． １０ ２
行 比较 ，发现 Ｒ ｓｔ Ｓ ｐ法 简便 、快速 ，Ｂ Ｃ 增 ｏｅ ｅ ｅ ｔ ＭＳ ｓ 殖速度 快 ，而 且具 有很 强 的分化 力 ，适合 作为 以治 疗 为 目的的细胞 来 源 。
污染 机会 少 ，但所 得 细 胞 纯 度 不 足 ，多 次 传 代 后 ， 仍可 能有 较多 杂质 细胞存 在 。流 式细 胞仪 分离 法和
免疫磁 珠 分离 法对 细胞 的活性 影 响较 大 ，甚 至 可 以
具有 更高 的分 化潜 能 ，同时具有 取 材方 便 ，体外 培 养扩增 容 易 ，无移 植免 疫排 斥反 应 ，创 伤小 ，价 格 低廉 、无 伦理 争议 等优 点 ，与原 位肝 移 植 、生物 人
肝硬 化是 大多 数慢 性肝 病 的共 同病 理结 局 ，世 界 范 围 内 ，每 年 因 肝病 死 亡 的 １０万 人 中 有 ５ ％ ４ ５ （ 超过 ７ ６０ ０人 ） 死 于 肝 硬 化 ¨ 。原 位 肝 移 植 是 ９ ０
一
织均 发现 Ｃｓ ． ＭＳ 的分 离提 纯
脐带源间充质干细胞(hUMSCs)对硫代乙酰胺诱导肝纤维化干预作用的研究
（ 收 稿 日期 ： ２ ０ １ ２ —０ ５ —１ ７ ）
＿ Ｊ ］ ． Ｊ Ｍｏ ｌ Ｈｉ ｓ ｔ ｏ ｌ ， ２ ０ ０ ８ ， ３ ９ （ ２ ） ： ２ ４ ３ ．
文章编号 ： １ ０ ０ ７ —４ ２ ８ ７ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ６ —１ ０ ０ ３ —０ ３
中 国实 验 诊 断学
２ ０ １ ３年 ６月 第 ｌ ７卷
第 ６ 期
—
１ Ｏ Ｏ ３
一
１ ０６ （ ２２ ） ： ２ ７ ６ ７ ．
［ ８ ］ Ｍａ ＫＬ， Ｒｕ ａ ｎ ＸＺ ， Ｐ ｏ ｗ ｉ ｓ Ｓ Ｈ， ｅ ｔ ａ ． １ Ａｎ ｔ ｉ ａ ｔ ｈ ｅ ｒ ｏ ｓ ｃ ［ ｅ ｒ ｏ ｔ ｉ ｃ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｓ ｏ ｆ
ｓ ｉ ｓ， ｏｂ ｓ ｅ ｒ ｖ ｉ ｎｇ ｔ ｈ ｅ ｃ ｈａ ｎ ｇｅ ｓ ｏ ｆ ＡＩ Ｔ ａ ｎ ｄ Ａ ＳＴ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｉ ｅ ｓ ｉ ｎ ｓ ｅ ｒ ｕ ｍ ａ ｎｄ ｔ ｈｅ ａ ｃ ｃ ｕ ｍ ｕｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ｏｌ ｌ ａ ｇ ｅ ｎ ｉ ｎ Ｍ ａｓ ｓ ｏ ｎ ｓ ｔ ａ ｉ ｎ ｉ ｎｇ ａ ｆ —
脐带 源 间充 质 干 细 胞 （ ｈ ＵＭＳ Ｃ ｓ ） 对硫 代 乙酰 胺 诱 导 肝 纤 维 化 干 预 作 用 的研 究
宛 莹 。 ， 张世 东 ～， 贲 亮 。 ， 刘 湘竹 。 ， 李 超 ， 聂德 志 。
（ １ ． 四平 中心 人 民 医 院 中心 实 验 室 ， 吉 林 四平 １ ３ ６ ０ ０ ０ ； ２ ． 吉林省拓华生物科技有限公司 ， 吉林 四平 １ ３ ６ Ｏ Ｏ Ｏ ）
ｓ ｉ ｒ ｏ ｌ ｉ ｍｕ ｓ ｏ ｎ ｈ ｕ ｍａ ｎ ｖ ａ ｓ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｓ ｍｏ ｏ ｔ ｈ ｍｕ ｓ ｃ ｌ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｇ Ｊ ］ ． Ａｍ Ｊ Ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ
骨髓间充质干细胞及其外泌体治疗终末期肝病的研究进展
!L"!骨髓间充质干细胞及其外泌体治疗终末期肝病的研究进展梁 悦１，２，胡永红１，２，刘 伟１，２，慕永平１，２，陈佳美１，２，刘 平１，２，３１上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，上海２０１２０３；２肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海市中医临床重点实验室，上海２０１２０３；３上海中医药大学交叉科学研究院，上海市中医药化学生物学前沿基地，上海２０１２０３摘要：终末期肝病是各种急慢性肝病的晚期阶段，病死率高，严重危害人民健康。
目前有效的治疗方法是肝移植，但囿于供体短缺、费用高昂等因素极大地限制了其临床应用。
近年来临床与基础研究表明，骨髓间充质干细胞及其外泌体在治疗终末期肝病上具有良好的临床应用前景。
本文就骨髓间充质干细胞及其外泌体在终末期肝病治疗中的作用机制与临床应用研究概况作一综述，期冀为进一步研究提供参考。
关键词：终末期肝病；间充质干细胞；外泌体；治疗学基金项目：国家自然科学基金重点项目（８２１３０１２０）；国家自然科学基金面上项目（８１９７３６１３）；中国博士后基金面上项目（２０２１Ｍ７０２２１８）Ｒｅｓｅａｒｃｈａｄｖａｎｃｅｓｉｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｅｘｏｓｏｍｅｓｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｅｎｄ－ｓｔａｇｅｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅＬＩＡＮＧＹｕｅ１，２，ＨＵＹｏｎｇｈｏｎｇ１，２，ＬＩＵＷｅｉ１，２，ＭＵＹｏｎｇｐｉｎｇ１，２，ＣＨＥＮＪｉａｍｅｉ１，２，ＬＩＵＰｉｎｇ１，２，３．（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＬｉｖｅｒＤｉｓｅａｓｅｓ，ＳｈａｎｇｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｈｕｇｕａｎｇＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ；２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＬｉｖｅｒａｎｄＫｉｄｎｅｙＤｉｓｅａｓｅｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＳｈａｎｇｈａｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ；３．ＳｈａｎｇｈａｉＡｄｖａｎｃｅｄＢａｓｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＩｎｔｅｒ ｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ，ＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒｓ：ＣＨＥＮＪｉａｍｅｉ，ｃｊｍ０１０２＠１２６．ｃｏｍ（ＯＲＣＩＤ：００００－０００１－９８０８－９６１０）；ＬＩＵＰｉｎｇ，ｌｉｕｌｉｖｅｒ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ（ＯＲＣＩＤ：００００－０００２－６１５２－４５０８）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎｄ－ｓｔａｇｅｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｉｓｔｈｅｌａｔｅｓｔａｇｅｏｆｖａｒｉｏｕｓａｃｕｔｅａｎｄｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｍｏｒｔａｌｉｔｙａｎｄｓｅｒｉｏｕｓｌｙｔｈｒｅａｔｅｎｓｐｅｏｐｌｅ’ｓｈｅａｌｔｈ．Ｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｓｃｕｒｒｅｎｔｌｙａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｉｓｄｉｓｅａｓｅ，ｂｕｔｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｓｇｒｅａｔｌｙｌｉｍｉｔｅｄｂｙｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｓｕｃｈａｓｓｈｏｒｔａｇｅｏｆｄｏｎｏｒｓａｎｄｈｉｇｈｃｏｓｔｓ．Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｂａｓｉｃｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｓｈｏｗｎｔｈａｔｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙ ｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｄｉｔｓｅｘｏｓｏｍｅｓｈａｖｅｇｏｏｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｓｐｅｃｔｓｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｅｎｄ－ｓｔａｇｅｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｄｉｔｓｅｘｏｓｏｍｅｓｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｅｎｄ－ｓｔａｇｅｌｉｖｅｒｄｉｓ ｅａｓｅ，ｓｏａｓｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｎｄ－ＳｔａｇｅＬｉｖｅｒＤｉｓｅａｓｅ；ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ；Ｅｘｏｓｏｍｅｓ；ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＲｅｓｅａｒｃｈｆｕｎｄｉｎｇ：ＫｅｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８２１３０１２０）；ＧｅｎｅｒａｌＰｒｏｊｅｃｔｏｆＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８１９７３６１３）；ＣｈｉｎａＰｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（２０２１Ｍ７０２２１８）ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－５２５６．２０２２．１１．０４１收稿日期：２０２２－０４－１５；录用日期：２０２２－０７－１４通信作者：陈佳美，ｃｊｍ０１０２＠１２６．ｃｏｍ；刘平，ｌｉｕｌｉｖｅｒ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ 终末期肝病（ｅｎｄ－ｓｔａｇｅｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ，ＥＳＬＤ）以肝功能不能满足人体的正常生理需求为特征，是各种急、慢性肝损伤所致的晚期阶段，主要包括病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病引起的失代偿期肝硬化及肝衰竭。
骨髓间充质干细胞膜片的设备制作方法及其应用与设计方案
本技术公开了骨髓间充质干细胞膜片的制备方法及其在治疗心肌缺血再灌注损伤上的应用。
利用密度梯度离心、细胞贴壁和细胞冻存的方法提取扩增细胞，可以获得足够量的未分化的较为单一的MSCs，增殖能力较强，纯度高，可以作为组织工程的种子细胞，为组织工程血管的构建提供依据。
而且较Reyes方法去除了免疫磁珠选择的步骤，在实际应用中减少了昂贵的费用，操作中减少了污染的机会。
权利要求书1.骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：用20ml注射器吸取10ml骨髓液，将细胞悬液贴壁缓慢注入到预置有等体积密度为1.077kg/L的人淋巴细胞分离液的试管内，使两者间形成清晰的界面；S2：以2500r/min离心20min，吸取中间的乳白色云雾状单核细胞层，PBS漂洗，1500r/min离心10min，弃上清，加入含15％FBSDMEM-LG培养液10ml，制成单细胞悬液；S3：以3×105/cm2密度接种于50ml培养皿内，置入37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，4d后首次半量换液，将未贴壁的细胞全部弃掉，以后每2～3d全量换液一次；S4：待细胞汇合成单层后，以0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化，即得到原代MSCs悬液，再以1×104/cm2的密度以1：2传代培养以形成细胞膜片；S5：倒置显微镜观察细胞生长；S6：绘制细胞生长曲线；S7：测定贴壁率并绘制贴壁率曲线。
2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S1中，注射器内含稀释的肝素钠2500U/ml约0.5ml。
3.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S1中，骨髓液的吸取方法为选髂后上棘穿刺点，无菌条件下局部麻醉后骨髓穿刺针穿刺成功后拔出针芯，接含有5ml生理盐水和肝素(100U/ml)的10ml注射器穿刺抽取骨髓10ml。
4.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S2中，用于离心的离心机为台式高速离心机。
万能热点——间充质干细胞的研究套路
万能热点——间充质⼲细胞的研究套路在间充质⼲细胞这么⽕，申请基⾦有套路吗？⼀⽂中，我们总结了间充质⼲细胞研究最常见的间充质⼲细胞结合外泌体（外泌体（exosome）和⾮编码RNA，⽽且间充质⼲细胞可以⽤于各模式：间充质⼲细胞个系统疾病的损伤修复，包括：H0605（⾻、关节、软组织损伤与修复），H0203（⼼肌细胞/⾎管细胞损伤、修复、重构和再⽣），H1511（急重症医学/创伤/烧伤/整形其他科学问题），H0910（脑、脊髓、周围神经损伤及修复），H1505（烧伤）和H2902（中西医结合临床基础）。
我们看⼀下间充质⼲细胞⽤于治疗各种疾病的临床试验研究（数据来源于）的情况：以间充质⼲细胞（mesenchymal stem cell）为关键词，我们共检索到616项研究：其中关节炎48项，移植物抗宿主病26项，糖尿病25项，脊髓损伤22项，多发性硬化21项，肝硬化17项，肌萎缩性脊髓侧索硬化症15项，克罗恩病14项，严重肢体缺⾎11项，肝衰竭10项，中风10项⽬。
下⾯我们就承接前⾯的⽂章继续挑选⼏篇⽂章介绍套路：1.MicroRNA cluster miR-17-92 Cluster in Exosomes Enhance Neuroplasticity and Functional Recovery After Stroke in Rats.Stroke（IF 6.0）. 2017 Mar;48(3):747-753.间充质⼲细胞治疗中风的功能和机制研究：间充质⼲细胞通过外泌体中miR-17-92调控PTEN 间充质⼲细胞治疗中风的功能和机制研究表达从⽽激活PI3K/Akt/mTOR 通路调控神经元可塑性，并促进中风后功能恢复。
2. Exosomes derived from miR-122-modified adipose tissue-derived MSCs increase chemosensitivity of hepatocellular carcinoma.J Hematol Oncol（IF 6.3）. 2015 Oct 29;8:122.肝癌化疗敏感性的功能和机制研miR-122修饰的脂肪组织来源的间充质⼲细胞（AMSC）增加肝癌化疗敏感性究：AMSC通过外泌体将miR-122传递给肝癌细胞，通过调控肝癌细胞靶基因IGF1R，ADAM10和CCNG1表达增加肝癌细胞对化疗药5-FU的敏感性，同样的肿瘤注射miR-122也可增加肝癌细胞的5-FU化疗敏感性。
两种肝组织匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的比较
两种肝组织匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的比较闫成;薛改;吴丽颖;刘建芳;侯艳宁【摘要】BACKGROUND:Previous studies have demonstrated that normal rat liver homogenate supernatant can induce human umbilical cord mesenchymal stem cels to differentiate into hepatocyte-like cels with partial hepatocyte functions. However, whether fibrotic liver homogenate supernatant can work or how the inducing effect is remains unclear. OBJECTIVE:To investigate the differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cels into hepatocytes under the normal liver and fibrotic liver microenvironment in vitro. METHODS:Liver fibrosis was induced in the SD rats by repeated intraperitoneal injections of 3% thioacetamide at a dose of 200 mg/kg body mass, twice a week for 4 weeks, and then fibrotic liver tissues and normal liver tissues were used to prepare liver homogenate supernatants. Passage 3 human umbilical cord mesenchymal stem cels were used and divided into standard control group (cels were cultured in DMEM/F12 with 10% fetal bovine serum), fibrotic liver homogenate supernatants group (cels were cultured in DMEM/F12 with 10% fetal bovine serum and 50 g/L fibrotic liver homogenate supernatants), normal liver homogenate supernatants group (cels were cultured in DMEM/F12 with 10% fetal bovine serum and 100 g/L normal liver homogenate supernatants). The morphological changes of the cels in each group were recorded under inverted microscope; the proteinlevels of CK18, AFP, CYP3A4, CYP2E1, CYP2D6 and TPH2 were evaluated using western blot assay. Furthermore, the concentration of albumin in the cels was measured. RESULTS AND CONCLUSION:After a 7-day inducement, the stem cels in liver homogenate supernatants groups lost their fusiform shape and changed into hepatocyte-like cels with the morphous of round shape. Compared with the standard control group, the hepatocyte-like cels in the two liver homogenate supernatants groups exhibited human hepatocyte biomarkers, CK18 and AFP. The standard control group cels could express a little amount of CYP2E1, while cels in the two liver homogenate supernatants groups could express CYP3A4, CYP2E1, CYP2D6, TPH2. Compared with the standard control group, the expression level of CYP2E1 in the two liver homogenate supernatants groups increased significantly (P < 0.01), and however, the relative levels of CYP3A4, CYP2E1, CYP2D6, TPH2 in the two liver homogenate supernatants groups showed no statistical significance (P > 0.05). At the same time, compared with the standard control group, the concentration of albumin in the two liver homogenate supernatants groups markedly increased (P < 0.01), but there was no difference between the two liver homogenate supernatants groups (P > 0.05). Experimental findings demonstrated that both of normal liver tissue and fibrotic liver tissue microenvironments could induce human umbilical cord mesenchymal stem cels to differentiate into hepatocyte-like cels. To achieve the same effect, compared with normal liver tissue, fibrotic liver tissue required lower concentrations, suggesting that fibrotic liver tissue microenvironment may be more conducive to differentiation ofumbilical cord mesenchymal stem cels into hepatocytes.%背景:前期研究证明正常大鼠肝组织匀浆上清液可诱导人脐带间充质干细胞定向分化为具有部分肝细胞功能的肝样细胞,而肝纤维化大鼠肝组织匀浆上清液的诱导可行性及与前者诱导效果的比较尚不明确.目的:比较正常肝组织及纤维化肝组织微环境诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的能力.方法:采用腹腔注射3%硫代乙酰胺生理盐水溶液(200 mg/kg,2次/周,共4周)的方法制备SD大鼠肝纤维化模型,取肝纤维化大鼠及正常大鼠肝脏制备肝组织匀浆上清.将第 3 代人脐带间充质干细胞进行分组诱导培养:①标准对照组:加入含体积分数为 10%胎牛血清的 DMEM/F12 培养基.②纤维化肝组织匀浆组:加入含体积分数为10%胎牛血清及50 g/L纤维化肝组织匀浆的DMEM/F12培养基.③正常肝组织匀浆组:加入含体积分数为10%胎牛血清及100 g/L正常肝组织匀浆的DMEM/F12培养基.诱导开始后于倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化;取标准对照组及诱导7 d的匀浆组细胞采用Western Blot法检测CK18、AFP、CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2的表达情况,采用ELISA法测定各组细胞培养液中白蛋白水平.结果与结论:与标准对照组长梭形成纤维样细胞相比,诱导7 d时,肝纤维化匀浆组及正常匀浆组细胞形态变化明显,呈类圆形,胞体丰满.与标准对照组相比,两匀浆组细胞均可表达肝细胞标志物CK18和AFP.标准对照组细胞可表达少量CYP2E1,两匀浆组细胞表达CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2等肝细胞功能蛋白,且CYP2E1的表达量较标准对照组明显增加(P < 0.01),而两匀浆组间上述蛋白的相对表达量差异无显著性意义(P > 0.05).同时,两匀浆组细胞分泌白蛋白的能力较标准对照组亦明显增强(P < 0.01),两匀浆组相比差异无显著性意义(P > 0.05).实验结果显示正常肝组织和纤维化肝组织微环境均可诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化,在达到相同诱导效果时,纤维化肝组织所需组织液浓度更低,提示纤维化肝组织微环境可能更有利于人脐带间充质干细胞向肝细胞分化.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(019)019【总页数】6页(P2993-2998)【关键词】干细胞;脐带脐血干细胞;肝纤维化;肝组织匀浆上清液;微环境;人脐带间充质干细胞;诱导分化;肝细胞;细胞色素P450酶;白蛋白【作者】闫成;薛改;吴丽颖;刘建芳;侯艳宁【作者单位】解放军医学院,北京市 100853;解放军白求恩国际和平医院药剂科,河北省石家庄市 050082;解放军白求恩国际和平医院药剂科,河北省石家庄市050082;解放军白求恩国际和平医院药剂科,河北省石家庄市 050082;解放军白求恩国际和平医院药剂科,河北省石家庄市 050082;解放军白求恩国际和平医院药剂科,河北省石家庄市 050082【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章亮点：1间充质干细胞治疗肝纤维化的机制之一是其移植入血后可归巢至受损肝组织并向肝细胞分化，促进肝脏修复。