真核细胞常见表达载体
蛋白表达概述
缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②培养上清多糖浓度高，不利于纯化。
昆虫细胞表达系统
利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。
优越性： ①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配； ②可容纳较大片段的外源 DNA 插入，因此是表达大片段 DNA的理想载体； ③可进行分泌表达。
选择合适的载体需要考虑的因素： ?目的蛋白的应用 ?目的蛋白已知特定信息 ?克隆策略
目的蛋白的应用
分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制 备抗原等。大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。可能有多 种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是， 能用于大量纯化的载体-宿主菌-培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。如果要 连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体-宿主菌-培养条件的 组合以便找到最佳条件，是非常值得的。
?对于我们来说，最常用和最需掌握的是 大肠杆菌表达系统
Factors in E.coli protein expression
vector
Strain
growth conditions
一个蛋白要成功的在 E.coli 系统表达，就是要根据表达目的在 载体，菌株和培养条件 三个主要因素之间找到一个理想的结合点。以达到 ⑴目的基因的表达产量高 ;⑵表达产物稳 定;⑶生物活性高 ;⑷表达产物容易分离纯化。
植物表达载体构建
植物基因工程常用的报告基因
指其编码产物能够被快速地测定、常用 来判断外源基因是否已经成功地导入寄 主细胞（器官或组织）并检测其表达活 性的一类特殊用途的基因。
作为报告基因的条件
在转化的寄主细胞中应不存在相应的内 源等位基因的活性，
其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而 且还应具有快速、灵敏、定量和可重复 的检测特性。
检测方法
用于GUS基因检测的常用底物有三种： X-Gluc 5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯 X-MUG 4-甲基伞形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯 PNPG 对硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷 组织化学染色定位法 荧光法测定GUS活性 分光光度法测定GUS活性
组织化学染色定位法
该方法是将底物进入被测的植物组织。 将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温，
cells).
Left, Down regulation of CaMV35S promoter in the syncytium of Heterodera schachtii monitored by expression of GFP (top). By comparison an unifected root shows regular GFP expression (bottom). Right, Image analysis of the mean red component of
植物表达载体构建
张玉刚 zyg4458@
载体 vector
克隆载体
载
体
原核表达载体
表达载体 真核表达载体
植物表达载体
质粒图谱及质粒构建
启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子
目的片段
（标记基因） 选择标记
真核细胞诱导表达系统研究进展
真核细胞诱导表达系统研究进展主要内容一．选题背景二．原核生物表达真核蛋白的缺点三．常见的几种真核表达系统四．总结与展望一、选题背景•随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，因此，组成型表达系统的应用受到一定限制。
•基因工程的发展使许多微量蛋白得以大量表，使许多难以制备的蛋白得以表达。
大肠杆菌Ecoli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达，但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。
二、原核生物表达真核蛋白的缺点1、外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；2、真核基因通常含有内含子，在E.coli中是不能进行正确的剪切和拼接的，因此必须表达它的cDNA序列；3、真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。
三、常见的几种真核表达系统1、四环素诱导表达系统2、蜕皮激素诱导表达系统3、生物素诱导表达系统4、哺乳动物细胞表达系统1、四环素诱导表达系统此系统的作用依赖于四环素调控的反式作用因子(tTA/rtTA)和反式作用因子依赖的启动子两个成分。
四环素反式激活蛋白(tTA)是一个包含大肠杆菌TN10四环素耐药操纵子阻遏物和单纯疱疹病毒p16蛋白(VP16)C端部分的融合蛋白,tTA依赖启动子由融合有RNA聚合酶Ⅱ启动子的四环素操纵子(tet O)基因序列构成,这种融合使真核细胞中的tet阻遏物成为很强的翻译激活物。
作用机理：在缺乏四环素及其衍生物的条件下tTA与tetO序列结合，使tTA依赖启动子的转录过程被激活；而在存在四环素及其衍生物的条件下，tTA无法与其靶位点相互作用，转录也就无法进行。
真核表达载体pcDNA3-CaBP—D28k的构建及其在COS-1细胞表达
摘要 ： 通过酶 切方 法从克隆质粒 ｐ Ｅ Ｔ—Ｃ Ｂ Ｄ ８ Ｇ Ｍ— ａ Ｐ— ２ ｋ中扩增 Ｃ Ｂ ａ Ｐ—Ｄ ８ 基 因 ， ２ｋ 并将其克隆到真核表达
载体 ｐ Ｄ Ａ ｃ Ｎ ３中。阳性克隆 鉴定 后 ， Ｐ Ｉ 用 下转 染 Ｃ Ｓ一１细胞 ， 在 Ｅ作 Ｏ 通过 间接 免 疫荧 光试 验 （Ｆ 检 测 到 了 ＩＡ）
虽对 ＣＢ ａ Ｐ家族其 他成 员 的 基 因克 隆 及 载体 构 建有
合蛋 白家 族 中 的一 员 。 它 是 一 种 维 生 素 Ｄ依 赖 性 钙结 合蛋 白 ， 是受 活性 维 生 素 Ｄ及 其 代谢 产 物 调 节
的细 胞 内蛋 白质 ， 对 分子 质 量为 ２ 相 ８×１ Ｄ ， 有 ０ ａ具 Ｅ—Ｆ手臂 ， 螺旋 环 状 结 构 ， 与 Ｃ 结 合 ， 接 呈 可 ａ 直 调 节 Ｃ 转运 －］ ａ Ｐ—Ｄ ８ ａ ２。Ｃ Ｂ ２ ｋ与 细 胞 内游离 钙 离 子有 高度 亲 和力 ， 介 导 调 节 钙 离 子 参 与 的 多种 可 生 理功 能 －］ ａ Ｐ—Ｄ ８ ４。Ｃ Ｂ ２ ｋ首先 是 从 禽 肠 道 中分 离 出来 的 ， 的 含 量 与 肠 钙 吸 收 量 呈 正 相 关 Ｊ 它 。 以往对 Ｃ Ｂ ａ Ｐ—Ｄ ８ ２ ｋ的研究 多集 中在 与 钙平 衡 密切 相 关 的肾 、 、 肠 、 经 系 统 方 面 骨 小 神 ， 年 来 研 近
ＣＢ ａ Ｐ—Ｄ ８ ２ ｋ在 Ｃ Ｓ一１中 的表 达 。 Ｏ
关键词 ： 钙结合蛋 白；转染 ； Ｆ ＩＡ
中 图分 类 号 ： ８ １ ２ ￥ ３ ． 文献标志码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ２—１０ （ ０８ ０ ０ ６ ０ １０ ３ ２ ２ ０ ） ３— ０ ２— ５
原核表达和真核表达
原核表达和真核表达原核表达的步骤和主要试剂1、获得目的基因；2、构建重组表达载体；3、获得含重组表达质粒的表达菌种；4、诱导表达；5、包涵体的分离。
获得目的基因 PCR法钓基因引物（捷瑞），普通taq酶（Regene，Fermentas）/Pfu酶（Fermentas）/Hotstart Taq酶（Fermentas）,dNTP(Regene，Fermentas)RT-PCR法获取基因Trizol（Invitrogen，捷瑞），DEPC（捷瑞或其他进分），Rnase抑制剂（MBI），M-MLV/AMV（Fermentas）或M-MLV/AMV一步法RT-PCR试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen、Omega）构建重组表达载体 内切酶（Fermentas），载体（捷瑞，Fermentas），琼脂糖（西班牙），T4连接酶（Fermentas，promega），测序获得含重组表达质粒的表达菌种 菌株（捷瑞），质粒小抽试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen），感受态细胞制备试剂盒（捷瑞），抗生素（捷瑞，Amresco，sigma），测序（伟沃）诱导表达 IPTG（捷瑞，Amresco，sigma），胰蛋白胨（Oxiod），酵母粉（Oxiod），琼脂（进分，国产）包涵体的分离 Triton X -100（捷瑞，进分），PMSF(sigma)，DTT （Amresco，进分），尿素（Amresco，进分，sigma）,还原型谷胱甘肽（Amresco，进分，sigma）真核表达蛋白质在真核表达的过程中，可以通过真核细胞的转录加工系统获得具有一定构象和生物活性的蛋白质。
真核表达现在主要有毕赤酵母表达体系、杆状病毒昆虫细胞表达体系、哺乳动物细胞表达体系。
各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。
gmp质粒标准
gmp质粒标准一、质粒特性GMP质粒是一种用于基因治疗和基因疫苗生产的质粒DNA。
其特性主要包括以下几个方面：1.大小：GMP质粒的大小通常在10-30kb之间，可根据需要定制。
2.载体：GMP质粒采用真核细胞表达载体，如pCMV、pEF等。
3.目的基因：GMP质粒携带目的基因，可用于基因治疗或基因疫苗生产。
4.安全性：GMP质粒应经过严格的病毒和毒素检测，确保安全性。
二、生产过程GMP质粒的生产过程应遵循良好的生产规范，以确保产品质量和安全性。
主要步骤包括：1.质粒构建：将目的基因插入质粒载体，形成GMP质粒。
2.质粒扩增：在细菌中扩增GMP质粒。
3.质粒纯化：采用高效液相色谱法或凝胶电泳法纯化GMP质粒。
4.病毒和毒素检测：对GMP质粒进行病毒和毒素检测，确保安全性。
5.包装和标识：按照规定包装和标识GMP质粒。
6.储存和运输：在规定的条件下储存和运输GMP质粒。
7.记录和报告：建立完善的记录和报告制度，记录生产过程和产品质量，并向相关部门报告。
8.安全性评估：对GMP质粒进行全面的安全性评估，确保其不含有任何潜在的有害物质。
9.培训与资质：对生产人员和质检人员进行严格的培训和资质认证，确保他们具备相应的专业知识和技能。
三、质量控制在生产过程中，应建立严格的质量控制体系，确保产品质量符合相关规定。
主要质量控制措施包括：1.原材料质量控制：对用于生产的原材料进行质量检查，确保符合规定要求。
2.生产过程监控：对生产过程中的各项操作进行监控，确保符合生产工艺要求。
3.产品检验：对生产出的GMP质粒进行质量检验，包括外观、纯度、浓度、分子量等指标的检查。
4.留样观察：对每个批次的产品进行留样观察，以便于后续的质量追溯和分析。
5.环境监控：对生产环境进行严格的监控，确保符合洁净度要求，避免污染和交叉污染。
6.质量管理体系的建立和运行：建立完善的质量管理体系，确保各环节的质量控制得到有效实施。
7.不合格品处理：对不合格品进行严格的控制和处理，防止其流入市场。
蛋白表达与纯化-真核表达
蛋⽩表达与纯化-真核表达
真核表达的⽅式：包括原核蛋⽩表达与纯化、酵母蛋⽩表达与纯化、昆⾍细胞蛋⽩表达与纯化、哺乳动物细胞蛋⽩表达与纯化。
蛋⽩表达从哪⼀步开始呢？
1. 从基因合成开始，只需要提供具体的序列；
2. 提供cDNA基因模版，最后提供测序报告，以证明序列是正确的；
3. 提供质粒，如果是T载体，需要从构建载体开始，如果是PET28a和PET32a或其他可以直接⼩量诱导的质粒，可以从纯化开始；
4. 提供菌株，从纯化开始（菌株存放时间长可能活性会变差）
根据客户的需求，我们提供从基因合成，载体构建，基因表达，蛋⽩纯化、检测等⼀站式服务。
基因工程原理与技术-3
pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签： 多聚组氨酸残基、 结合麦芽糖蛋白、 谷胱甘肽-s-转移 酶。
亲和层析法纯 化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体 真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体 非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体 非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的 杀伤质粒)。
提取的质粒有三 种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线 形DNA。
2、质粒的复制类型 严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中 是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制 的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载 体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动 物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物 细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修 饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体 在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。
真核生物表达系统汇总
2020年8月10日星期一
16
哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
2020年8月10日星期一
17
（3）选择标记
18
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
c、博来霉素抗性基因：
d、HPH基因：该基因编码潮霉素B磷 酸转移酶
1、瞬时表达：转染的DNA未与宿主 染色体整合，不能随宿主基因组的复 制而扩增，只能在细胞内维持2~3天 2、稳定表达：转染的DNA与宿主染 色体整合，能随宿主基因组的复制转 录和翻译，并被稳定遗传。
2020年8月10日星期一
7
五、外源基因在真核细胞中表达产物 的鉴定和纯化
mRNA的鉴定
蛋白产物鉴定
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
2020年8月10日星期一
2020年8月10日星期一
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
蛋白真核表达的整个流程
蛋白真核表达的整个流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!蛋白真核表达的整个流程一般包括以下几个步骤：1. 目的基因的获取通过基因克隆技术，从生物体中获取编码目的蛋白的基因序列。
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真核细胞罕见表达载体之袁州冬雪创作
真核细胞, 表达载体
1、pCMVp-NEO-BAN载体
特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由
CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉
素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数
真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目标基因.更重要的
是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细
胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目标基因的细
胞株.
拔出外源基因的克隆位点包含Sal1、BamH1和EcoR1位点.
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在.
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced
Fluorecent Protein Vector)
特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动
子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的
SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内
停止复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的
neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤
信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.此
外， 载体中的pUC origin 能包管该载体在大肠杆菌中的
复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin
抗性基因在大肠杆菌中的表达.
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克
隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和
EGFP的融合基因. 借此可确定外源基因在细胞内的表达和/
或组织中的定位.
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-
Nhe1).
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载
体
特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆
β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中
高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表
达SV40 T抗原的真核细胞内停止复制.Neo抗性盒由SV40
早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及
HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转
染的真核细胞株.此外， 载体中的pUC origin 能包管该载
体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动
子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达.
用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合
蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活
细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞布局.
4、pSV2表达载体
特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目
标基因停止表达的，克隆位点为Hind111.SV40启动子具有
组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因，故不克不
及用来筛选、建立稳定的表达细胞株.
5、CMV4 表达载体
特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域
酶切位点选择性较多.含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因
片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点.但值得注意的
是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不克不及用
G418筛选稳定的表达细胞株.
其他常常使用克隆Vector：
pBluscript II KS DNA 15 ug
pUC18 DNA 25 ug
pUC19 DNA 25 ug
说明:
pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的
克隆、DNA测序和对外源基因停止表达等.这些载体由于在
lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化
lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培
养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源
DNA片段载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源
DNA片段的载体.此外，这些载体中有便于测序的M13、T7
和T3的通用引物停止DNA测序.
保管液: TE Buffer
TE Buffer组成:
10mM Tris.HCL(Ph 8.0)
1mM EDTA
用途:
克隆外源DNA片断.
停止基因表达.
使用M13、T7和T3引物停止测序.
存在的问题
细胞的生命活动是一个复杂的调控过程，有些生命活动的
机理还不完全清晰，由于插人的目标基因分歧，载体构建
栗用的顺式组件分歧，组装的空间位置分歧，采取的表达
系统分歧，目标基因表达水平和阳性克隆筛选率都会有很
大差别.别的，由于所有的顺式元件存在种属和组织特异
性，所构建的高效表达载体纷歧定在所有细胞株中均高效
表达.再者，细胞生长状态的差别，转染方法的分歧培养时
阉的长短，筛选药物浓度的高低，对表达量都有很大影响.
所以，需要综合评价一个表达载体和表达系统，解除一些
不定因素，筛选出最佳组合
真核表达载体趋向于既有利于扩增目标基因又有利于筛选
阳性克隆的载体的构建.许多有效的应用范围广的强启动子
和增强子被人发现并应用于载体中，大大提高了目标基因
的表达量，别的一些强的组成型启动子，如 SV40早期启动
子+PHTLv，已应用于大规模生产的细胞系中.
应用以GS为筛选标记的表达载体可兼有筛选和扩增目标基
因两种功能，是今朝研究的重点.以IRES毗连的双顺反子
表达载体已成为核表达载体的主体.在同一启动子把持下，
筛选基因或陈述基因与目标基因转录在同一mRNA上通过
IRES的作用，表达出两种蛋白，因而在实际上可认为，通
过了筛选或表达了陈述基因的克隆必为阳性克隆，即表达
目标基因的克隆，有报导说这种双顺反子的共表达率为
90％.这就大大提高了筛选率，简化了实验过程.
将强启动子、增强子和可扩增的筛选标记组装在同一载体
上，构建高效表达和筛选的表达载体并将其运用于最合适
的表达系统中，是当今真核表达载体构建研究发展方向.