HE、Masson、VG、pas、免疫组化、TUNEL染色步骤
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
免疫组化相关步骤
免疫组化相关步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测、定位和定量特定蛋白质在组织或细胞中的表达。
以下是免疫组化的一般步骤：1.取材和预处理：首先，选择需要研究的物种的组织样本，可以是固定和包埋的组织切片，也可以是细胞培养物。
对于固定组织，常用的固定剂包括福尔马林、乙醛等。
然后进行脱水、透明化、包埋等预处理步骤。
2.标本切片：将处理好的组织或细胞样本切成较薄的切片，常见的切片厚度为4-6微米。
切片后，可以将其固定在载玻片上。
3.抗原恢复：对于一些已经固定的样本，抗体可能无法充分与蛋白质结合。
因此，进行抗原恢复是必要的。
常见的抗原恢复方法包括加热诱导抗原恢复（如高温加热或压力加热）和酶或蛋白酶诱导的抗原恢复。
这些方法有助于揭示抗原并提高抗体的结合。
4.阻断非特异性结合：在进行免疫组化反应之前，需要阻断非特异性结合位点，以减少假阳性结果。
常用的非特异性结合位点阻断方法包括使用血清蛋白、牛血清白蛋白、胶原蛋白等。
5.一抗反应：将特异性抗体（一抗）加入切片或细胞上，并进行孵育。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
一般情况下，常用的抗体稀释倍数为1:100到1:1000。
此步骤的时间和温度也需要根据具体的抗体选择进行调整。
6.洗涤：完成一抗反应后，需要进行多次洗涤来去除未结合的抗体。
洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。
7.二抗反应：8.洗涤：与一抗反应类似，完成二抗反应后需要进行多次洗涤来去除未结合的二抗。
洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。
9.染色和显微镜观察：根据实验需要，可以选择合适的染色方法，如荧光染色或酶联染色。
染色后，可以使用荧光显微镜或光学显微镜进行观察和拍照记录。
10.分析和结果解读：根据染色的结果和显微镜观察，进行定性和定量分析。
可以使用图像处理软件来分析染色的强度和分布情况。
根据实验设计和相关的对照组，对实验结果进行解读。
HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤.
HE染色 1.取材 切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项: (1取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
(2切片材料应根据需要观察的部位进行选,尽可能不要损伤所需要的部分。 2.固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次,立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定,固定36小时。
注意事项: (1一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。
(2有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。
(3固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20~30倍,有些水分多的材料,中间应更换1-2次新液。
(4材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥(进口脱钙液 镊子触质粒由硬变韧性为准。 (美:固定3-5天根据组织大小确定天数,越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。(20,30,30,60 (美:流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水,各30min 注意事项: (1脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。 (2在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。
(3在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。 (4在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。
(5如需过夜,应停留在80%酒精中。 (6脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象 (美:80%的酒精×2小时 95%的酒精×2小时 100%的酒精×2小时×2 100%的酒精×1小时或者更长时间 5.透明(环保透明脱蜡液中杉金桥 纯酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min(至透明为止。 由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。
免疫组化相关步骤
免疫组化操作步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
免疫组化相关步骤
免疫组化相关步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种基于抗原抗体反应的方法，用于检测组织或细胞中其中一种特定蛋白质的表达。
下面将详细介绍免疫组化的相关步骤。
免疫组化的步骤包括样品制备、抗原修复、阻断、一抗反应、二抗反应和染色，具体如下：1.样品制备：首先，需要获取组织标本。
通过活体组织切片、细胞涂片或冷冻切片等方法制备标本。
制备好的标本需要保持完整和有代表性，通常要求切片不超过5μm厚。
2.抗原修复：组织切片在固定过程中会损害抗原的完整性，因此需要进行抗原修复，以恢复抗原的表达。
常用的抗原修复方法包括热解修复（如加热、压力煮等）和酶解修复（如胰蛋白酶消化等）。
3.阻断：组织切片会与非特异抗体结合，影响免疫反应的特异性，因此需要进行阻断。
常用的阻断方法包括用牛血清白蛋白（BSA）或奶粉进行阻断，以防止非特异性背景信号的产生。
4.一抗反应：将含有特异性抗体的试剂加到组织切片上，使其与目标抗原结合。
特异性抗体可针对不同的抗原进行选择，如研究一些蛋白质的表达，可以选择该蛋白的特异性抗体。
5.二抗反应：一抗与抗原结合后，需要加入与该一抗来自不同物种的二抗。
二抗通常是免疫出来的，其与一抗结合后，可形成复合物，具有荧光或酶标记。
6.染色：最后，通过染色方法来显示抗原的表达。
染色可以是荧光染色或酶标染色。
荧光染色利用特定颜料对特异性标记的抗体进行荧光标记，并在荧光显微镜下观察。
酶标染色则使用酶标记的二抗，再加入相应的底物进行染色。
除了以上的基本步骤1.控制组：为了验证实验是否准确，通常需要设置阴性和阳性对照组。
阴性对照组通常是替代一抗的种属、浓度和机制抗体；阳性对照组是已知具有目标蛋白表达的组织切片。
2.负载密度和反应时间：一抗的负载密度和反应时间需要优化，以确保对目标蛋白的增强标识，同时最大限度地减少背景信号。
3.显微镜观察和图像分析：观察染色结果时，要选择合适的显微镜，以获得清晰的图像。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
HE染色方法与步骤吐血整理
HE染色方法与步骤吐血整理HE染色试剂配置A：0.5~1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。
以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。
B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少)苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。
C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。
染色流程(1)二甲苯（Ⅰ）15min(2)二甲苯（Ⅱ）15min（3）二甲苯：无水乙醇=1:12min(4)100%乙醇（Ⅰ）5min(5)100%乙醇（Ⅱ）5min(6)80%乙醇5min(7)蒸馏水5min(8)苏木精液染色5min(9)流水稍洗去苏木精液1-3s(10)1%盐酸乙醇1-3s(11)稍水洗10-30s(12)蒸馏水过洗1-2s(13)0.5%伊红液染色1-3min(14)蒸馏水稍洗1-2s(15)80%乙醇稍洗1-2s(16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s(17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s(18)无水乙醇5-10min(19)石炭酸二甲苯5-10min(20)二甲苯（Ⅰ）2min(21)二甲苯（Ⅱ）2min(22)二甲苯（Ⅲ）2min(23)中性树胶封固注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。
②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。
*冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）苏木精液染色（60℃）30～60s（4）流水洗去苏木精液5～10s（5）1%盐酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促蓝液返蓝5～10s（8）流水冲洗15～30s（9）0.5%曙红液染色30～60s（10）蒸馏水稍洗1～2s（11）80%乙醇1～2s（12）95%乙醇1～2s（13）无水乙醇1～2s（14）石炭酸二甲苯2～3s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s（17）中性树胶封固。
免疫组化染色步骤(精)
免疫组化染色步骤
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3. 如果有必要，每张切片加1滴（试剂A）室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗3x3`。
4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃
过夜，建议参见每种抗体的说明书。
5. PBS冲洗3x5`。
除去PBS液，每张切片加1滴或50μl酶二抗聚合物(试剂B)，室温下孵
育40分钟或37度孵育30分钟或4度过夜。
PBS冲洗3x3`。
6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB或AEC使用
说明书），显微镜下观察3-5分钟（DAB）或10分钟（AEC）。
7. 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用0.1%HCl分化，自来水冲洗，PBS返蓝。
8. 如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果
用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。
封片。
免疫组化染色步骤
免疫组织化[检验原理]生物素标记的山羊抗小鼠/兔lgG与结合在组织片上的一抗反应形成免疫复合物，辣根酶标记链霉卵白素与生物素免疫复合物结合进一步形成聚合物，聚合物上的HR催化底物过氧化氢与DAB (或AEC) 反应，最终形成棕褐色(或红色)不溶性色原，从而在显微镜下显示出组织片中的特定杭原的位点。
[试剂]1:内源性过氧化物酶阻断剂试剂2:封闭用正常山羊血清工作液试剂3:生物素标记山羊抗小鼠兔lgG试剂4:辣根酶标记链霉卵白素工作液[储存条件及有效期]2~ 8C避光保存，不得冻存:产品有效期为12个月。
使用时即拿即放，使用后应立即放回冰箱，开封后试剂有效期6个月。
[样本要求]1、标本类型:活检或手术切除标本。
2、标本固定:所有组织标本离体后(1小时内)尽快采用10%中性缓冲福尔马林固定，固定液与所浸泡组织的比例应足够。
固定时间以8~72小时为宜。
3、组织切片:未染色的切片置于室温不宜超过6周，以防抗原丢失。
切片厚度3~ 5μm 黏附在防脱玻片上，56~ 60摄氏度烤片2小时。
[检验方法]1、检验所需仪器、设备:移液器、恒温箱、修复仪、免疫组化笔、计时器、孵育盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶。
2、试剂准备:显色液需要在使用前配制。
3、操作程序:a) 脱蜡和水化石蜡切片置于新鲜二甲萃中，浸泡10分钟x3次:去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟x3次:去除多余的液体后，置于95%乙醇中,浸泡3分钟x2次:去除多余的液体后，置于75%乙醉中，浸泡3分钟x2次:蒸馏水冲洗1分钟，蹕于PBS缓冲液中。
b) 抗原修复，参见抗说明书。
c 阻断内源性过氧化物酶加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟心3次。
d)滴加封闭用正常山羊血清工作液滴加100uL或适量的封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10-15分钟，倾去血清，勿洗。
e)滴加一抗根据组织大小，滴加100pL或适量的抗，37*C孵育60分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟x3次f) 滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔lgG滴加10uL或适量的生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG,室温孵育10-15分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟x3次。
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包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。
包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。
一．石蜡包埋法石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法，它有许多优点，操作简易便于掌握，可进行连续切片，包埋后的组织可以长期保存。
包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。
手工包埋的步骤如下：1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。
从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。
2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。
3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。
4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。
5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。
二．石蜡包埋的注意事项1.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。
其熔点一般要求再60。
C左右。
2.包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。
另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。
3.包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也恰好用完为宜。
4.包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。
5.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷曲。
6.相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致，以利切片。
7.多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时，组织的排列一定要密挤靠拢，以求成直线或方块行，这样有利于切片。
8.石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水中加速冷却可增加石蜡密度，韧性和硬度。
但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。
石蜡切片的制作过程主要包括：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏等步骤●取材和固定：处死动物后立即切取组织块，并快速投入固定液中。
注意事项：1.脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。
2.在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
3.在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
4.如需过夜，应停留在70%酒精中。
5.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。
●浸蜡和包埋：浸蜡：将透明的组织放入蜡杯（Ⅰ）→蜡杯（Ⅱ）→蜡杯（Ⅲ）。
浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为２－４小时左右。
包埋：1. 组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。
从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。
2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。
3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。
4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。
5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。
●切片制作：注意事项：1.室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。
在夏季时可用冰块冷却刀和组织块，减少刀与组织块在过程中产生的热时，使石蜡保持合适的硬度以利于切片。
2.切片经30%的乙醇初展后，再用载玻片捞起蜡带放入展片仪水盒内（一般水温为45℃左右）。
待蜡片带中的组织展平后，即可进行分片和捞片。
3. 切片时要及时清洁刀口、除去蜡屑，否则易引起破碎。
●贴片：待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中以毛面轻靠切片，并用毛笔将切片一边拨于玻片上，随即将玻片直立提起。
一、HE染液的配制：（一） Harris苏木素：苏木素精1g一氧化汞0.5g硫酸铝钾20g量取无水乙醇10ml蒸馏水200ml苏木素溶于无水乙醇，钾明矾溶于蒸馏水，二者混合后煮沸，离火，加入氧化汞，用玻棒搅拌，试剂变为深紫色，立即移入冷水快速冷却，静置一夜，过滤，棕色小磨口试剂瓶密封保存。
使用前加入5%冰乙酸4ml（或冰乙酸3滴）。
（二）0.5%伊红(水溶性)：伊红0.5g95%乙醇25ml蒸馏水75ml先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红碾碎并搅溶，再加入全部蒸馏水，完全溶解后，再加入乙醇，最后加入冰乙酸1滴。
白色小磨口试剂瓶密封保存。
（三）1%盐酸酒精溶液：盐酸 1ml酒精99ml混匀，白色试剂瓶保存。
（四）中性树胶封片剂：往125ml棕色滴瓶中倒入中性树胶若干，加入二甲苯适量用吸管调匀，有一定粘稠度即可。
试剂: 二甲苯1瓶Harris苏木素染液无水乙醇 2瓶 1%盐酸水溶液95%乙醇2瓶0.5%伊红(水溶性)染液二、染色步骤1、80度烤片1小时；2、二甲苯中脱蜡10分钟×3次，用吸水纸吸干液体；3、100%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；4、95%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；；5、流水2分钟，用吸水纸吸干水分；6、Harris苏木素染色5分钟；7、自来水稍洗；8、1%盐酸酒精溶液分化5~10秒（切片由蓝变红）；9、自来水洗返蓝25分钟；10、0.5%伊红(水溶性)染色2分11、95%乙醇脱水5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；12、100%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；13、二甲苯中透明5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；镜下观察结果：细胞核深蓝色，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。
三、注意事项1、苏木素染色时间应根据染液的新鲜或陈旧、及着色力决定。
2、盐酸分化要恰当，分化不足，会核、浆共染，分化过度会造成核染色过浅。
3、水洗蓝化时间应充分，以防褪色。
4、封片后，玻片应及时贴上标签并写上编号。
Masson三色法（根据Masson,1929）一、试剂配制（一）Weigert氏铁苏木素液（可用Herris苏木素代替）甲液：苏木素1g无水酒精（或95％酒精）100ml乙液：29％三氯化铁水溶液4ml蒸馏水95ml （30%三氯化铁溶液则为100ml）盐酸1ml临用时，取甲、乙液等量混合即可应用。
混合时应将乙液加人甲液内，染液呈紫黑色。
铁苏木素不能象明矾苏木素一样配制后可放置贮存备用，因铁与染色剂的色素根会化合生成不溶性沉淀，所以铁作媒染液时，必须与染液分别配制和分别保存，染片时临时混合应用。
由于这是一种铁苏木素，它将胞核染成黑色。
能抵抗在对比染色液中所含分色剂的脱色作用，且不会被光线退色，因此比钾矾苏木素染色较为持久。
（二）丽春红酸性品红液丽春红（Ponceau 2R）0.7g酸性品红（acid fuchsin）0.3g蒸馏水99ml冰醋酸(glacial acetic acid) 1ml（三）1%磷钼酸水溶液磷钼酸（phosphomolybdic acid）1g蒸馏水加至100ml（四）2%苯胺蓝液苯胺蓝（aniline blue）2g冰醋酸（glacial acetic acid ）2ml蒸馏水加至100ml（五）亮绿液亮绿（light green）1g蒸馏水99ml冰醋酸（glacial acetic acid ）1ml（六）Bouin氏液苦味酸饱和液（1.22％）75ml福尔马林25ml冰醋酸5ml此液一般在临用时配制，对皮肤及肌腱有软化作用。
二、操作方法1．组织固定于Bouin氏液，流水冲洗一晚，常规脱水包埋。
2．切片脱蜡至水：（1）二甲苯中脱蜡10分钟×3次，用吸水纸吸干液体；（2）100%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；（3）95%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；；（4）流水2分钟，用吸水纸吸干水分；3．Weiger氏铁苏木素染5-10分钟。
4．流水稍洗。
5．1%盐酸酒精分化。
1min6．流水冲洗数分钟。
25min7．丽春红酸性品红液染5-10分钟。
7min8．蒸馏水稍冲洗。
9．1%磷钼酸水溶液处理约5分钟。
10．不用水洗，直接用苯胺蓝液或绿液复染5分钟。
11．1%冰醋酸处理1分钟。
上下提动12．95%乙醇脱水3分钟，两次；13．95%乙醇脱水5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；14．100%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；15．二甲苯中透明5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；结果：胶原纤维呈蓝色(用苯胶蓝液复染)或绿色(用亮绿复染)。
胞质、肌纤维和红细胞红色。
胞核蓝褐色。
注意事项:1、组织用Bouin氏液或Zenker氏液固定为佳。
如已用10%甲酸液固定,切片可在脱蜡至水后.再放入Bouin氏液作用一晚或置37℃温箱内1-2小时,然后流水冲洗切片至黄色消失再进行染色。
2、铁苏木素染核(见苦味酸一酸性品红法)。
3、如没有丽春红染料,可把酸性品红加至1克来配制。
4、用1%磷钼酸处理时可在镜下控制.见肌纤维呈红色,胶原纤维呈淡红色即可。
Van Gieson氏法染色原理:上面介绍的胶原纤维染色如苦味酸-酸性品红法和三色染色法,都是利用两种或三种阴离子染料混合一起或先后作用而完成鉴别染色的。
Van Gieson氏染色中,为什么胶原纤维呈红色(被酸性品红所染),肌纤维呈黄色(被苦味酸所染).而Masson氏染色时胶原纤维呈蓝色(被苯胺蓝所染),肌纤维呈红色(被酸性品红和丽春红所染),这与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。
组织的渗透性(Permeability),取决于组织的结构密度。
如果细致地观察,会发现组织和细胞成分都是多孔的构造。
不同的组织和细胞成分,它们的孔隙大小是不同的。
孔隙的大小,决定了组织的渗透性。
如孔隙小,组织结构致密,渗透性低；孔隙宽,组织结构疏松,渗透性高。
如已固定的组织用一系列阴离子水溶性染料先后或混合染色,则可发现红细胞被最小分子的阴离子染料着染.肌纤维与胞质被中等大小的阴离子染料着染,而胶原纤维则被大分子的阴离子染料着染。
由此说明了红细胞对阴离子染料的渗透性最小,肌纤维与胞质次之,而胶原纤维具有最大的渗透性。