新型转基因抗除草剂水稻培育
我国杂草科学学科发展现状与展望
我国杂草科学学科发展现状与展望作者：潘浪刘敏刘伟堂等来源：《植物保护》2023年第05期关键词杂草科学；杂草生物学与生态学；抗药性机制；除草剂安全剂；防控技术中图分类号：S 451.1 文献标识码：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2023294我国是杂草危害最严重的国家之一，全国共有杂草1430余种（变种），造成严重危害的130余种，每年由于杂草危害造成的作物产量损失达9.7%。
农田杂草侵占农田地上和地下部空间，与作物争水、争肥、争光，影响作物的正常生长；有些杂草是多种病虫害的重要中间寄主；有些杂草会恶化环境，破坏生态；有些杂草含有毒成分，影响人畜健康和安全。
农田杂草大大降低了作物的产量和质量，增加了管理用工和生产成本，严重威胁农业生产。
杂草科学是研究杂草生物学特性、生长发育规律、分类与鉴定、分布与危害、群落结构与演替、抗药性机制、防治技术的综合学科。
杂草生物学和生态学研究是认知杂草的重要基础，杂草致灾机制、杂草抗药性机制研究是构建杂草防控技术体系的理论依据，而杂草综合防控技术研究则是农业产业持续健康发展的重要保障。
近5年（2018年—2022年）来，在国家自然科学基金等项目的支持下，我国杂草科学研究取得了系列重要进展。
本文重点阐述了近年来我国杂草科学在杂草生物学和生态学、杂草抗药性机理、除草剂安全剂作用机理、杂草综合防控技术等领域取得的重点研究进展和成果，并展望了今后杂草科学的发展方向。
1学科发展现状1.1杂草生物学和生态学1.1.1杂草基因组学基因组学技术的不断发展和创新为杂草科学研究带来新机遇，有助于探索杂草适应性进化机制。
Ye等结合二代Illumina、三代PacBio以及HiC技术获得了稗属Echinochloa六倍体稗E.crus-gal-li（L.）P.Beauv.、四倍体水田稗E.oryzoides（Ard.） Flritsch.和二倍体E.haploclada （Stapf）Stapf的高质量参考基因组。
PPO抑制剂类除草剂的抗性进展
表1 三氟苯嘧啶制剂在中国的登记情况国外登记方面，美国杜邦公司于2017年在美国获得了三氟苯嘧啶的进口许可，商品名为Pyraxalt®（10%三氟苯嘧啶SC）。
三氟苯嘧啶于2018年在越南获得登记，商品名为Pexena®（106 g/L 三氟苯嘧啶SC），用于防治水稻褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱。
同年，10%三氟苯嘧啶SC 在印度的9（3）类制剂登记也获得批准。
三氟苯嘧啶在日本、韩国、菲律宾、马来西亚、印度尼西亚和泰国等国家的登记正在进行中。
7 小结作为第一个商业化的介离子嘧啶酮类杀虫剂，三氟苯嘧啶以其新颖的作用机理和对同翅目害虫的高防效、长持效性，对哺乳动物和有益生物的无影响或低毒性，对水稻等作物安全的突出特点而被高度关注。
三氟苯嘧啶能够有效防控对现有药剂产生抗性的水稻褐飞虱和白背飞虱，同时可控制由稻飞虱传播的多种病毒病害，用于有害生物的综合防治。
通过其与不同或相似作用机理的杀虫剂复配，可以扩大杀虫谱，发挥协同防除效果，减缓抗性风险。
由于目前三氟苯嘧啶还处于专利保护初期，其深度开发和研究应用有待进行。
随着三氟苯嘧啶在多国登记的陆续获批和应用推广的不断深入，其市场潜力巨大。
PPO 抑制剂类除草剂的抗性进展杂草危害越来越严重，目前为止防除杂草最有效的办法就是施用化学除草剂，过多地使用化学除草剂会导致抗药性的产生。
原卟啉原氧化酶（PPO）是创制新型除草剂品种的主要靶标之一，占市场比例相对较大。
由于PPO 抑制剂主要作用于叶绿素，对哺乳动物毒性低，因而该类除草剂具有高效、低毒、安全的作用特点，是开发新型除草剂的主要目标之一。
本文在综述PPO 抑制剂作用机制的基础上，介绍PPO 抑制剂的抗性现状及研究进展，并提出相应的解决措施。
1 PPO 抑制剂的作用机制动物、植物、细菌和真菌中都含有原卟啉原氧化酶，它在分子氧的条件下，催化原卟啉原IX 生成原卟啉IX，原卟啉原氧化酶是四吡咯生物合成中的最后一个普通酶，主要合成亚铁血红素和叶绿素。
除草剂抗性基因的研究进展
除草剂抗性基因的研究进展王国增;李轶女;张志芳;沈桂芳【摘要】This review overviewed mainly about the kinds of herbicide resistance genes, their main resource and the application of herbicide resistance genes. Moreover, we also discussed the discovery of the novel herbicide resistance genes, the modification of herbicide resistance gene using genetic and protein engineering, the mechanisms of herbicide resistance and new herbicide resistance transgenic crops breeding.%概述了除草剂抗性基因的种类,主要来源以及抗除草剂基因的应用。
并对新的抗除草剂基因的发掘、既有的抗除草剂基因的改良、除草剂抗性机理研究以及新的抗除草剂作物的培育等方面的进一步研究进行了探讨。
【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2011(001)006【总页数】5页(P398-402)【关键词】农作物;除草剂抗性;基因工程;转基因【作者】王国增;李轶女;张志芳;沈桂芳【作者单位】中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081【正文语种】中文【中图分类】S646.12杂草是农作物生长过程中不需要的植物,它们与农作物在水分、营养、阳光和空间上形成竞争而导致农作物的减产并降低作物的品质[1]。
优良品种培育提升农业效率
优良品种培育提升农业效率一、优良品种培育的重要性优良品种培育在农业发展中占据着核心地位，是提升农业效率的关键因素。
其重要性主要体现在以下几个方面：1. 提高产量潜力优良品种通过优化植物的生长特性和生理机能，具备更强的光合作用能力、养分吸收效率以及抗逆性等，从而显著提高农作物的产量潜力。
例如，现代小麦品种经过精心选育，在适宜的种植条件下，亩产量相较于传统品种有了大幅提升，能够为不断增长的人口提供更充足的粮食供应。
2. 增强抗逆性面对日益复杂多变的自然环境，如干旱、洪涝、病虫害等灾害频发，优良品种展现出卓越的抗逆能力。
它们能够在逆境条件下保持相对稳定的生长和发育，减少产量损失。
例如，某些抗虫棉花品种含有特定的基因，能够抵御棉铃虫等害虫的侵袭，降低化学农药的使用量，同时保障棉花的产量和质量。
3. 改善品质特性随着消费者对农产品品质要求的不断提高，优良品种在品质改良方面发挥着重要作用。
无论是水果的口感、色泽、甜度，还是粮食作物的蛋白质含量、加工品质等，都可以通过品种选育得到优化。
例如，优质的水果品种不仅口感鲜美，而且在外观上更具吸引力，市场竞争力更强，能够满足消费者多样化的需求，同时为农产品加工企业提供更优质的原料，提高农产品附加值。
4. 适应不同生态环境不同地区的土壤、气候、海拔等生态条件差异巨大，优良品种的培育能够使其更好地适应特定的生态环境，实现农业生产的区域化布局和可持续发展。
例如，在高寒地区培育出的耐寒作物品种，能够在低温环境下正常生长发育，充分利用当地的土地资源，拓展了农业生产的边界。
二、优良品种培育的技术与方法优良品种培育是一个复杂而系统的工程，涉及多种技术与方法的综合运用。
以下是一些主要的方面：1. 传统育种技术- 选择育种：这是最古老且基础的育种方法，通过对自然变异群体进行观察和筛选，挑选出具有优良性状的个体进行繁殖和培育。
例如，农民在长期的种植过程中，会选择产量高、品质好、抗病虫害能力强的植株留种，经过多代选育，逐渐形成具有优良特性的地方品种。
我国水稻抗逆性研究进展
我国水稻抗逆性研究进展黄志谋;沈其文;蔡克桐;周慧梅【摘要】Progress of rice resistance research in China was concluded in the study based on exploitation of wild rice, breeding of hybrid rice,rnnew resistant rice variety, rice resistance gene, relation between hormone and rice resistance, effects of Si and Ca on yield increase, providingrnreferences for research of rice yield improvement.%从野生稻抗性的挖掘利用、杂交稻的选育及水稻新抗逆性品种、水稻抗逆功能基因研究、激素与水稻的抗逆性、矿质元素硅和钙对水稻抗逆性增产作用5个方面对我国水稻抗逆性研究进展进行了综述,为提高水稻产量的研究提供了参考.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(041)001【总页数】4页(P129-132)【关键词】水稻;抗逆性;育种;抗性基因;激素【作者】黄志谋;沈其文;蔡克桐;周慧梅【作者单位】湖北省咸宁市农业科学院,湖北咸宁437100;湖北省咸宁市农业科学院,湖北咸宁437100;湖北省咸宁市农业科学院,湖北咸宁437100;华中农业大学,湖北武汉430070【正文语种】中文【中图分类】S511水稻对各种胁迫（或称逆境）因子如抗寒、抗旱、抗盐、抗病虫害等抗御能力称为水稻抗逆性［1］。
近年来，全球自然灾害发生次数多、影响大。
同时人口增加、社会经济发展变化、水资源短缺、土壤盐碱荒漠化的趋势和农业劳动力短缺等日益加剧，由此带来的各种胁迫直接影响到水稻的生产、水稻面积和单产［2］。
转基因水稻品种
转基因水稻品种一、转基因水稻的概念转基因水稻是指通过基因工程技术将外源基因导入水稻基因组中，从而使水稻获得新的性状或特性的水稻品种。
例如，可能导入抗虫基因使水稻能够抵抗特定害虫的侵害，或者导入抗除草剂基因方便田间杂草管理等。
1. 抗虫转基因水稻- Bt转基因水稻- 原理：将苏云金芽孢杆菌（Bt）中的杀虫蛋白基因导入水稻。
Bt蛋白能够特异性地毒杀鳞翅目害虫，如螟虫等。
当害虫取食转基因水稻后，Bt蛋白在害虫肠道内被激活，与肠道上皮细胞表面的特异性受体结合，造成肠道穿孔，最终导致害虫死亡。
- 优势：显著减少化学杀虫剂的使用量。
传统防治螟虫等害虫需要多次喷洒农药，这不仅成本高，而且农药残留会对环境和人类健康造成潜在威胁。
抗虫转基因水稻能在很大程度上解决这些问题，提高水稻产量的稳定性。
- CpTI转基因水稻- 原理：豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因被导入水稻。
CpTI能够抑制害虫体内的胰蛋白酶活性，从而影响害虫的消化过程，达到抗虫的目的。
- 优势：具有较广的抗虫谱，对多种害虫都有一定的抑制作用。
同时，由于其作用机制与Bt蛋白不同，两者结合使用可以延缓害虫对单一抗虫基因产生抗性。
2. 抗除草剂转基因水稻- 例如，导入抗草甘膦基因的水稻。
- 原理：草甘膦是一种广谱性的除草剂，它通过抑制植物体内的5 - 烯醇丙酮莽草酸 - 3 - 磷酸合成酶（EPSPS）的活性来杀死植物。
抗草甘膦转基因水稻中导入了经过修饰的EPSPS基因，这种基因编码的酶对草甘膦不敏感，从而使水稻在使用草甘膦除草剂时能够正常生长，而杂草被有效清除。
- 优势：方便田间杂草管理。
在传统水稻种植中，人工除草劳动强度大，化学除草容易对水稻产生药害。
抗除草剂转基因水稻可以在水稻生长期间精准地使用草甘膦进行除草，提高田间管理效率，减少杂草与水稻争肥、争光等情况，有助于提高水稻产量。
三、转基因水稻的安全性争议1. 环境安全方面- 基因漂移问题- 争议点：转基因水稻中的外源基因可能通过花粉传播等方式漂移到野生稻或其他近缘植物中，从而可能改变野生植物的基因组成和生态特性。
EMS_诱变创制水稻抗乙酰辅酶A_羧化酶抑制剂类除草剂种质
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３０５￣３１２ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ江㊀群ꎬ凌溪铁ꎬ唐兆成ꎬ等.ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３０５￣３１２.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０２.００１ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质江㊀群１ꎬ㊀凌溪铁２ꎬ㊀唐兆成２ꎬ㊀周珍珍２ꎬ㊀张保龙１ꎬ２(１.海南大学热带作物学院/三亚南繁研究院ꎬ海南海口５７０２２８ꎻ２.江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所/江苏省农业生物学重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２２￣１１￣２５基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目[ＣＸ(２１)２０４１]作者简介:江㊀群(１９９８－)ꎬ女ꎬ四川宜宾人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事水稻抗除草剂育种研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)１６９２５７９２６４＠ｑｑ.ｃｏｍ通讯作者:张保龙ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈｂｌ２２４８＠ｈｏｔｍａｉｌ.ｃｏｍꎻ周珍珍ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈｅｎｚｈｅｎｚｈｏｕｎｊ＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀创制非转基因抗除草剂水稻种质资源对于稻田杂草防控具有重要价值ꎮ本研究以甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)水溶液诱变镇糯１９水稻种子ꎬ获得１株能稳定遗传的可耐受乙酰辅酶Ａ羧化酶(ＡＣＣａｓｅ)抑制剂类除草剂高效盖草能的Ｍ３代水稻幼苗(突变体)ꎮ分别扩增镇糯１９野生型和突变体的基因组ＤＮＡ并进行测序和序列比对ꎬ发现突变体ＡＣＣａｓｅ基因的开放阅读框(ＯＲＦ)的第５３７４位碱基发生了点突变ꎬ导致编码的第１７９２位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸ꎮ镇糯１９野生型和突变体分蘖盛期大田喷施３种田间推荐剂量的ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂后农艺性状调查结果表明突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯抗性明显高于野生型ꎮ本研究获得了能稳定遗传的非转基因抗ＡＣ￣Ｃａｓｅ抑制剂类水稻新种质ꎬ具有一定的应用价值ꎬ为抗除草剂水稻育种提供了种质资源ꎮ关键词:㊀水稻ꎻ抗除草剂种质ꎻ甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)ꎻ乙酰辅酶Ａ羧化酶中图分类号:㊀Ｓ３３５.３㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０２￣０３０５￣０８ＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｔｏｃｒｅａｔｅｒｉｃｅａｎｔｉ￣ａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ￣ｈｅｒ￣ｂｉｃｉｄｅｇｅｒｍｐｌａｓｍＪＩＡＮＧＱｕｎ１ꎬ㊀ＬＩＮＧＸｉ￣ｔｉｅ２ꎬ㊀ＴＡＮＧＺｈａｏ￣ｃｈｅｎｇ２ꎬ㊀ＺＨＯＵＺｈｅｎ￣ｚｈｅｎ２ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＢａｏ￣ｌｏｎｇ１ꎬ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓ/ＳａｎｙａＮａｎｆａｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＨａｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨａｉｋｏｕ５７０２２８ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＢｉｏ￣ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ/ＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｉｓｏｆｇｒｅａｔｖａｌｕｅｆｏｒｗｅｅｄｃｏｎｔｒｏｌｉｎｒｉｃｅｆｉｅｌｄｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬＺｈｅｎｎｕｏ１９ｒｉｃｅｓｅｅｄｓｗｅｒｅｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄｂｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ(ＥＭＳ)ｓｏｌｕｔｉｏｎꎬａｎｄａＭ３ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｒｉｃｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｉｔｈｓｔａｂｌｅｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅａｎｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ(ＡＣＣａｓｅ)ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ.ＴｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｓｏｆｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｔｈｅｍｕｔａｎｔｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓａｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎａｔｔｈｅ５３７４ｔｈｂａｓｅｏｆｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅＡＣＣａｓｅｇｅｎｅꎬｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎａｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｃｏｄｅｄ１７９２ｔｈａｍｉｎｏａｃｉｄｆｒｏｍｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｔｏｌｅｕｃｉｎｅ.ＴｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆＡＣＣａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｗｅｒｅｓｐｒａｙｅｄｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄａｎｄｔｈｅａｇｒｏｎｏｍｉｃｔｒａｉｔｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｍｕｔａｎｔｔｏｈａｌｏｘｙ￣ｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌꎬｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌａｎｄｐｉｎｏｘａｄｅｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬａｎｅｗｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｗｉｔｈＡＣＣａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄꎬｗｈｉｃｈｈａｄｃｅｒｔａｉｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｖａｌｕｅａｎｄｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｆｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｒｉｃｅꎻｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｒｍｐｌａｓｍꎻｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ(ＥＭＳ)ꎻａｃｅｔｙｌＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ５０３㊀㊀水稻是中国三大粮食作物之一ꎬ培育高产稳产的优质水稻是解决粮食问题的关键ꎮ稻田杂草严重影响水稻的产量和品质ꎬ杂草导致中国稻谷每年亏损率超过１５％ꎬ部分地区甚至超过５０％[１]ꎮ化学除草是当今世界使用最多的稻田除草方法ꎮ然而ꎬ过度使用除草剂不仅会导致杂草对除草剂产生抗性ꎬ还会对作物产生药害㊁降低水稻产量和品质ꎬ严重时甚至造成水稻颗粒无收[２]ꎮ因此ꎬ培育抗除草剂的水稻品种可以经济有效地解决稻田的杂草防除问题ꎮ乙酰辅酶Ａ羧化酶(ＡＣＣａｓｅ)是植物初级代谢中脂肪酸合成的关键酶之一ꎬ其主要功能是将乙酰辅酶Ａ羧化为丙二酰辅酶Ａꎮ该反应是脂肪酸合成的第一步ꎬ也是限速的关键步骤[３]ꎮ脂肪酸不仅是功能物质甘油三脂的组成成分ꎬ还能转化为作为细胞膜组成成分的磷脂[４]ꎮ自１９５８年发现乙酰辅酶Ａ羧化酶可作为除草剂的作用靶标后ꎬ针对该靶标已开发了三大类除草剂并商品化应用ꎬ分别是芳氧苯氧基丙酸酯类(ＡＰＰ)[５]㊁环己烯酮类(ＣＨＤ)[６]和新苯基吡唑啉类(ＤＥＮ)[７￣８]ꎮ其中ꎬＡＰＰ类除草剂包括高效氟吡甲禾灵(Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌꎬ又称高效盖草能)㊁精喹禾灵(Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌ)㊁精恶唑禾草灵(Ｆｅｎｏｘａｐｒｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌꎬ又称骠马)㊁恶唑酰草胺(Ｍｅｔａｍｉｆｏｐ)和氰氟草酯(Ｃｙｈａｌｏｆｏｐ￣ｂｕｔｙｌ)等ꎮＣＨＤ类除草剂包括烯禾啶(Ｓｅｔｈｏｘｙｄｉｍ)㊁噻草酮(Ｃｙ￣ｃｌｏｘｙｄｉｍ)和环苯草酮(Ｐｒｏｆｏｘｙｄｉｍ)等ꎻＤＥＮ类除草剂有唑啉草酯(Ｐｉｎｏｘａｄｅｎ)ꎮ乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂主要被用于控制禾本科杂草ꎬ具有高效㊁低毒㊁对后茬作物安全等特点[９]ꎮ目前ꎬ水稻生产中登记并许可使用的乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂仅有氰氟草酯㊁恶唑酰草胺和环苯草酮ꎬ这极大限制了水稻生产中杂草的防治ꎮ因此培育抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂水稻ꎬ不仅可以拓宽稻田除草剂的选择和使用范围ꎬ还可有效控制稻田杂草的发生与危害ꎮ化学诱变是培育和筛选抗性除草剂作物种质资源的重要方法ꎮＥＭＳ是非常有效且负面影响小的化学诱变剂ꎬ被广泛应用于构建优良性状的水稻突变体[１０￣１２]ꎮ顾佳清等利用ＥＭＳ处理粳稻品种中花１１ꎬ从诱变的水稻群体中筛选出高产的突变体ꎬ经过后代的纯化ꎬ得到了一个可以直接推广应用的水稻突变新品系申化一号[１３]ꎮ陈忠明等通过ＥＭＳ处理籼稻９３１１ꎬ筛选出了大粒的突变体Ｍ３１６和长穗突变体９３１１ｅＲ[１４￣１５]ꎮ本课题组用ＥＭＳ诱变处理包括９３１１在内的多个水稻品种ꎬ成功筛选到多个抗咪唑啉酮类除草剂的突变体ꎬ进一步鉴定结果表明突变均发生在编码乙酰乳酸合成酶(ＡＬＳ)靶标基因上[１６]ꎮ本研究通过ＥＭＳ诱变糯稻品种镇糯１９构建突变群体ꎬ用ＡＰＰ类除草剂高效盖草能去筛选诱变处理后的Ｍ２代幼苗ꎬ获得能稳定遗传的抗性植株ꎬ并对抗性植株的ＡＣＣａｓｅ基因位点突变㊁氨基酸序列变异进行鉴定ꎬ最后就３种不同ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂对获得的抗除草剂材料农艺性状影响进行分析ꎬ旨在为水稻抗除草剂育种提供依据和材料ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料与试剂供试水稻材料镇糯１９由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所提供ꎮ试验所用除草剂的种类及相关信息见表１ꎮ表１㊀本试验所用除草剂Ｔａｂｌｅ１㊀Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ名称㊀类别来源推荐田间施用剂量(ｇ/ｈｍ２ꎬａ.ｉ.)高效盖草能ＡＰＰ江苏中旗科技股份有限公司６４.８精喹禾灵ＡＰＰ天津中农立华农用化学品有限公司６０.０唑啉草酯ＤＥＮ瑞士先正达作物保护有限公司４５.０㊀㊀生物试剂甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)购自美国Ｓｉｇｍａ￣Ａｌｄｒｉｃｈ公司ꎬ２ˑＲａｐｉｄＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ㊁ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ￣ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司ꎬＣＴＡＢ购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司ꎮ１.２㊀镇糯１９水稻种子的ＥＭＳ诱变及抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂突变体的筛选㊀㊀镇糯１９种子(Ｍ１代)清水浸泡２ｈ后ꎬ用质量浓度５ ０ｍｇ/ｍｌ的ＥＭＳ水溶液浸种处理１４ｈꎬ硫代硫酸钠中和３０ｍｉｎ后ꎬ将种子捞出并用清水冲洗５~６遍ꎮ将诱变处理后的种子播种于大田ꎬＭ１代植株成熟后ꎬ种子混收(Ｍ２代)作为突变群体库ꎮ从突变群体库中取Ｍ２代种子播种于大棚苗床ꎬ待水稻幼苗长至３~４叶期时喷施６４ ８ｇ/ｈｍ２ꎬａ.ｉ.高效盖草６０３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期能ꎬ施药后２１ｄ观察记录水稻表型并将正常生长的水稻苗移栽至盆钵内ꎬ单株收获种子得到突变体种子(Ｍ３代)ꎬＭ３代种子播种后得到Ｍ３代幼苗ꎮ１.３㊀抗除草剂突变体ＡＣＣａｓｅ基因的ＰＣＲ鉴定和碱基序列分析㊀㊀从国家水稻数据中心数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｒｉｃｅ￣ｄａｔａ.ｃｎ/)获得水稻ＡＣＣａｓｅ基因(ＯｓＡＣＣꎬ序列号为ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ２２９４０)的碱基序列ꎮ根据ＯｓＡＣＣ基因的保守序列使用ＳｎａｐＧｅｎｅ６.０.２软件进行特异性引物设计ꎬ共设计了８对引物ꎬ分别是ＯｓＡＣＣ￣Ｆ１~Ｏｓ￣ＡＣＣ￣Ｆ８和ＯｓＡＣＣ￣Ｒ１~ＯｓＡＣＣ￣Ｒ８(表２)ꎮ表２㊀本试验所用引物Ｔａｂｌｅ２㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ引物名称㊀序列(５ᶄң３ᶄ)ＰＣＲ产物长度(ｂｐ)ＯｓＡＣＣ￣Ｆ１ＧＴＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＧＧＧ１４２２ＯｓＡＣＣ￣Ｒ１ＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＡＡＴＧＴＡＣＴＯｓＡＣＣ￣Ｆ２ＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＴＡＴＧＣ１６１４ＯｓＡＣＣ￣Ｒ２ＴＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＯｓＡＣＣ￣Ｆ３ＣＣＣＴＡＴＴＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧ１５９７ＯｓＡＣＣ￣Ｒ３ＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＧＣＡＴＧＡＴＧＧＡＯｓＡＣＣ￣Ｆ４ＣＡＡＡＣＧＴＡＧＡＣＴＡＣＡＣＡＧＴＴＧＡＣ１６４１ＯｓＡＣＣ￣Ｒ４ＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＴＧＡＧＡＡＯｓＡＣＣ￣Ｆ５ＴＴＧＡＣＡＡＧＧＴＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＴＣＣ１６３５ＯｓＡＣＣ￣Ｒ５ＡＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡＴＴＣＡＣＧＯｓＡＣＣ￣Ｆ６ＴＣＴＡＴＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣ１６３１ＯｓＡＣＣ￣Ｒ６ＡＡＴＧＧＣＣＡＧＴＴＣＴＡＡＴＴＧＣＧＯｓＡＣＣ￣Ｆ７ＡＧＴＴＴＴＣＴＴＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＴ１６３４ＯｓＡＣＣ￣Ｒ７ＧＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＴＡＴＯｓＡＣＣ￣Ｆ８ＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧ１８６６ＯｓＡＣＣ￣Ｒ８ＣＡＧＡＣＴＴＧＣＡＣＴＴＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡ㊀㊀采用ＣＴＡＢ法[１４]提取水稻的基因组ＤＮＡꎬ取Ｍ３代三叶一心期的叶片０ ５ｇ放在带有１颗小钢珠的２ｍｌ离心管中ꎬ放到液氮中冷冻至叶片组织变脆ꎬ再将离心管放到频率为６０Ｈｚ的组织研磨机研磨２ｍｉｎꎬ然后加入４００μｌＣＴＡＢ提取液ꎬ离心管６５ħ水浴３０ｍｉｎ后ꎬ在通风橱中加入４００μｌ氯仿ꎬ充分混匀至提取液呈乳绿色ꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ在离心期间标记好管号ꎬ将６００μｌ无水乙醇加入到已经标记好的１ ５ｍｌ离心管中ꎬ移液枪吸取上清液３００μｌ加到已经准备好的离心管中ꎬ上下颠倒混匀再沉淀１ｈ以上ꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ倒掉上清液ꎬ开盖ꎬ室温下风干１２ｈ至离心管底部有明显的白色ＤＮＡ沉淀ꎬ风干后加入灭菌蒸馏水２００μｌꎬ于－２０ħ保存ꎮ以Ｍ３代的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ采用２ˑＲａｐｉｄＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ或ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ￣ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ聚合酶扩增ＯｓＡＣＣ基因的８个片段ꎮ用１％琼脂糖凝胶进行电泳检测ꎮ将条带大小正确的ＰＣＲ产物送南京擎科生物科技有限公司进行测序ꎻ使用ＳｎａｐＧｅｎｅ６.０.２软件分析测序结果ꎬ明确野生型和突变体的ＯｓＡＣＣ基因碱基序列差异性ꎮ１.４㊀喷施除草剂后水稻农艺性状调查２０２２年在江苏省农业科学院试验基地进行镇糯１９野生型和突变株系对３种乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂耐受性试验ꎮ５月中旬播种ꎬ６月中旬插秧ꎮ试验设分别喷施高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水对照４个处理ꎬ每处理２.５ｍˑ４ ０ｍꎮ移栽行距为０ ２５ｍꎬ株距为０ １５ｍꎮ按照常规大田生产进行浇水和施肥等田间管理ꎮ镇糯１９野生型和突变体幼苗移栽大田２７ｄ后ꎬ进行高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水(ＣＫ)的喷施处理ꎮ除草剂的用量见表１ꎮ各处理选择连续的２０株ꎬ在水稻喷施除草剂前以及喷施除草剂后３０ｄ㊁９０ｄ进行茎蘖数㊁株高㊁主茎旗叶长度等农艺性状调查ꎮ其中ꎬ喷药后９０ｄꎬ水稻已进入成熟期ꎬ统计的茎蘖数为成穗数ꎮ１.５㊀数据处理与统计分析采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１９进行数据处理ꎬ用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８.０.１软件进行统计分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀抗除草剂突变体筛选高效盖草能是一种内吸传导型除草剂ꎬＥＭＳ诱变的镇糯１９Ｍ２代水稻幼苗在３~４叶期喷施高效盖草能７ｄ后ꎬ绝大部分水稻幼苗叶片颜色变成浅绿ꎻ喷施高效盖草能２１ｄ后ꎬ敏感植株叶片几乎完全失去绿色㊁部分已经枯死ꎻ具有抗性的植株能继续正常生长ꎮ经大量筛选后ꎬ最终获得１株具有高效盖草能抗性的Ｍ２单株(图１)ꎬ成熟后收获单株种子ꎬ得到Ｍ３代抗性突变体ꎮ２.２㊀ＯｓＡＣＣ突变位点已知高效盖草能的作用靶标是ＡＣＣａｓｅꎬ植物对７０３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质图１㊀喷施高效盖草能后筛选到的Ｍ２代抗性水稻植株Ｆｉｇ.１㊀Ｍ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｐｌａｎｔｓｃｒｅｅｎｅｄａｆｔｅｒｓｐｒａ￣ｙｉｎｇｗｉｔｈ６４.８ｇａ.ｉ./ｈｍ２ｈａｌｏｘｙｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌ高效盖草能的抗性主要源于ＡＣＣａｓｅ基因的突变[１７￣１９]ꎮ为了确定突变体中靶标基因是否发生突变ꎬ我们用了８对引物对野生型(镇糯１９￣ＷＴ)和抗性Ｍ３单株(镇糯１９￣１７９２)的基因进行扩增ꎬ全部都获得了与预期大小相符合的条带(图２)ꎮ㊀㊀上述ＰＣＲ扩增的产物经测序和碱基序列比对ꎬ发现相对于野生型ＯｓＡＣＣ的ＯＲＦꎬ突变体ＯｓＡＣＣ基因中存在一个点突变ꎬ其开放阅读框(ＯＲＦ)的第５３７４位碱基由Ａ突变成Ｔꎬ从而引起编码的第１７９２位氨基酸由异亮氨酸(Ｉｌｅ)突变为亮氨酸(Ｌｅｕ)(图３Ａ)ꎮＯｓＡＣＣ蛋白的全长有２３２７个氨基酸ꎬ将Ｏｓ￣ＡＣＣ蛋白全长氨基酸序列在ＮＣＢＩ的ＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏ￣ｍａｉｎ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｓｔｒｕｃ￣ｔｕｒｅ/ｃｄｄ/ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ)进行保守结构域分析ꎬ发现其包含了４个结构域(Ｄｏｍａｉｎ):生物素羧化酶(ＢＣ)㊁生物素羧基载体蛋白(ＢＣＣＰ)㊁乙酰辅酶Ａ羧化酶中心(ＡＣＣｃｅｎｔｒａｌ)和羧基转移酶(ＣＴ)(图３Ｂ)ꎮ进一步的氨基酸序列分析结果表明ꎬ突变体中第１７９２位氨基酸的突变位于ＣＴ结构域ꎬ该突变类型与已报道的大穗看麦娘(Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ)的抗性位点突变类型是一致的ꎬ对应于其ＡＣＣａｓｅ氨基酸序列第１７８１位点ꎻ突变类型也相同ꎬ均由Ｉｌｅ突变为Ｌｅｕ(图３Ｂ和３Ｃ)[１７]ꎮ因此ꎬ突变体抗除草剂功能的获得是由ＯｓＡＣＣ氨基酸序列第１７９２位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸引起的ꎮ２.３㊀突变体的农艺性状在分别喷施高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯１４ｄ后ꎬ野生型植株生长均受到了显著影响ꎬ大部分植株叶片出现枯黄症状ꎮ突变体植株在分别喷施以上３种除草剂后ꎬ叶片仍然是绿色且可以正常生长ꎬ表明突变体对这３种除草剂均具有抗性(图４)ꎮ㊀㊀分蘖期分别喷施３种不同除草剂后ꎬ野生型和突变体株高㊁分蘖数及旗叶长度的变化如图５所示ꎮ结果显示ꎬ在喷施清水处理的情况下ꎬ野生型和突变体植株的株高在处理前(０ｄꎬ即幼苗移栽到大田２７ｄ)基本没有差异ꎬ但在处理后３０ｄ和９０ｄꎬ突变体的株高显著低于野生型的株高(图５Ａ)ꎻ两者在处理前㊁后的单株茎蘖数均无明显差异(图５Ｅ)ꎮ在分别喷施３种不同除草剂前(０ｄ)ꎬ野生型和突变体植株的株高和单株分蘖数都没有明显差异ꎬ但是在喷施处理后ꎬ两者受除草剂的影响表现出明显差异(图５Ｂ~图５Ｄ㊁图５Ｆ~图５Ｈ)ꎮ其中ꎬ在喷施高效盖草能３０ｄ和９０ｄ后ꎬ突变体的株高均显著高于野生型(图５Ｂ)ꎬ单株茎蘖数也显著多于野生型(图５Ｆ)ꎮ野生型对精喹禾灵和唑啉草酯都非常敏感ꎬ喷施田间推荐剂量后水稻植株均死亡ꎬ因此未统计喷药后的株高和分蘖数ꎬ而突变体对这两种除草剂表现出较强的抗性ꎬ所有植株存活且能正常生长ꎬ株高随时间逐渐增加(图５Ｃ和５Ｄ)ꎮ突变体的单株茎蘖数在精喹禾灵处理后随时间呈先增后减趋势ꎬ但经唑啉草酯处理后变化不明显ꎬ未出现明显增加现象(图５Ｇ和５Ｈ)ꎮ喷施清水处理的突变体旗叶长度显著短于野生型ꎻ高效盖草能处理后ꎬ突变体的旗叶长度显著长于野生型(图５Ｉ)ꎮ由于野生型在喷施田间推荐剂量的精喹禾灵和唑啉草酯后植株已经枯死ꎬ因此未能进行旗叶长度统计ꎮ综合以上结果ꎬ在田间推荐剂量下ꎬ突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯的抗性水平均高于野生型ꎮ３㊀讨论植物对除草剂的抗性机制包括非靶标和靶标抗性两大类ꎮ其中ꎬ非靶标抗性是由靶标基因以外的突变引起的ꎬ使植物对除草剂的吸收或转运率降低㊁螯合或代谢作用增强ꎻ靶标抗性是由除草剂的靶标基因发生突变引起的[２０]ꎮ现在已发现的大部分植物抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的抗性机制是由于ＡＣＣａｓｅ基因碱基突变引起氨基酸位点发生变异ꎬ这也是导致杂草抗药性产生的主要原因[２１￣２２]ꎮ截止８０３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期Ｍ表示ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ泳道１表示野生型ꎻ泳道２表示突变体ꎮＦ１~Ｆ８㊁Ｒ１~Ｒ８为引物ꎬ见表２ꎮ图２㊀镇糯１９野生型和突变体中ＯｓＡＣＣ基因的ＰＣＲ扩增结果Ｆｉｇ.２㊀ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＯｓＡＣＣｉｎＺｈｅｎｎｕｏ１９ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔＡ:突变体(镇糯１９￣１７９２)中ＯｓＡＣＣ基因的Ｓａｎｇｅｒ测序色谱图ꎻＢ:ＯｓＡＣＣ蛋白结构域示意图ꎻＣ:野生型(镇糯１９￣ＷＴ)和突变体(镇糯１９￣１７９２)的羧基转移酶(ＣＴ)结构域氨基酸序列比对ꎮ图３㊀镇糯１９突变体中突变基因ＯｓＡＣＣ及其编码氨基酸序列分析Ｆｉｇ.３㊀ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｕｔａｎｔｇｅｎｅＯｓＡＣＣａｎｄｉｔｓｅｎｃｏｄｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎＺｈｅｎｎｕｏ１９ｍｕｔａｎｔ９０３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质镇糯１９￣ＷＴ㊁镇糯１９￣１７９２分别表示镇糯１９野生型和突变体ꎻＧＣＮ㊁ＪＫ㊁ＺＬ和Ｈ２Ｏ分别表示喷施高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水处理ꎮ图４㊀镇糯１９野生型和突变体田间喷施不同除草剂后的表型Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆＺｈｅｎｎｕｏ１９ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔａｆｔｅｒｓｐｒａｙｉｎｇｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ目前ꎬ杂草中已报道了十几种ＡＣＣａｓｅ氨基酸置换与其抗药性相关ꎬ分别对应于大穗看麦娘ＡＣＣａｓｅ的７个氨基酸位点(均位于ＣＴ结构域内):第１７８１位㊁第１９９９位㊁第２０２７位㊁第２０４１位㊁第２０７８位㊁第２０８８位和第２０９６位[２２￣２５]ꎮ在以上这些突变中ꎬ以第１７８１位氨基酸由Ｌｅｕ突变成Ｉｌｅ最为普遍ꎬ对三大类不同的ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂都表现出高抗性ꎬ却没有适合度代价(Ｆｉｔｎｅｓｓｃｏｓｔ)[２６￣２８]ꎮ本研究通过筛选ＥＭＳ诱变的镇糯１９水稻突变体ꎬ鉴定到了１个能稳定遗传的抗除草剂突变体ꎮ对突变体进行了基因鉴定ꎬ确定其编码靶标蛋白ＯｓＡＣＣ的第１７９２位氨基酸由Ｌｅｕ突变成Ｉｌｅꎮ该突变类型与已报道的突变类型一致ꎬ对应于大穗看麦娘ＡＣＣａｓｅ第１７８１位氨基酸突变ꎮ这是该突变类型使水稻获得多种ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂抗性的首次报道ꎮＥＭＳ是最常见的化学诱变剂ꎬ在植物的诱变育种中被广泛应用[２９]ꎮ本试验通过ＥＭＳ诱变镇糯１９种子ꎬ筛选到了抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的水稻植株ꎬ突变体能耐受田间推荐剂量的高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯ꎮ其中ꎬ喷施了田间推荐剂量的唑啉草酯后ꎬ镇糯１９野生型植株在处理３０ｄ后几乎全部死亡ꎻ喷施了田间推荐剂量的精喹禾灵后ꎬ野生型的植株在喷施３０ｄ后全部死亡ꎻ而突变体在分别喷施３种除草剂后ꎬ均未出现死亡现象ꎬ基本可以正常生长ꎮ所获得的抗性突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯的抗性水平均明显强于野生型ꎮ突变体和野生型的最小致死剂量或５０％抑制浓度(ＧＲ５０)㊁ＯｓＡＣＣ酶活性的差异尚有待进一步明确ꎮ大豆㊁棉花和玉米等转基因作物已在全球范围内进行了商品化生产ꎬ产生了巨大的社会效益和经济效益ꎮ目前为止ꎬ中国虽然有多种转基因作物已经被正式批准商品化生产ꎬ但进行大面积种植的仅０１３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期Ｈ２Ｏ㊁ＧＣＮ㊁ＪＫ㊁ＺＬ分别表示喷施清水㊁高效盖草能㊁精喹禾灵㊁ꎬ∗∗表示在０.０１水平上极显著ꎮＮＤ表示没有数据ꎬｎｓ表示没有显著差异ꎮ图５㊀不同除草剂处理下的水稻株高㊁分蘖数和旗叶长度Ｆｉｇ.５㊀Ｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔꎬｔｉｌｌｅｒｎｕｍｂｅｒａｎｄｆｌａｇｌｅａｆｌｅｎｇｔｈｏｆｒｉｃｅｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｅｒｂｉｃｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ有番木瓜和棉花ꎮ２００９年ꎬ农业部颁发了中国拥有自主知识产权的转Ｂｔ基因抗虫水稻生产应用安全证书ꎬ但目前中国尚未批准转基因水稻的商业化生产ꎮ因此ꎬ培育非转基因的抗除草剂水稻品种具有重要价值ꎮ上世纪９０年代晚期ꎬ美国路易斯安那州州立大学稻米研究中心通过ＥＭＳ诱变技术育成了一系列耐咪唑啉酮类除草剂(ＡＬＳ抑制剂类除草剂)的非转基因水稻品种ꎮ２００２年ꎬ巴斯夫公司开发了非转基因抗咪唑啉酮类除草剂的水稻品种Ｃｌｅａｒｆ￣ｉｅｌｄ在美国进行了商业化推广ꎬ解决了水稻种植的杂草稻危害问题[３０]ꎮ２０１８年ꎬ巴斯夫又在美国上市了非转基因水稻品种Ｐｒｏｖｉｓｉａꎬ可以抗精喹禾灵ꎬ拟与抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ进行轮作并交替使用两种不同作用机理的除草剂ꎬ实现对杂草稻和其他一年生杂草的可持续性防控[３１]ꎮ本研究通过ＥＭＳ诱变筛选到的抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂突变体ꎬ具有与抗除草剂精喹禾灵水稻品种Ｐｒｏｖｉｓｉａ类似的抗除草剂性状ꎬ可为中国非转基因抗除草剂水稻育种提供重要材料ꎮ４㊀结论本研究通过ＥＭＳ诱变筛选获得了可稳定遗传的抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的水稻突变体材料ꎬ可耐受３种不同田间推荐剂量的除草剂ꎬ具有一定的生产应用价值ꎮ野生型在喷施田间推荐剂量的高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯后ꎬ株高和分蘖均受到严重抑制甚至死亡ꎬ但突变体基本能正常生长ꎮ突变体中ＯｓＡＣＣ突变基因编码蛋白质的第１７９２位氨基酸由Ｉｌｅ变成Ｌｅｕꎬ使其对ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的耐受性显著提高ꎮ在当前中国转基因水稻尚未放开㊁公众对转基因作物品种存在疑虑的大背景下ꎬ本研究获得的非转基因抗除草剂材料具有良好的应用前景ꎮ１１３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质参考文献:[１]㊀董立尧ꎬ高㊀原ꎬ房加鹏ꎬ等.我国水稻田杂草抗药性研究进展[Ｊ].植物保护ꎬ２０１８ꎬ４４(５):６９￣７６.[２]㊀程艳勤.浅析除草剂对水稻的危害及治理[Ｊ].农技服务ꎬ２０１６ꎬ３３(６):１０９￣１１４.[３]㊀ＫＯＮＩＳＨＩＴＫＵＪꎬＳＨＩＮＯＨＡＲＡＫꎬＹＡＭＡＤＡＫꎬｅｔａｌ.Ａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ:ｍｏｓｔｐｌａｎｔｓｏｔｈｅｒｔｈａｎｇｒａｍｉｎｅａｅｈａｖｅｂｏｔｈｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃａｎｄｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｆｏｒｍｓｏｆｔｈｉｓｅｎｚｙｍｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９９６ꎬ３７(２):１１７￣１２２. 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[２７]ＭＥＮＣＨＡＲＩＹꎬＣＨＡＵＶＥＬＢꎬＤＡＲＭＥＮＣＹＨꎬｅｔａｌ.Ｆｉｔｎｅｓｓｃｏｓｔｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｒｅｅｍｕｔａｎｔａｃｅｔｙｌ￣ｃｏｅｎｚｙｍｅＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅａｌｌｅｌｅｓｅｎｄｏｗｉｎｇｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｂｌａｃｋ￣ｇｒａｓｓＡｌｏｐｅｃｕｒｕｓｍｙ￣ｏｓｕｒｏｉｄｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＥｃｏｌｏｇｙꎬ２００８ꎬ４５(３):９３９￣９４７. [２８]ＷＡＮＧＴꎬＰＩＣＡＲＤＪＣꎬＴＩＡＮＸꎬｅｔａｌ.Ａｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＡＣＣａｓｅ１７８１ｓｅｔａｒｉａｍｕｔａｎｔｓｈｏｗｓｈｉｇｈｅｒｆｉｔｎｅｓｓｔｈａｎｗｉｌｄｔｙｐｅ[Ｊ].Ｈｅｒｅｄｉｔｙ(Ｅｄｉｎｂ)ꎬ２０１０ꎬ１０５(４):３９４￣４００.[２９]ＳＥＲＲＡＴＸꎬＥＳＴＥＢＡＮＲꎬＧＵＩＢＯＵＲＴＮꎬｅｔａｌ.ＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅ￣ｓｉｓｉｎｍａｔｕｒｅｓｅｅｄ￣ｄｅｒｉｖｅｄｒｉｃｅｃａｌｌｉａｓａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｌｙｏｂｔａｉｎｉｎｇＴＩＬＬＩＮＧｍｕｔａｎｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１４ꎬ１０(１):５.[３０]ＳＨＡＸＹꎬＬＩＮＳＣＯＭＢＥＳＤꎬＧＲＯＴＨＤＥ.Ｆｉｅｌｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ￣ｔｏｌｅｒａｎｔＣｌｅａｒｆｉｅｌｄｒｉｃｅ(ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ.)ａｔｎｉｎｅＬｏｕｉｓｉａｎａｌｏｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００７ꎬ４７(３):１１７７￣１１８５. [３１]ＣＡＭＡＣＨＯＪＲꎬＬＩＮＳＣＯＭＢＥＳＤꎬＳＡＮＡＢＲＩＡＹꎬｅｔａｌ.Ｉｎｈｅｒｉｔ￣ａｎｃｅｏｆＰｒｏｖｉｓｉａｒｉｃｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣ｐ￣ｅｔｈｙｌｕｎｄｅｒｌａｂｏｒａ￣ｔｏｒｙａｎｄｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ[Ｊ].Ｅｕｐｈｙｔｉｃａꎬ２０１９ꎬ２１５(４):８３.(责任编辑:石春林)２１３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期。
利用EMS诱变创制抗除草剂粳稻新种质
河南农业科学,2021,50(4):8-16Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi :10.15933/ki.1004-3268.2021.04.002收稿日期:2021-01-18基金项目:国家重点研发计划项目(2017YFD0100400,2016YFD0100101)作者简介:王付华(1966-),男,湖南祁阳人,副研究员,博士,主要从事水稻分子育种工作㊂E -mail:wangfuhuahunan@ 通信作者:尹海庆(1965-),男,河南南阳人,研究员,主要从事水稻分子育种工作㊂E -mail:yinhq98@利用EMS 诱变创制抗除草剂粳稻新种质王付华1,李自超2,王㊀亚1,付㊀景1,杨文博1,尹海庆1,王生轩1,王越涛1,白㊀涛1,张㊀珍3(1.河南省农业科学院粮食作物研究所,河南郑州450002;2.中国农业大学农学院,北京100193;3.河南省农业科学技术展览馆,河南郑州450000)摘要:为了创制抗除草剂水稻新种质,用EMS (甲基磺酸乙酯)溶液浸泡郑稻19干种子,在M 2幼苗三叶期分别喷施112.5g /hm 2的甲咪唑烟酸和60g /hm 2的烟嘧磺隆,14d 后筛选抗除草剂突变体,并对突变体ALS (Acetolactate synthase )基因序列进行分析,找出ALS 基因突变位点㊂结果表明,喷施甲咪唑烟酸14d 后,抗除草剂植株生长正常㊁叶色偏绿,敏感植株黄化㊁生长受抑制;喷施烟嘧磺隆14d 后,抗除草剂植株表现前期受抑制,但能缓慢恢复㊂用甲咪唑烟酸筛选63000份M 2家系,获得抗除草剂突变体6份(HF1 HF6),包括2种ALS 氨基酸突变类型:Ser -627-Asn 和Gly -628-Glu ㊂用烟嘧磺隆筛选M 2家系30000份,获得抗除草剂突变体2份(HF7 HF8),包括2种ALS 氨基酸突变类型:Pro -171-Ser 和Ala -179-Val ㊂在M 2筛选到1个特定ALS 碱基突变平均需23250份M 2家系㊂筛选到的抗甲咪唑烟酸突变体HF1(Gly -628-Glu )和HF2(Ser -627-Asn )在1倍大田常规除草剂剂量(112.5g /hm 2)下鲜质量减退率分别为13.09%和20.03%,显著小于郑稻19(P <0.05);在8倍大田常规除草剂剂量(900g /hm 2)下突变体仍能正常生长,表现强的甲咪唑烟酸抗性㊂对HF1㊁HF2分别喷施30g /hm 2和60g /hm 2烟嘧磺隆,其鲜质量减退率分别为24.81%㊁13.13%和34.13%㊁28.01%,显著小于郑稻19(P <0.05),表现一定的烟嘧磺隆抗性㊂综上,筛选到8份抗除草剂突变体材料,2份抗烟嘧磺隆,6份抗甲咪唑烟酸,其中2份抗甲咪唑烟酸突变体兼具烟嘧磺隆抗性,创制的抗除草剂材料可用于选育非转基因抗除草剂品种,也可作为创制ALS 多位点突变种质的基础材料,进一步增强突变体对除草剂的抗性㊂关键词:粳稻;抗烟嘧磺隆;抗甲咪唑烟酸;抗除草剂;EMS 诱变;种质创建中图分类号:S511㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2021)04-0008-09New Herbicide-Resistant Japonica Rice GermplasmsCreated by EMS MutagenesisWANG Fuhua 1,LI Zichao 2,WANG Ya 1,FU Jing 1,YANG Wenbo 1,YIN Haiqing 1,WANG Shengxuan 1,WANG Yuetao 1,BAI Tao 1,ZHANG Zhen 3(1.Institute of Cereal Crops,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China;2.Agricultural College,China Agricultural University,Beijing 100193,China;3.Henan Agricultural Science and Technology Exhibition Hall,Zhengzhou 450000,China)Abstract :In order to create new herbicide-resistant rice germplasms,the dry seeds of Zhengdao 19were soaked in ethylmethane sulfonate (EMS )solution.At three-leaf stage,M 2seedlings were sprayed with imazapic(112.5g /ha)and nicosulfuron(60g /ha).The herbicide-resistant mutants were screened after 14days.The ALS (acetolactate synthase )gene sequences of mutants were analyzed to find out the mutation sites.The results showed that the herbicide-resistant plants grew normally after spraying imazapic,the leaf kept green,while the leaves of sensitive lines yellowed,and their growth were inhibited;after spraying nicosulfuron,the growth of herbicide-resistant plants were inhibited in the early stage,but㊀第4期王付华等:利用EMS诱变创制抗除草剂粳稻新种质could recover slowly.A total of63000M2lines were screened with imazapic,and6imazapic-resistant mutants(HF1 HF6)were obtained,including two types of ALS mutations,Ser-627-Asn and Gly-628-Glu.A total of30000M2lines were screened with nicosulfuron,and2herbicide-resistant mutants (HF7 HF8)were obtained,including two types of ALS mutations,Pro-171-Ser and Ala-179-Val.To obtain a specific ALS nucleotide mutation,an average of23250M2lines were needed to screen.The fresh weight reduction rates of imazapic-resistant mutants HF1(Gly-628-Glu)and HF2(Ser-627-Asn)were 13.09%and20.03%respectively after spraying1time the conventional herbicide dose(112.5g/ha), which were significantly less than that of Zhengdao19(P<0.05);the mutants could still grow normally after spraying8times the conventional herbicide dose in the field,showing strong resistance to imazapic herbicides.The fresh weight reduction rates of mutants HF1and HF2were24.81%and13.13%after spraying30g/ha nicosulfuron,and were34.13%and28.01%after spraying60g/ha nicosulfuron, respectively,which were significantly less than those of Zhengdao19(P<0.05),showing certain nicosulfuron resistance.In summary,8herbicide-resistant mutant lines were obtained,2lines were resistant to nicosulfuron,6lines were resistant to imazapic,and two of the imazapic-resistant mutants exhibited nicotinsulfuron resistance.The screened herbicide-resistant mutants could be used to breed non-GMO herbicide-resistant varieties,and also be used as a basic germplasm for the multi-site mutation of ALS,so as to further strengthen the herbicide resistance of mutants.Key words:Japonica rice;Resistance to nicosulfuron;Resistance to imazapic;Resistance to herbicide; EMS mutagenesis;Germplasm innovation㊀㊀水稻是我国主要粮食作物㊂当前,农业劳动力价格飙涨,水稻种植方式轻简化趋势明显,水稻直播省工省力,推广面积越来越大[1]㊂与传统移栽相比,直播稻田杂草种子和水稻种子生长同步,杂草生长快㊁种类多㊁密度大,容易滋生杂草稻[2],杂草控制是制约水稻直播生产的关键㊂培育抗除草剂作物,便于大田杂草控制[3]㊂当前,转基因抗除草剂作物已大面积生产应用,主要有转基因抗除草剂玉米㊁棉花㊁油菜和大豆等饲料㊁油料作物[4],而转基因水稻尚未在我国批准商业使用㊂因此,培育非转基因抗除草剂水稻十分必要㊂国外非转基因抗除草剂作物已有成功先例,如20世纪末选育成功的抗三氮苯的油菜㊁抗咪唑啉酮的玉米等[5-6]㊂非转基因抗除草剂作物所抗除草剂主要包括咪唑啉酮类㊁环己烯酮类㊁磺酰脲类㊁均三氮苯类㊁有机磷类和激素类等[7]㊂乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase,ALS)是亮氨酸㊁异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸合成中的关键酶,是多种除草剂的作用靶标,包括咪唑啉酮类(Imidazolinones,IMIs)㊁磺酰脲类(Sulfonylureas, SUs)㊁嘧啶硫代苯甲酸脂类(Pyrimidinylthio-benzoates, PTBs)㊁三唑并嘧啶类(Triazolopyrimidines,TPs)和磺酰胺羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones, SCTs)[8-9]㊂ALS抑制剂类除草剂与植物体内的ALS 结合形成复合物,阻断底物进入酶活性位点通路,抑制ALS活性,使支链氨基酸合成受阻,破坏植物细胞正常生长,导致植物死亡[10-12]㊂ALS基因某些位点的突变会减弱ALS与除草剂的结合力,产生除草剂抗性㊂对以ALS为靶标的抗性杂草进行研究发现,ALS的突变主要发生在8个氨基酸位点[12];在拟南芥中研究发现,ALS蛋白中有20多个位点的氨基酸替换会产生除草剂抗性[10-14]㊂目前,水稻中已公开报道了多个抗除草剂ALS 氨基酸突变位点㊂1993年,路易斯安娜州立大学农业中心通过EMS(甲基磺酸乙酯)诱变筛选到抗咪唑啉酮类除草剂的水稻种质AS3510,其ALS氨基酸突变为Gly-628-Glu(第628位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸),利用AS3510选育出商业品种121CL㊁141CL[15]㊂利用EMS诱变丰产性品种Cypress,筛选到抗咪唑啉酮除草剂种质PWC16,其ALS氨基酸突变为Ser-627-Asn,利用PWC16选育出商业品种CL161㊁141CL[16-17],2002年美国的抗除草剂水稻实现商业生产,有效控制了当地杂草稻的危害㊂阿根廷学者用EMS诱变当地水稻品种IRGA417也筛选到抗咪唑啉酮类除草剂材料,选育出抗咪唑啉酮品种PUTA INTA CL,其ALS氨基酸突变为Ala-96-Thr[18]㊂OKUZAKI等[19]以双草醚(嘧啶水杨酸类除草剂)筛选水稻品种台中65的花药培养愈伤组织,获得1个抗磺酰脲类除草剂的突变体,ALS氨基酸突变为Gly-95-Ala㊂近年来,我国多个研究单位筛选到ALS突变抗除草剂材料,深圳兴旺生物种业有限公司用EMS诱变黄华占和黄丝占,以咪唑啉酮类除草剂筛选,获得3个抗性突变体(Tyr-548-Me/ Cyst㊁Ala-96-Val/Thr㊁Ser-627-An)[20]㊂赵炳然等[21]以咪唑乙烟酸筛选EMS诱变的籼稻品种华航9河南农业科学第50卷31,获得4个抗性突变体,ALS氨基酸突变为Ala-179-Val㊁Ser-627-Asn㊁Gly-628-Glu㊁Val-643-Met㊂江苏省农业科学院利用甲咪唑烟酸筛选经EMS诱变的多个粳稻㊁籼稻品种,获得多个抗除草剂突变体,ALS氨基酸突变包括Gly-136-Thr㊁Pro-171-His㊁Ala-179-Val㊁Ser-627-Asn㊁Gly-628-Glu 等[22-25]㊂用除草剂筛选品种资源,王芳权等[26]从7000多份水稻种质资源中筛选到1份抗咪唑啉酮除草剂的材料,ALS氨基酸突变为Ser-627-Asn;毕俊国等[27]以咪唑乙烟酸筛选30000份水稻种质,同样获得1份ALS氨基酸突变为Ser-627-Asn的抗性材料㊂综上可见,以往的抗除草剂水稻材料筛选以抗咪唑啉酮类除草剂为主㊂烟嘧磺隆是磺酰脲类除草剂,高效㊁低毒㊁便宜,能杀灭大田主要禾本科杂草和部分阔叶杂草,即 禾阔双杀 ,是玉米田前期主要除草剂,但水稻易受伤害㊂如果能通过诱变筛选到抗烟嘧磺隆的水稻新材料,创制抗除草剂新品种,对现实生产意义重大,但目前尚未见相关报道㊂为此,以自育直播粳稻品种郑稻19为材料,采用EMS进行诱变,然后用甲咪唑烟酸和烟嘧磺隆筛选抗除草剂水稻新种质,为选育非转基因抗除草剂水稻品种奠定基础㊂1㊀材料和方法1.1㊀试验材料供试水稻材料为粳稻品种郑稻19(Zhengdao 19),由河南省农业科学院粮食作物研究所选育㊂EMS购自Sigma-Aldrich公司㊂甲咪唑烟酸铵盐水剂(240g/L)购自登封市金博农药化工有限公司,三叶期杂草常规用量为300~450mL/hm2㊂烟嘧磺隆可分散油悬浮剂(40g/L)购自江苏长青生物科技有限公司,三叶期杂草常规用量为750~1500 mL/hm2㊂1.2㊀EMS诱变处理干种子EMS处理方法参照WU等[28]和TILL 等[29]的方法稍有改动㊂干种子于室温浸种16h,滤干水,分别用0.4%㊁0.6%㊁0.8%㊁1.0%㊁1.2%㊁1.6%EMS溶液(EMS溶液用0.1mol/L磷酸缓冲液配制,pH值7.2)于26ħ恒温摇床(60r/min)中浸泡8h(每个剂量处理200粒种子),然后在28ħ发芽箱中催芽36~48h,调查发芽率,确定半致死浓度,然后以该浓度对干种子进行处理(同上),在28ħ发芽箱中催芽36~48h,之后播种㊂采用常规湿润育秧,常规单本插植,M1成熟时每株收获一穗,不脱粒,晒干㊂1.3㊀抗除草剂突变体筛选M2幼苗三叶期时,喷施112.5g/hm2的24%甲咪唑烟酸筛选抗除草剂突变体,喷施60g/hm2烟嘧磺隆筛选抗烟嘧磺隆突变体,处理14d筛选抗除草剂的M2家系,筛选标准:相比绝大部分敏感株系能正常生长,株高接近正常,叶色偏绿㊂2017㊁2018㊁2019年连续3a用甲咪唑烟酸筛选M2家系,2017年筛选3000份,2018㊁2019年各筛选30000份M2家系;2019年以烟嘧磺隆筛选30000份M2家系㊂M2抗除草剂突变体家系加代时用除草剂筛选,筛选方法同上,选择幼苗生长正常无死苗的家系留种㊂1.4㊀抗除草剂突变体ALS基因克隆和序列分析根据NCBI网站日本晴(Nipponbare)ALS基因序列(Os02g30630)设计扩增ALS基因全长的引物ALS-F(5ᶄ-GACCCACCTGTCATCCTCATCC-3ᶄ)和ALS-R(5ᶄ-ACATACAAACATCATAGGCATACCACT-3ᶄ)㊂以M3抗除草剂突变体纯合家系及郑稻19基因组DNA为模板,采用TaKaRa PrimeSTAR Max DNA Polymerase扩增ALS基因㊂25μL反应体系: 2ˑPrimeSTAR MaxPremix12.5μL,10μmol/L上㊁下游引物各1.0μL,基因组DNA2.0μL,补加ddH2O至25μL㊂PCR扩增程序:98ħ10s,62ħ15s,68ħ2.5min,30个循环;68ħ5min㊂取5μL PCR产物,用1%琼脂糖凝胶电泳检测,DNA 片段大小符合预期时,剩余PCR产物送宝生物工程(大连)有限公司进行克隆并测序㊂根据测序结果,采用DNAStar-MegAlign软件分析野生型和突变体ALS基因的DNA序列差异,确定抗除草剂突变体的ALS基因突变位点㊂1.5㊀突变体后代家系抗除草剂性能鉴定用营养钵(17cmˑ10cmˑ10cm)装过筛细土,将M3纯合家系种子和郑稻19种子播于土表,每钵播种子100粒,播后盖细土,厚约1cm,营养钵放置于整理箱中(保持水深3cm),整理箱置于人工气候室中,光强10000lx,光12h/暗12h,温度25~ 28ħ,相对湿度70%~85%㊂一叶期时间苗,每营养钵留生长一致的幼苗30株㊂三叶期时,分别喷施56.25㊁112.5㊁225㊁450㊁900g/hm2甲咪唑烟酸,15㊁30㊁60㊁120㊁240g/hm2的烟嘧磺隆,以喷水为对照; 14d后调查秧苗的生长情况,称取6株秧苗鲜质量, 3次重复,计算各处理的鲜质量减退率,计算公式为:鲜质量减退率=(对照组每株鲜质量-处理组每株鲜质量)/对照组每株鲜质量ˑ100%㊂01㊀第4期王付华等:利用EMS诱变创制抗除草剂粳稻新种质2㊀结果与分析2.1㊀郑稻19干种子EMS诱变剂量的确定由表1可知,随EMS用量增加,郑稻19种子发芽率下降,0.8%㊁1.0%㊁1.2%EMS处理下发芽率分别为60.2%㊁51.3%㊁39.0%,1.0%为半致死剂量㊂因此,确定以1.0%EMS进行诱变处理㊂表1㊀郑稻19干种子径不同体积分数EMS处理后的发芽率Tab.1㊀Germination rate of dry Zhengdao19seeds after treated by different concentrations of EMS%指标IndexEMS体积分数/%EMS concentration00.40.60.8 1.0 1.2 1.4 1.6发芽率Germination rate94.277.571.160.251.339.014.00.02.2㊀水稻抗除草剂突变体的筛选M2幼苗三叶期,喷施甲咪唑烟酸,喷施后14d,敏感植株叶片黄化㊁生长明显受抑制;抗除草剂植株能正常生长,株高明显高于敏感植株,叶色偏绿(图1A F)㊂2017 2019年用甲咪唑烟酸共筛选63000份M2家系,获得抗除草剂突变体6份,其中2017年1份(HF1,图1A)㊁2018年2份(HF2㊁HF3,图1B㊁C)㊁2019年3份(HF4㊁HF5㊁HF6)(图1D㊁E㊁F)㊂综上,甲咪唑烟酸处理后,HF1HF2㊁HF3㊁HF4㊁HF5和HF6生长正常,说明这些突变体具有良好的抗甲咪唑烟酸性㊂2019年用烟嘧磺隆筛选M2家系30000份,三叶期喷施烟嘧磺隆,喷施后14d,敏感植株叶片枯黄㊁植株矮小,停止生长,逐渐死亡;抗性植株生长受抑制,再过7d慢慢恢复正常生长,共筛选获得抗除草剂突变体2份(HF7和HF8)(图1G㊁H)㊂综上,烟嘧磺隆处理后,HF7和HF8表现受害症状,但能逐渐恢复正常生长,说明这些突变体具有抗烟嘧磺隆能力㊂A F:抗甲咪唑烟酸突变体;G H:抗烟嘧磺隆突变体㊂A:HF1;B:HF2;C:HF3;D:HF4;E:HF5;F:HF6;G:HF7;H:HF8A F:Imazapic-risistant mutants;G H:Nicosulfuron-risistant mutants.A:HF1;B:HF2;C:HF3;D:HF4;E:HF5;F:HF6;G:HF7;H:HF8图1㊀水稻M2抗除草剂突变体筛选Fig.1㊀Screening of herbcide-resisitant rice mutants in M22.3㊀水稻抗除草剂突变体ALS基因序列分析ALS是咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂的靶标,为鉴定突变体ALS基因突变位点,对M3抗除草剂突变体和郑稻19全长ALS基因序列进行分析,发现抗除草剂突变体及郑稻19的ALS基因ORF(Openreading frame)全长均为1935bp,没有内含子,编码644个氨基酸㊂比对抗除草剂突变体㊁郑稻19和日本晴的ALS基因编码序列(图2),发现郑稻19与日本晴ALS基因序列相同㊂HF2和HF5的ALS基因第1880位碱基由G突变为A,使得ALS第627位氨基酸由丝氨酸突变成了天冬酰胺(Ser-627-Asn);HF1㊁HF3㊁HF4和HF6的ALS基因第1883位碱基由G突变为A,使得ALS第628位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸(Gly-628-Glu)(图2)㊂突变体ALS基因的碱基突变导致其编码蛋白质关键位点氨基酸突变,使得突变体获得抗甲咪唑烟酸能力㊂HF7的ALS基因第511位碱基由C突变为T,使得ALS第171位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸(Pro-171-11河南农业科学第50卷Ser);HF8的ALS 基因第536位碱基由C 突变为T,使得ALS 第179位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸(Ala -179-Val)(图2)㊂这2个位点的突变使HF7㊁HF8获得抗烟嘧磺隆能力㊂红框为ALS 蛋白171位㊁179位和628位差异氨基酸,黄框为627位差异氨基酸,下划红线㊁黄线分别为相应的DNA 差异碱基The red boxes indicate the mutated amino acids at sites 171,179and 628of the ALS protein,the yellow box indicates themutated amino acids at site 627,and the underlined red or yellow lines indicate the corresponding discrepant DNA bases图2㊀水稻抗除草剂突变体HF1 HF8与郑稻19㊁日本晴ALS 基因序列及编码氨基酸序列比对(只显示差异部分序列)Fig.2㊀Alignment of ALS gene sequence and encoded amino acid sequence of herbcide-resisitant rice mutants HF1 HF8,Zhengdao 19and Nipponbare (only showing the discrepant sequence )2.4㊀M 2家系抗除草剂突变体出现频率3a 用甲咪唑烟酸筛选63000份M 2家系,获得ALS 氨基酸突变为Ser -627-Asn 的材料2份㊁Gly -628-Glu 的材料4份,突变频率分别为0.0032%㊁0.0063%,相当于获得单碱基突变所致抗除草剂突变体分别需M 2家系31500㊁15750份(表2)㊂用烟嘧磺隆筛选30000份M 2家系,获得2份抗性突变体材料,单个碱基位点突变频率为0.0033%(表2)㊂特定位点抗除草剂突变频率平均为0.0040%,即筛选到ALS 特定单碱基突变需M 2家系23250份(表2),预示筛选30000份M 2家系能获得所希望的抗除草剂单碱基突变㊂2.5㊀抗咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂突变体的抗性鉴定选择纯合HF1(Gly -628-Glu)㊁HF2(Ser -627-Asn)M 3家系,三叶期分别喷施56.25㊁112.5㊁225㊁450㊁900g /hm 2甲咪唑烟酸和15㊁30㊁60㊁120㊁240g /hm 2烟嘧磺隆㊂14d 后,随着喷施剂量增加,喷施甲21㊀第4期王付华等:利用EMS 诱变创制抗除草剂粳稻新种质咪唑烟酸处理的郑稻19生长明显受抑制,生长逐渐停止,缓慢死亡,鲜质量减退率分别为36.91%㊁47.81%㊁47.87%㊁51.80%㊁58.71%㊂在1倍大田常规除草剂用量(112.5g /hm 2)下,突变体HF1㊁HF2鲜质量减退率分别为13.09%㊁20.03%,显著小于郑稻19(P <0.05,图3 4);HF1㊁HF2在900g /hm 2剂量(8倍大田常规除草剂用量)下生长仍正常,郑稻19在4倍大田常规除草剂用量(450g /hm 2)下已死亡(图3E )㊂说明突变体具有强的甲咪唑烟酸抗性㊂表2㊀M 2家系ALS 抗除草剂位点突变频率Tab.2㊀Mutation frequency of herbicide-resistant sites of ALS in M 2lines指标Index突变氨基酸位点Mutation siteSer -627Gly -628Pro -171Ala -179平均AverageM 2家系份数M 2lines number 63000630003000030000突变体份数Mutant number2411突变频率/%Mutation frequency0.00320.00630.00330.00330.0040ALS 单碱基突变需M 2家系份数M 2lines number needed for mutation of single base in ALS3150015750300003000023250A F:甲咪唑烟酸剂量分别为0㊁56.25㊁112.5㊁225㊁450㊁900g /hm 2A F:Imazapic doses are 0,56.25,112.5,225,450,900g /ha respectively图3㊀突变体HF1和HF2在不同剂量甲咪唑烟酸下的抗性鉴定Fig.3㊀Resistance identification of HF1and HF2mutants under different doses of imazapic㊀㊀喷施烟嘧磺隆处理的郑稻19生长停滞,逐渐死亡,鲜质量减退率分别为52.48%㊁54.77%㊁60.19%㊁60.20%㊁61.48%(图5 6)㊂在30g /hm 2和60g /hm 2烟嘧磺隆下,突变体HF1㊁HF2鲜质量减退率分别为24.81%㊁13.13%和34.13%㊁28.01%,显著小于郑稻19(P <0.05),超过60g /hm 2突变体HF1㊁HF2鲜质量减退率与郑稻19差异变小,说明突变体具有一定烟嘧磺隆抗性㊂HF2鲜质量减退率始终低于HF1,说明HF2突变体比HF1突变体有更强的烟嘧磺隆抗性㊂图4㊀突变体HF1和HF2在不同剂量甲咪唑烟酸下的鲜质量减退率Fig.4㊀The fresh weight reduction rate of HF1and HF2mutants under different doses of imazapic31河南农业科学第50卷A F:烟嘧磺隆剂量分别为0㊁15㊁30㊁60㊁120㊁240g /hm 2A F:Nicosulfuron doses are 0,15,30,60,120,240g /ha respectively图5㊀突变体HF1和HF2在不同剂量烟嘧磺隆下的抗性鉴定Fig.5㊀Resistance identification of HF1and HF2mutants under different doses ofnicosulfuron图6㊀突变体HF1和HF2在不同剂量烟嘧磺隆下的鲜质量减退率Fig.6㊀The fresh weight reduction rate of HF1and HF2mutants under different doses of nicosulfuron3㊀结论与讨论3.1㊀抗除草剂突变体筛选利用EMS 诱变群体筛选抗除草剂突变体,一般在M 2 M 4进行[28-30],早代选择能减少加代次数,减轻工作量,M 2是变异最大的世代,在M 2进行抗性筛选是有利的㊂从M 1植株上收获M 2种子时可以选择混收[31],也可按家系收㊂本研究每个M 2家系收1个单穗,2017年筛选3000M 2家系,分株系(单穗)常规密度(8.6穗/m 2)播种,占用秧田面积达350m 2,筛选到抗性突变体1份;2018㊁2019年单穗高密度种植(45穗/m 2),分别筛选30000㊁60000份M 2家系,每30000份材料播种面积控制在700m 2,极大地压缩了筛选用秧田面积,2018㊁2019年分别筛选到抗性突变体2㊁5份,说明高密度稻穗直接播种筛选苗期抗除草剂突变体可行,大幅减轻了工作量㊂另外,M 2单穗分株系播种,抗除草剂突变体以家系整体出现,易于鉴别,也减轻了后期突变体鉴定工作量(混收混种时同一M 2抗性突变体家系幼苗随机分布大田,多个突变单株可能来自同一个M 2株系,增加鉴别难度,也增加后期突变体抗性鉴定㊁基因克隆等工作)㊂3.2㊀抗除草剂突变体的出现频率大剂量EMS 处理,突变频率高,容易获得足量的点突变,广泛用于构建饱和突变体库,如用于TILLING [28-30,32]㊂WU 等[28]估计较大剂量(0.8%~1.0%)EMS 诱变水稻,每个M 2家系平均有100个以上的突变位点㊂TILL 等[29]以1.5%EMS 处理粳稻品种日本晴,发现每294kb DNA 片段有1个碱基突变㊂MARTÍN 等[30]利用高剂量EMS 处理获得拟南芥突变体库,通过TILLING 检测14个基因的突变事件,发现每个基因平均有16个错义突变,即每89kb DNA 片段有1个碱基突变㊂本研究中,以半致死剂量(1.0%)EMS 处理水稻干种子,用甲咪唑烟酸筛选63000份M 2家系,得到6份抗性突变体材料,包括2个突变位点,即Ser -627-Asn㊁Gly -628-Glu,突变频率分别为0.0032%㊁0.0063%,相当于获得单碱基突变所致抗除草剂突变体分别需M 2家系31500㊁15750份㊂以烟嘧磺隆筛选30000份41㊀第4期王付华等:利用EMS诱变创制抗除草剂粳稻新种质M2家系,获得2份抗性突变体材料(Pro-171-Ser㊁Ala-179-Val),单个位点突变频率为0.0033%㊂特定位点抗除草剂突变频率平均为0.0040%,即筛选到ALS特定单碱基突变需M2家系23250份㊂这为EMS诱变时M2群体规模的控制和筛选家系数量的确定提供了参考㊂3.3㊀ALS基因突变及对除草剂的靶标抗性杂草对ALS抑制剂类除草剂的抗性包括非靶标抗性和靶标抗性,靶标抗性主要指由于靶标酶基因突变,靶标酶与除草剂结合受阻,或靶标酶增强表达而产生抗性;非靶标抗性是指通过减少除草剂的吸收传导㊁提高除草剂的代谢及屏蔽隔离除草剂等方式产生抗性[14]㊂ALS基因突变导致编码蛋白质序列关键位点出现氨基酸替换,改变酶与除草剂结合能力,除草剂除草能力降低或丧失[10-11]㊂对以ALS为靶标的抗性杂草研究发现,ALS的突变主要发生在8个氨基酸位点:Ala-122㊁Pro-197㊁Ala-205㊁Asp-376㊁Arg-377㊁Trp-574㊁Ser-653和Gly-654[12];在拟南芥中研究发现,ALS蛋白中有20多个位点的氨基酸替换会产生除草剂抗性,不同位点突变所抗除草剂种类有差异[13-14]㊂水稻中已公开报道的ALS抗除草剂突变位点至少有Gly-95㊁Ala-96㊁Gly-136㊁Pro-171㊁Ala-179㊁Trp-548㊁Ser-627㊁Gly-628㊁Val-643等[15-27]㊂本研究通过用除草剂筛选EMS诱变的郑稻19M2家系,获得8份抗除草剂突变体材料,包括4种突变类型㊂Ser-627-Asn和Gly-628-Glu突变类型材料主要抗咪唑啉酮类[14],本研究中HF1㊁HF2在喷施8倍大田常规除草剂剂量的甲咪唑烟酸(900g/hm2)后仍能正常生长,表现强的除草剂抗性,是优良抗除草剂材料,可作为抗性基因供体用于抗除草剂品种选育㊂研究报道,用咪唑啉酮类除草剂筛选到的ALS基因突变抗性水稻系AS3510(Gly-628-Glu),还对多种磺酰脲类除草剂产生抗性[33]㊂本研究发现,对抗甲咪唑烟酸突变体HF1㊁HF2分别喷施1倍(30g/hm2)㊁2倍(60g/hm2)大田常规除草剂剂量的烟嘧磺隆,鲜质量减退率显著小于郑稻19,说明HF1㊁HF2兼具一定烟嘧磺隆抗性㊂本研究筛选的2个抗烟嘧磺隆突变体HF7(Pro-171-Ser)和HF8(Ala-179-Val),在喷施60g/hm2烟嘧磺隆后表现前期受抑制,但能缓慢恢复,说明有一定抗性㊂这与前期报道的拟南芥中ALS氨基酸Ala-205 (水稻Ala-179)㊁Pro-197(水稻Pro-171)位点突变产生磺酰脲类除草剂抗性[14]一致㊂研究证明,在1个材料中使ALS基因2个或2个以上抗性位点同时突变,能增强除草剂抗性[34-35],是创制强抗除草剂材料的有效途径㊂设想未来利用获得的抗性突变体进行二次诱变,筛选多位点突变抗除草剂材料,以增强抗性,获得能应用于生产的抗烟嘧磺隆种质;或通过基因编辑创制多位点突变的强抗烟嘧磺隆材料㊂参考文献:[1]㊀肖国樱,肖友伦,李锦江,等.高效是当前水稻育种的主导目标[J].中国水稻科学,2019,33(4):287-292.XIAO G Y,XIAO Y L,LI J J,et al.High efficiency is adominant target for current rice breeding[J].ChineseJournal of Rice Science,2019,33(4):287-292. 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新型转基因抗除草剂水稻培育
杂草危害是制约水稻生产的重要因素。
有效防治杂草不仅可以提高水稻产量,而且可以推动新型水稻生产技术发展。
草甘膦和草铵膦是目前使用得最广泛的广谱型除草剂,然而难以直接应用于水稻生产。
培育转基因抗草甘膦水稻及转基因抗草铵膦水稻可以提高化学除草效率、降低水稻生产成本,促进直播水稻生产技术发展。
缺乏具有自主知识产权的可应用于商业化生产的抗除草剂基因是制约我国转基因抗除草剂水稻发展的主要原因,挖掘可应用于农业生产的新型抗除草剂基因具有重要意义。
本课题以华中农业大学刘子铎教授课题组分离克隆的新型抗草铵膦基因RePAT、新型抗草甘膦基因aroAJsp以及新型抗草甘膦基因
I.variabilis-EPSPS为研究基础,对新型抗草甘膦和抗草铵膦基因进行密码子
优化和人工合成,转入粳稻品种中花11及籼稻品种明恢86,一方面验证这些基因的农业应用潜力,另一方面培育具有商品化潜力的转基因抗除草剂水稻新材料,以期为中国转基因水稻生产储备优良的品种资源。
在研究转基因抗草铵膦水稻方面,对新型抗草铵膦基因RePAT进行进行密码子优化和人工合成(命名为RePAT*),并构建到植物转化载体,利用农杆菌介导的遗传转化方法将RePAT*转入粳稻品种中花11,获得了 130个阳性转化植株。
用1000 mg/L草铵膦喷施T0代转化植株,结果显示80%的转化植株正常生长。
在To代和T2代,对转化植株进行分子检测及农艺性状考查,筛选出2个RePAT*以单拷贝整合在基因间区且农艺性状没有显著变化的转基因株系(PAT7
和PAT11)。
对T4代PAT7和PAT11纯合株系进行Southern blot、Northern blot 及3’ RACE检测,结果显示RePAT*在转基因水稻中能稳定遗传及表达,但是
RePAT*在PAT7中转录本异常。
同时在田间考查PAT7和PAT11对草铵膦抗性,结果显示在受到5000 g/ha 草铵膦处理时(相当于农业推荐使用剂量的10倍),PAT7和PAT11的主要农艺性状没有显著改变。
根据转基因整合分子特征及草铵膦抗性检测结果最终选择转基因家系PAT11为目标株系。
在T6代,PAT11在受到5000 g/ha草铵膦处理时主要农艺性状不发生改变,这些结果说明新克隆的RePAT*在抗草铵膦作物培育方面具有重要的应用价值,本研究培育的转RePAT*水稻有很好的商业应用潜力。
在培育抗草甘膦水稻方面,将新型抗草甘膦基因aroAJ.sp及新型抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS,通过密码子优化(分别命名为aroAJ.sp*和I.variabilis-EPSPS*)、人工合成、载体构建及农杆菌介导的遗传转化等步骤导入粳稻品种中花11。
在3次独立的转化实验中,以aroAJ.sp*和I.variabilis-EPSPS*作为筛选标记基因,抗性愈伤组织形成率接近50%,获得的转化植株阳性率为100%,说明aroAJsp*和I.variabilis-EPSPS*可以作为水稻遗传转化的筛选标记基因。
考查T1代含单拷贝aroAJ.sp*或者单拷贝I.variabilis-EPSPS*的中花11草甘膦抗性,结果显示转I.variabilis-EPSPS*中花11相比转aroAJ.sp*中花11对草甘膦具有更高的抗性,I.variabilis-EPSPS*更适合转基因抗草甘膦水稻培育,因此选择用I.variabilis-EPSPS*培育转基因抗草甘膦水稻。
将I.variabilis-EPSPS*转入中花11,获得了1 115个阳性的转化植株,利用Southern blot及反向PCR技术确定在3个转基因株系(ZY21、ZY25和Z Y29)中I.variabilis-EPSPS 以单拷贝形式整合在基因间区。
在T3代,通过Northern blot 和 Western blot 证明 I.variabilis-EPSPS*在 ZY21、ZY25 和 ZY29 中
可以表达;对ZY21、ZY25和ZY29纯合家系在三叶期和分蘖期用不同剂量的草甘膦进行处理,结果显示即使被8400 g/ha(相当于农业推荐使用剂量的10倍)草甘膦处理,ZY21、ZY25和ZY29的主要农艺性状与对照相比没有显著性差异。
根据转基因整合分子特征、农艺性状考查结果及草甘膦抗性检测结果最终选择转基因家系ZY21为目标株系。
在T5代,ZY21在受到8400g/ha草甘膦处理时主要农艺性状不发生改变,说明ZY21具有产业化潜力。
同时将新型抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS*转入优良籼稻品种明恢86,获得了 60株阳性转化植株。
利用Southern blot和反向PCR对转基因株系进行鉴定,筛选到3个I.variabilis-EPSPS*以单拷贝形式整合在基因间区的转基因明恢86株系(MY28、MY50和MY51)。
在T3代通过Northern blot、3’RACE和Western blot证明
I.variabilis-EPSPS*在MY28、MY50和MY51中转录本完整,且在根和叶片中稳定表达;通过田间草甘膦抗性试验证明在受到8400 g/ha草甘膦处理时MY28、MY50和MY51主要农艺性状不发生改变。
将MY28、MY50和MY51与非转基因不育系Ⅱ-32A进行杂交,其杂种F1代在受到8400 g/ha草甘膦处理时主要农艺性状仍然不发生改变,说明MY28、MY50和MY51可以用于杂交稻生产。
根据农业性状考查结果、分子检测结果及草甘膦抗性检测结果确定1个转基因家系MY28为候选转基因株系用于商业化生产转基因水稻培育。
本研究证明新型抗草铵膦基因RePAT*和新型抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS*在抗除草剂作物培育方面具有重要的应用价值,新型抗除草剂水稻PAT11、ZY21和MY28有较好的商业应用潜力,对中国转基因水稻发展具有促进作用。