一株半夏内生青霉属真菌次级代谢产物及生物活性的研究

一株半夏内生青霉属真菌次级代谢产物及生物活性的研究

杨中铎，魏博，薛鹏辉（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州７３００５０）

摘　要：目的：对半夏中分离的一株内生真菌ＢＸ－９（青霉属）次级代谢产物进行分离鉴定及生物活性研究。方法：将一株半夏内生真菌（ＢＸ－９）用ＰＤＢ培养基进行发酵培养，菌丝体用甲醇回流提取２次，菌液用乙酸乙酯萃取两次，通过各种柱色谱分离得到次级代谢化合物。采用ＭＴＴ法和改良的Ｅｌｌｍａｎ法测定化合物抗肿瘤和抗乙酰胆碱酯酶活性。结果：分离得到７个化合物，分别为２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１４－ｔｒｉｃｏｓｅｎｖｉｃａｃｉｄ（１）、４，６，８，２２－ｔｅｔｒａｅｎ－３－ｏｎｅ－ｅｒｇｏｓｔａｎｅ（２）、Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ（３）、Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌｐｅｒｏｘｉｄｅ（４）、

（＋）－ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（５）、７－ｏｘｏｂｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（６）、４－ｅｐｉ－ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（７）。化合物３～６对Ｈｅｌａ、７７２１、ＨＬ６０三株肿瘤细胞均有显著活性。这７个化合物均无乙酰胆碱酯酶抑制活性。结论：从半夏内生菌

ＢＸ－９中能分离出具有抗肿瘤活性的次生代谢产物，其中ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ含量较高。

关键词：半夏；内生真菌；青霉属；抗肿瘤；乙酰胆碱酯酶抑制活性中图分类号：Ｒ２８４．２；Ｒ２８５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－２３９２（２０１５）０２－００２７－０３

收稿日期：２０１４－０７－０２ 修回日期：２０１４－０８－１９基金项目：国家自然科学基金项目（２１２６２０２２）；浙江省自然科学基金项目（ＬＹ１２Ｂ０２００５）作者简介：杨中铎（１９７８－），男，教授，硕士研究生导师，从事天然药物化学研究工作。

近年来从药用植物内生真菌（ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｕｓ）次级代谢产物中已分离得到许多抗肿瘤、抗菌等高生物活性的物质，这表明药用植物内生真菌已成为新药研发的重要资源之一。从植物内生菌特别是药用植物内生菌中寻找抗癌活性化合物的研究方兴未艾，从中发现分离到的抗肿瘤活性成分很多。活性成分从已知结构到全新结构都有报道。例如紫杉醇，细胞松弛素，鬼臼毒素类似物等，都是重要的抗肿瘤药物［１］。为了得到新的抗肿瘤、抗乙酰胆碱酯酶活性成分，本文对半夏中分离的一株内生真菌ＢＸ－９（通过形态学及ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２区域的基因序列比对鉴定为青霉属真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ．））中的化学成分及生物活性进行了研究。１　材料１．１　试剂及材料人宫颈癌细胞株Ｈｅｌａ、人肝癌细胞株７７２１、急髓白血病Ｍ３细胞株ＨＬ６０（兰州大学肿瘤细胞培养室），乙酰胆碱酯酶（ＡＣｈＥ）（ｐｒｏｄｕｃｔＮｏ．Ｃ２８８８），石杉碱甲（ｈｕｐｅｒｚｉｎｅＡ）、ＦａｓｔＢｌｕｅＢＳａｌｔ均购于Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ），硅胶（２００－３００目），其他化学试剂均为分析纯。半夏内生真菌ＢＸ－９由本实验室前期分离得到［２］。

１．２　培养基发酵使用ＰＤＡ培养基，肿瘤细胞培养基用ＲＰＭＩ１６４０培养基，加１０％灭活的新生小牛血清。１．３　仪器ＢｒｕｋｅｒＡｍ－４００（核磁共振波谱仪）；质谱仪

（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓＡＰＥＸⅡ４７ｅ）；酶标仪Ｅｌｘ８０８（ＢｉｏＴｅｋ，ＵＳＡ）；倒置显微镜ＩＸ７１（ＯＬＹＭＰＵＳ）；培养箱ＣＢ２１０（ＢＩＮＤＥＲ，ＭａｄｅｉｎＧｅｍａｎｙ）；９６孔酶标板（美国

ＣｏｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒ公司）。

２　方法２．１　ＢＸ－９次级代谢物的提取分离将ＢＸ－９活化后接入２０Ｌ发酵罐中发酵２０天。发酵结束后抽滤菌丝体，冷冻干燥得到乳白色丝状菌体（干重１６２ｇ）。粉碎后用２Ｌ甲醇在８０℃水浴中回流提取２次，每次２ｈ，抽滤，减压浓缩，得到菌丝体甲醇提取物３９ｇ。发酵液（２０Ｌ）用等体级的乙酸乙酯萃取二次，合并有机层，减压浓缩，得到菌液提取物５ｇ。用硅胶（１ｋｇ）粗分菌体提取物（３９ｇ），石油醚：乙酸乙酯梯度（８０∶１～１∶１，甲醇）洗脱，通过ＴＬＣ分析，合并得１５个粗组分，标记为ＢＸ－９Ｓ－Ａ至ＢＸ－９Ｓ－Ｏ。用硅胶（７０ｇ）分离组分ＢＸ－９Ｓ－Ｄ（１．０ｇ），石油

醚：乙酸乙酯＝７０∶１～２０∶１梯度洗脱，得到化合物１

・７２・２０１５年４月第４３卷第２期Ｖｏｌ畅４３，Ｎｏ畅２，Ａｐｒ．２０１５ 中 医 药 学 报ＡｃｔａＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２ｇ）、化合物２（９ｍｇ）、化合物３（１０ｍｇ）。硅胶（３０ｇ）分离ＢＸ－９Ｓ－Ｋ组分（１５０ｍｇ），石油醚：丙酮＝１０∶１洗脱，得到化合物４（２０ｍｇ）。将１．５ｇ发酵液，甲醇重结晶得到化合物５（１．３ｇ），母液浓缩后，用硅胶（８０ｇ）粗分，石油醚：乙酸乙酯梯度（１０∶１，８∶１，４∶１，２∶１，甲醇）洗脱，ＴＬＣ分析，合并得到６个粗组分，标记为ＢＸ－９Ｌ－Ａ至ＢＸ－９Ｌ－Ｆ。将ＢＸ－９Ｌ－Ｅ（１２７ｍｇ），１０ｇ硅胶分离，石油醚：丙酮＝４∶１洗脱，ＴＬＣ检测合并得到组分ＢＸ－９Ｌ－Ｅ－Ａ至ＢＸ－９Ｌ－Ｅ－Ｃ。将ＢＸ－９Ｌ－Ｅ－Ｃ组分５０ｍｇ用ＬＨ－２０柱层析甲醇洗脱，脱色，再用制备ＴＬＣ分离，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝１∶１，得到两个化合物６（１２ｍｇ）和化合物７（８ｍｇ）。２．２　ＢＸ－９菌丝体和发酵液次级代谢产物生物活性测定２．２．１　乙酰胆碱酯酶抑制活性本实验采用改进的Ｅｌｌｍａｎ法［３］对分离出的化合物进行乙酰胆碱酯酶抑制活性评价，其样品终浓度均为１００μｇ／ｍＬ，其中用石杉碱甲作为阳性药，做三组平行取平均。２．２．２　抗肿瘤活性测定采用ＭＴＴ法［４］检测抗肿瘤活性。按下列公式计算样品的细胞存活率：细胞存活％＝（药物组ＯＤ值／阴性对照组ＯＤ值）×１００％做三组平行取平均值。３　结果３．１　化合物结构鉴定从半夏内生真菌ＢＸ－９次级代谢物中分离得到的７个化合物运用１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＥＳＩ－ＭＳ等现代波谱技术，结合文献比对，对分离的７个化合物进行了鉴定。分别鉴定为２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１４－ｔｒｉｃｏｓｅｎｖｉｃａｃｉｄ（１）［５］、４，６，８，２２－ｔｅｔｒａｅｎ－３－ｏｎｅ－ｅｒｇｏｓｔａｎｅ（２）［６］、Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ（３）［７－８］、Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌｐｅｒｏｘｉｄｅ（４）［９］、（＋）－ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（５）［１０－１１］、７－ｏｘｏｂｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（６）［１２－１３］、４－ｅｐｉ－ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（７）［１４］。３．２　抗肿瘤活性化合物１～２在终浓度５０μｇ／ｍＬ及２０μｇ／ｍＬ对三株细胞基本无抑制活性。化合物３在终浓度５０μｇ／ｍＬ时，对Ｈｅｌａ，７７２１和ＨＬ６０三株细胞均表现了较强的抑制活性，其ＩＣ５０值分别为９．６９，２５．３１和１８畅３７μｇ／ｍＬ。化合物４在终浓度５０μｇ／ｍＬ时，对Ｈｅｌａ、ＨＬ６０细胞株有显著抑制活性；在终浓度２０μｇ／ｍＬ时，对Ｈｅｌａ细胞株仍然较强，对Ｈｅｌａ，７７２１和ＨＬ６０三株细胞的ＩＣ５０值分别为９．８８，２８．３３和１１畅８９μｇ／ｍＬ。化合物５在终浓度５０μｇ／ｍＬ时对Ｈｅｌａ、ＨＬ６０株细胞均表现出强的抑制活性，对７７２１细胞株表现出中等强度的抑制活性，对Ｈｅｌａ，７７２１和ＨＬ６０三株细胞的ＩＣ５０值分别为１０．３２，２３．３８和１３．５９μｇ／ｍＬ。化合物６对Ｈｅｌａ、ＨＬ６０株细胞均表现出强的抑制活性，对７７２１细胞株

表现出中等强度的抑制活性，对Ｈｅｌａ，７７２１和ＨＬ６０三株细胞的ＩＣ５０值分别为１１．１８，２０．６５和１１．２６μｇ／ｍＬ。

３．３　化合物抗乙酰胆碱酯酶活性测定结果采用Ｅｌｌｍａｎ法对化合物１，２，４～６在终浓度为１００μｇ／ｍＬ时抗乙酰胆碱酯酶活性的抑制率分别为：２２．０８％，３３．３６％，２９．０５％，３５．６３％，４２．２４％。阳性药石衫碱甲在相同浓度时为１００％。从结果中可以看出，化合物６在１００μｇ／ｍＬ时，有较弱活性，抑制率为４２．２４％。其余化合物均无明显活性，故不测定其ＩＣ５０值。４　讨论本文对半夏内生真菌ＢＸ－９次级代谢产物进行了分离和生物活性研究。分离得到７个化合物，化合物活性测试结果表明：７个化合物均对乙酰胆碱酯酶无抑制活性。化合物（３～６）即：Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ（３），Ｅｒｇｏｓ－ｔｅｒｏｌｐｅｒｏｘｉｄｅ（４），（＋）－ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（５），７－ｏｘｏ－

ｂｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（６）对三株肿瘤细胞均显示了较强的抗肿

瘤活性。半夏内生菌ＢＸ－９能够产生大量的（＋）－ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（５），其产率约６０ｍｇ／Ｌ，提取工艺简单，只

需重结晶就可得到ＢＦＡ的纯品。（＋）－ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ及其类似物目前被作为一种重要的分子工具而广泛应用于哺乳动物信号传导途径的研究。国际肿瘤协会在体外活性筛选中发现（＋）－ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ作为化学治疗药物有广大的前景，是目前国际上抗癌药物研究的一个热点。此外，文献预测化合物６抗肿瘤活性要优于ＢＦＡ，主要是由于其对高尔机体的结合能力优于

（＋）－ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ［１５］，本文中抗肿瘤实验数据也证实了这一结论，并从数据上去作出解释，目前化合物６抗肿瘤方面的实验数据未见报道。化合物３（Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ）是合成维生素Ｄ２的重要物质，也是重要的医药化工原

料，可用于可的松等药物的生产。化合物３是真菌细胞膜的重要组分，在细胞活力及物质运输等方面起着重要作用［１６］。据文献报道，化合物３具有抑制胆固醇

生物合成酶的活性［１７］。高虹等［１８］人，研究发现化合物３能够强烈抑制肿瘤血管生长，从一定角度上揭示了Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ具有较强的抗肿瘤活性的原因。１９９７年ＶｌａｄｉｍｉｒＣｈｏｂｏｔ等［６］人，从Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｏｓｔｒｅａｔｕｓ干燥的

・８２・中 医 药 学 报ＡｃｔａＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０１５年４月第４３卷第２期Ｖｏｌ畅４３，Ｎｏ畅２，Ａｐｒ．２０１５