莽草酸生物合成进展

莽草酸生物合成进展张伟东; 崔恩惠; 徐露; 张凯育; 罗巧云【期刊名称】《《化工设计通讯》》【年(卷),期】2019(045)011【总页数】3页(P108-109,118)【关键词】莽草酸; 生物合成; 禽流感【作者】张伟东; 崔恩惠; 徐露; 张凯育; 罗巧云【作者单位】南京东沛国际贸易集团有限公司江苏南京 210004; 南京工业大学药学院江苏南京 211816; 南京合兹医药科技有限公司江苏南京 211505【正文语种】中文【中图分类】TQ241 莽草酸化学结构近年来，病毒性流感在全球不断变异和爆发，先有H5N1和HIN1流感，后有H7N9禽流感。

在抗击流感的药物中，磷酸奥司他韦（Tamiflu，商品名：达菲）效果显著，世界卫生组织和很多国家卫生部门都将达菲作为主要治疗流感药物，并维持一定的贮备已备突发的疫情。

莽草酸就是合成达菲的关键原料。

莽草酸（shikimic acid），分子式为C7H10O5 ；化学名称为3，4，5- 三羟基-1- 环己烯-1- 羧酸（3，4，5-trihydroxy-1- cyclohexene-1-carboxylic acid）。

莽草酸的相对分子质量是174.15 ；白色结晶粉末；熔点是191～192℃；相对密度为1.64 ；易溶于水和醇等极性溶剂，水中的溶解度为180g/L，无水乙醇中的溶解度是22.5g/L ；几乎不溶于氯仿、苯和石油醚等非极性溶剂；气味辛酸；旋光度为-180°[1]，化学结构如图1所示。

2 不同植物中的莽草酸含量1885年，Eykman 首次从八角科植物的干燥成熟果实中提取得到，随后Sieb. 和Zucc. 根据日本的一种被称为shikimino-ki 的植物将其命名为Shikimic acid。

后来的研究发现草酸也作为微生物中莽草酸途径的重要中间体而存在于植物和微生物中，如桑科无花果的果实、银杏科植物银杏的叶和内皮等，其中以八角科植物八角茴香中的莽草酸含量比较高。

表1显示了一些植物中莽草酸的含量[2]。

表1 不同植物中的莽草酸含量植物检测出莽草酸含量最高的部位按干燥品计含量（%）阿江榄仁树果实 15.64黄连木乳香树全株 13.28金果腊栗全株 12.68聚合草叶片 12.53白果类叶升麻全株 12.21八角枫属 salvifollium 根 11.77银杏叶片 9.79绿藜芦叶片 9.21条裂叶川续断叶片 8.57藿香属urticifolia 全株 8.40土木香叶片 8.35金丝桃全株 8.12卵叶鸭跖草茎 7.33萝藦科叶片 6.79诃子果实 5.94干莽草叶片 5.69红茴香 diffengri 果实 9.29红茴香果实 16.86八角果实 17.14红毒茴果实 3.72短梗八角果实 16.21白花八角果实 8.12八角茴香果实 24.5印度菝葜根 5.42灰白岩蔷薇全株 5.39黄花稔全株 4.46灯油藤叶片4.14山小橘属 muricata 根 4.11小白菊叶片和花 3.74小麦叶片 3.57垂叶金丝桃全株 3.45毛川续段叶片 3.29金丝桃属walteri 全株 3.27美洲金丝桃全株3.26苍白木叶片 3.06印度菝葜全株 2.833 中国是八角茴香的主要生产国八角茴香也是中国传统香料和草药，中国八角年均产量近100kt，占世界八角总产量的80% 以上。

从八角中提取莽草酸自然成了首选的制备方法。

目前中国是世界上最大的植物提取莽草酸的生产国。

但农作物种植容易受到气候、病虫害等因素的影响，八角中莽草酸的含量波动较大；制药企业和研究机构仍然在寻找其他方法。

另外一个制备莽草酸的方法是通过化学合成，在“莽草酸的应用与制取方法研究进展” 中介绍了有D-A 法，1，4- 二氢苯甲酸法、奎尼酸法、D- 来酥糖法、D- 甘露糖法等不同方法。

合成法不受气候等因素的影响，但是反应步骤多，合成需要大量的化工原料，产生大量的三废污染环境。

现在国内环保法规日趋严格，化学合成受到很大的制约[3-4]。

另一个方法是生物合成法。

生物合成法既不受环境、气候的影响，又没有难以降解的有毒废料，是一个有前途的制备莽草酸的方法。

“达菲” 原研公司罗氏公司三分之二的莽草酸取自八角茵香，余下三分之一由大肠杆菌提供[5]。

莽草酸的生物合成与整个芳香族氨基酸生物合成紧密相连，莽草酸是合成苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸这三种芳香族氨基酸的共同前体，因此将芳香族氨基酸合成的一段过程称为莽草酸途径。

其原理是通过中断莽草酸循环中产生莽草酸以后的下游途径，从而达到积累莽草酸的目的（图2）。

图2 莽草酸生物合成芳香氨基酸途径4 近年来莽草酸生物合成进展4.1 以大肠杆菌为工程菌在氨基酸生产中，使用基因修饰的大肠杆菌为生产菌株已有多年的历史，这就为以大肠杆菌为工程菌大规模发酵合成莽草酸提供了良好的基础。

目前国内外微生物法制备莽草酸的报道中绝大多数使用大肠杆菌作为工程菌。

Chandran 等通过对大肠杆菌中心代谢途径以及莽草酸途径的代谢调控，文献报道莽草酸含量已达到84g/L[6]。

Draths 等将大肠杆菌工程菌株中的两个莽草酸激酶全部缺失以获得积累莽草酸的工程菌，其产量达到66g/L，得率达到0.23mol/mol（即每1mol 葡萄糖可生成0.23mol 莽草酸）[7]。

Alberto Rodriguez1，等利用基因缺陷的大肠杆菌进行发酵，在30h 内获得了积累达43g/L 的莽草酸[8]。

付小花等用Red 重组系统敲除了E.coli Topl0F 的aroL，摇瓶发酵，莽草酸产量为22.07g/L，是原始菌的1.57倍[9]。

汪莉等利用Red重组系统敲除了E.coli DH5a的aroK aroL，构建了包含莽草酸代谢途径限速酶Ptac aroE aroF aroB kan多基因盒的载体，将多基因盒替代shiA 基因，发酵后莽草酸产量为 8.3g/L，葡萄糖转化率为40%，比出发菌提高了3.07倍[10-12]。

杨晟等将带有aroF，aroE，aroB，ppsa，tktA 的质粒pSUFEBPT 转入W3110（/karoL。

AaroK），采取低糖补料发酵128h，莽草酸产量为39.3g/L[13]。

韩洪军等利用单因素实验对大肠杆菌莽草酸发酵培养基中碳氮源与金属离子进行了优化，采用优化后培养基发酵，莽草酸产量达到4.675g/L，为优化前的3.22倍[14]。

韩超等通过构建敲除编码莽草酸激酶的基因aroL 与aroK 的菌株阻断莽草酸的代谢；通过构建敲除编码奎尼酸/ 莽草酸脱氢酶的基因ydiB 的菌株减少副产物的合成；同时通过构建人工操纵子过表达编码DAHP 合酶、莽草酸脱氢酶、脱氢奎尼酸脱水酶和三脱氢奎尼酸合酶的基因aroG，aroE，aroD 和aroB 以强化莽草酸合成途径，最终得到E.Coli SHIKAaroLAydiB 菌株，摇瓶发酵能够积累莽草酸5.5g/L[15]。

4.2 以枯草杆菌为工程菌Iomantas 等将aroA（G），aroD 质粒导入aroI 缺失的枯草杆菌，莽草酸含量为19.7g/L[16] ；4.3 以柠檬酸杆菌为工程菌Shirai M 等通过诱变筛选，获得一株莽草酸产量为10.42g/L 的柠檬酸杆菌[17]。

4.4 以地衣芽胞杆菌为工程菌王勤等通过基因工程改造增加PEP 与E4P 合成水平，并切断莽草酸下游代谢途径，提高地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）中莽草酸的产量，构建了地衣芽胞杆菌产莽草酸工程菌WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD。

该菌株在优化培养基和培养条件下可以显著提高莽草酸的合成，终产量高达16.78g/L[18]。

4.5 以谷氨酸棒杆菌为工程菌刘双江等构建了莽草酸用谷氨酸棒杆菌的方法及应用。

通过选择适当的RBS 序列调整莽草酸表达途径中aroG、aroB、aroD、aroE 基因的表达量，大大提高了莽草酸的产量[19]。

4.6 以乳糖发酵短杆菌为工程菌农药草甘膦的杀草原理是：抑制植物体内的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，从而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，使蛋白质合成受到干扰，导致植物死亡。

袁其朋等用乳糖发酵短杆菌发酵葡萄糖至16～30h 加草甘膦抑制剂，莽草酸产量达未添加草甘膦时的1.667～2.887倍，生产稳定可靠[20]。

4.7 植物细胞组织培养提取莽草酸印度和马来西亚学者Biswapriya B.Misra1，2，* and Satyahari Dey1采用印度檀香的组织细胞进行培养，得到 yielded 0.07 and 0.08 %（w/w）。

5.结语与展望从目前状况分析，目前从八角茴香中提取莽草酸仍然是主要方法。

但随着种植成本和劳动力成本的上升，这个方法的优势会减小。

同时随着基因技术的发展，莽草酸的生物合成法会日益成熟，成本降低，将会在市场上占有越来越大的份额。

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