荧光素标记技术
免疫荧光技术概要课件
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2.改良法
（1）试剂配制：
①0.01mol／LpH7.2的PBS配法：NaCl 18g、 Na2HPO4 1.15g、KH2PO4+0.2g溶于2000ml 蒸馏水中，校定pH值至9.0。
②0.5mol／LpH9.0碳酸盐缓冲液配法：取 0.5mol／LNa2CO3（5.3％）10ml加入0.5mol ／L NaHCO3（4.2％）90ml，混合后，校定 pH值至9.0。
与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫
碳氨基键, 结合成为标记荧光免疫球蛋白, 即荧 光抗体。1个IgG分子上最多能标记15~20个 FITC分子。
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2. 四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl rhodamine isothcyanate, TRITC) 是一种紫 红色粉末, 较稳定, 是罗达明(Rhodamine) 的衍生物, 易溶于水。最大吸收光谱为 550nm, 最大发射光谱为620nm, 呈橙红色 荧光, 与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。 经常用于双标记染色, 使用较多。
⑤荧光素容易溶解, 溶解后不会和其他 物质发生化学反应。
⑥荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明, 能清晰判断结果。
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二、可用于标记抗体的荧光素
用于标记抗体和蛋白质的荧光色素到 目前为止有以下几种。
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1. 异硫氰酸荧光黄（fluorescien isothiocyanate, FITC） 纯品为黄色粉末, 有两种异构体, 易溶于 水和乙醇等溶剂, 在溶解状态下呈黄绿色荧光。 性质稳定, 低温干燥下可保存多年, 室温下也可 保存两年以上。FITC分子质量为390u, 最大吸 收光谱为490～495nm, 最大发射光谱为520～ 530nm, 呈现明亮的黄绿色荧光。其中异构体I型 荧光效率更高, 与蛋白质结合更稳定。其结构式, 在碱性条件下, FITC的异硫氰酸基在水溶液中
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
一、酶标记1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。
(4)称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
FITC-PNA绿色荧光素标记花...
FITC-PNA绿色荧光素标记花...FITC-PNA绿色荧光素标记花生凝集素（Peanut Agglutinin FITC Conjugate）凝集素是一种非酶活性、非免疫活性的生物分子，其生物功能还远未研究清楚，可特异及可逆地结合到碳水化合物分子上而不改变碳水化合物的分子结构，是一种糖蛋白研究试剂，也可用于免疫亲和色谱纯化技术以分离纯化糖蛋白、糖脂和细胞。
同时凝集素还能聚集红细胞，刺激血液淋巴细胞。
由于其能坚定人类红细胞上的糖配体，因而能被用于血型鉴定。
凝集素；同时提供各种荧光标记修饰偶联的凝集素。
提供罗丹明、CY3、CY5、FITC、生物素Biotin、琼脂糖Agarose、DyLight 488、DyLight 594、DyLight 649、Texas Red标记各种凝集素。
花生凝集素( PNA)Peanut Agglutinin从花生籽中提取的由4个相同地亚基组成的一种凝集素。
花生凝集素在区分正常组织和组织中发挥着重要作用，此外也可用于评估癌旁移行粘膜的恶性肿瘤形成情况。
可与质膜中含有β-D-Gal(1-3)-GalNAc的糖蛋白结合，Peanut Agglutinin Conjugate荧光标记花生凝集素PNA-FITC,荧光素标记花生凝集素PNA-ICG,吲哚菁绿标记物PNA-TMR,罗丹明标记物PNA-HRP,辣根酶标记物PNA- Biotin,生物素标记物PNA-Cy7,Cy7标记物PNA-Cy5.5,Cy5.5标记物PNA-Cy5,Cy5标记物PNA-Cy3,Cy3标记物Protein A & conjugates(荧光标记蛋白A)FITC-Protein ARB-Protein ACY3-Protein ACY5-Protein ACY7-Protein A Biotin-Protein A HRP-Protein A Maleimide-Protein A 小编：wyf 07.16。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
免疫荧光技术
葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀 后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述 PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀 后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml。
⑵ 除去标记不适当的抗体：
采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的 0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液， 进行分步洗脱。 未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。 中间洗脱出来的是荧光标记合适的抗体部分。 过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。 但经此法纯化，标记抗体损失达50%。
⑶ 除去非特异反应物质：
将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织 的组织粉预先吸收。 按每ml标记抗体加100mg组织粉比例混合， 4℃ 磁力搅拌1h，静置1h，1800r/min于4℃条件下离 心20min取上清液，再用每ml标记抗体加组织粉 比例重复一次。
（三）荧光抗体的鉴定
荧光素与蛋白结合率：
P:总蛋白质的量。F：荧光色素量。（物质的量）
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固定标本染色以F/P=1.5左右为宜 活细胞染色以F/P=2.4左右为宜.
F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。
F/P=
IgG (mg/ml)
荧光色素（μg/L ） 160 000x10 3 荧光色素 ( μg/L ） x 0.4 x 6
IgG (mg/ml) 390x10
病毒
无水乙醇,丙酮、CCl4
（3）固定后处理
抗原固定后必须立即以冷PH7.4 PBS冲洗,顺序经过三缸 浸泡,每缸3min，末次再以蒸馏水浸泡1min以脱盐。 标本固定干燥后最好立即进行荧光染色及镜检，如必须 保存则应保持干燥，置于4℃以下保存，一般细菌涂片或 组织切片经过固定后可保存一个月以上，但病毒和某些 组织 抗原标本则需-20℃以下保存。
荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法
荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法中文名称：异硫氰酸荧光素酯中文别名：荧光素-5-异氰酸酯; 异硫氰酸荧光酯异构体; 异硫氰酸荧光橙红; 异硫氰酸荧光红; 异硫氰酸荧光黄; 异硫氰酸荧光素（同分异构体I）; 荧光素5-异硫氰酸盐,异构体1,95%; 异硫氰酸荧光素异构体1.95+%; 异硫氰酸荧光素英文名称：Fluorescein isothiocyanate isomer I英文别名：Fluorescein isothiocyanate, isomer 1; 5-FITC;5-Isothiocyanato fluorescein; FITC; FITC-CELITE(R); FITC ISOMER; FITC 'ISOMER I'; FITC, ISOMER I; FLUORESCEIN ISOMER I ISOTHIOCYANATE;2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-5-isothiocyanatobe nzoic acidCAS号：3326-32-7 EINECS号：222-042-0 分子式：C21H11NO5S分子量：389.3807InChI：InChI=1/C21H11NO5S/c23-12-2-5-15-18(8-12)27-19-9-13(24 )3-6-16(19)20(15)14-4-1-11(22-10-28)7-17(14)21(25)26/h 1-9,23H,(H,25,26)分子结构：密度： 1.46g/cm3熔点：360℃沸点：735.6°C at 760 mmHg闪点：398.7°C水溶性：practically insoluble蒸汽压： 1.02E-22mmHg at 25°C【FITC标记原理】当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
免疫荧光技术基本原理
免疫荧光技术基本原理
免疫荧光技术是一种利用免疫反应原理进行检测的方法，通过标记荧光物质来检测目标物质的存在。
免疫荧光技术的基本原理如下：
1. 免疫反应：在免疫体系中，由于抗原与抗体之间存在特异性结合作用，可以通过免疫反应的方式将需要检测的目标物质与抗体结合起来。
2. 标记：将荧光物质与抗体结合，形成荧光标记的抗体。
常见的荧光物质有荧光素、荧光染料等，可以通过共价结合或非共价结合的方式将荧光物质与抗体结合。
3. 检测：将荧光标记的抗体加入样品中，使其与目标物质结合。
通过荧光显微镜或荧光分析仪等设备，可以观察到荧光信号的强度和位置。
4. 数据分析：通过荧光信号的强度和位置，可以判断目标物质的存在与否。
荧光信号的强度与目标物质的浓度呈正相关，荧光信号的位置可以反映目标物质在样品中的分布情况。
免疫荧光技术具有灵敏度高、特异性强、可定量检测等优点，广泛应用于生命科学研究、临床诊断等领域。
多色荧光素法(m-fish)注意事项_概述及解释说明
多色荧光素法(m-fish)注意事项概述及解释说明1. 引言1.1 概述多色荧光素法（m-fish），也被称为光谱染色体分析法，是一种用于研究生物体染色体结构和异常的技术。
通过同时使用多个荧光探针染色剂来标记不同的染色体区域，m-fish能够提供高分辨率的细胞核型信息，并能检测出一系列与遗传性疾病、癌症等相关的基因缺失、重排和扩增等变异。
1.2 文章结构本文首先介绍了m-fish的原理和实验步骤，然后着重探讨了在进行m-fish实验时需要注意的几个关键点，包括样本处理、实验设备和试剂选择以及数据分析与解释等方面。
最后，在总结概述中对m-fish的应用前景进行了展望，并提出了未来研究的方向。
1.3 目的本文旨在全面介绍多色荧光素法（m-fish）并概述其应用领域以及注意事项。
通过阐述m-fish的原理和实验步骤，读者可以对该技术有一个清晰的认识；而通过讨论注意事项，读者可以更好地掌握进行m-fish实验的关键要点，避免实验过程中可能出现的误差和问题。
希望本文能够为研究生物体染色体结构和异常的科研工作者提供一个有用的参考，推动该领域的进一步发展和应用。
2. 多色荧光素法(m-fish)2.1 原理介绍多色荧光素法（m-fish）是一种基于荧光原位杂交技术的染色体分析方法。
该方法通过使用同时标记不同染色体的多种荧光探针来识别和鉴定染色体上的结构变化、数目异常以及亚微观缺失或重排等基因改变。
在m-fish中，每对染色体会被特定颜色的荧光探针所标记。
这些探针包含特异性DNA序列，可以与相应染色体上的目标区域高度特异性地结合。
常用的探针可以发出红、绿、黄等多种颜色的荧光信号，从而使不同染色体得以区分。
2.2 实验步骤使用m-fish进行实验需要经历以下步骤：第一步：样本预处理。
将待检测样本制备成检测细胞悬液。
第二步：固定。
将检测细胞悬液进行固定处理，以保持细胞形态和结构的完整性。
第三步：去核化处理。
使用去核化液将固定的细胞进行去核化处理，除去干扰因素。
荧光标记PCR
主要需要考察的方面：•加热方式•升降温速度•准确性•均一性•激发光源•检测元件•检测通路•监测系统详情请参考全文……回顾分子生物学的发展历程，PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。
而PCR技术在近20年的不断发展创新中，最受瞩目当属荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR, or qPCR)。
定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃，通过对PCR过程的实时监控，专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。
本文从荧光定量PCR的原理入手，详细介绍荧光定量PCR仪的类型和技术，为定量PCR仪的选择提供详细参考。
一、背景本来，PCR是为了将样本中微量的DNA模版放大以便研究模版特性，随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，就需要了解标本中的DNA原始拷贝数。
理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，但实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线——因为随着PCR循环数的增加，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，最终进入平台期。
由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也往往不同。
因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。
通过传统凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的终产物量，而不能定量起始DNA模版的拷贝数。
荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面可以在每次PCR 循环收集数据，建立实时扩增曲线，准确地确定域值循环数(CT值)，计算起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。
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荧光素标记技术
荧光素标记技术是一种常用的生物学实验技术，它利用荧光素作为标记物质，通过与目标分子结合并发出荧光信号来实现对目标分子的检测和定位。
荧光素标记技术在生物学研究、药物开发、疾病诊断等领域都具有重要的应用价值。
一、荧光素标记技术的原理
荧光素是一种具有荧光性质的化合物，它在受到激发能量后能够发出特定波长的荧光信号。
荧光素标记技术利用荧光素的这一特性，将其与目标分子结合，形成荧光素-目标分子复合物。
当这种复合物受到特定波长的激发光照射时，荧光素会吸收能量并发出荧光信号，从而实现对目标分子的检测。
1. 生物分子的检测与定位
荧光素标记技术广泛应用于生物分子的检测与定位。
例如，在免疫组织化学实验中，可以将荧光素标记的抗体与待检测的蛋白质结合，通过检测荧光素发出的荧光信号来定位目标蛋白质在组织中的表达情况。
此外，还可以利用荧光素标记技术对细胞器、细胞膜、核酸等生物分子进行定位研究。
2. 药物开发与筛选
荧光素标记技术在药物开发与筛选中也具有重要的应用价值。
通过将荧光素标记的化合物与靶点结合，可以实现对药物与靶点的相互
作用进行研究。
同时，荧光素标记的化合物还可以用于药物筛选实验，通过检测荧光素发出的荧光信号来评估化合物与靶点的结合能力和选择性。
3. 疾病诊断与监测
荧光素标记技术在疾病诊断与监测中也有广泛的应用。
例如，在流式细胞术中，可以利用荧光素标记的抗体来检测特定细胞表面标志物的表达情况，从而实现对疾病相关细胞的识别和鉴定。
此外，荧光素标记技术还可以用于检测病毒、细菌等微生物的存在与数量，为疾病的早期诊断和监测提供重要依据。
三、荧光素标记技术的优势与局限
荧光素标记技术具有许多优势，如灵敏度高、特异性好、操作简便等。
此外，荧光素标记技术还可以实现多通道检测，通过选择不同的荧光素标记物，可以同时检测多个目标分子。
然而，荧光素标记技术也存在一些局限，如荧光素的发光强度受到环境因素的影响，需要在特定的实验条件下进行操作；此外，荧光素标记技术对光源和检测仪器的要求较高，需要保证光源的稳定性和检测仪器的灵敏度。
四、荧光素标记技术的发展趋势
随着生物学研究和医学诊断领域的不断发展，荧光素标记技术也在不断创新与改进中。
近年来，研究人员提出了许多新型的荧光素标
记技术，如荧光蛋白标记技术、荧光染料标记技术等，这些技术在灵敏度、稳定性、多通道检测等方面都有所突破，为生物学研究和医学诊断提供了更多的选择。
总结：
荧光素标记技术是一种重要的生物学实验技术，它通过荧光素的发光特性实现对目标分子的检测和定位。
荧光素标记技术在生物学研究、药物开发、疾病诊断等领域都具有广泛的应用价值。
随着技术的不断创新与改进，荧光素标记技术将在未来发展出更多的应用和潜力。