高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇的含量

高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇的含量摘要:采用高效液相色谱法测定了虎杖不同生长条件及不同部位的白藜芦醇含量｡建立了以色谱柱为Zorbax CB-C18(4.6×250 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(35∶65,V/V),流速为0.8 mL/min,检测波长为306 nm,柱温为室温,进样量为80 μL 的高效液相色谱方法｡结果表明,白藜芦醇浓度在2~100 μg/mL范围内与峰面积积分值呈良好线性关系(r=0.999 9);平均回收率为99.1%,RSD=1.2%(n=6)｡野生虎杖和组织培养虎杖白藜芦醇含量存在较大差异,虎杖不同部位白藜芦醇含量也存在较大差异,其中以野生虎杖根中白藜芦醇含量最高｡虽然在不同培养条件下,虎杖的不同部位都含有白藜芦醇,但与野生虎杖根相比含量差距较大,不能代替野生虎杖根的药用价值｡关键词:虎杖;白藜芦醇;高效液相色谱法Determination of Resveratrol in Polygonum cuspidatum by HPLCAbstract: The contents of resveratrol in different growing condition and different part of Polygonum cuspidatum were detected by HPLC. The separation was performed on Zorbax CB-C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) in methanol-water (V/V=35/65)with the flow rate of 0.8 mL/min and detected at 306 nm in room temper ature after injecting 80 μL sample. The linear range of resveratrol was 2~100 μg/mL with an average recovery of 99.1% (RSD=1.2%,n=6). The content of resveratrol in wild and tissue culture of Polygonum cuspidatum were different, and the contents of resveratrol in different parts of Polygonum cuspidatum also varied. The highest resveratrol in Polygonum cuspidatum was observed in wild plants. Though resveratrol of Polygonum cuspidatum differed in different culture conditions, the highest resveratrol content was detected in the roots of wild Polygonum cuspidatum, which indicated that the medical value of wild Polygonum cuspidatum was irreplaceable.Key words: Polygonum cuspidatum; resveratrol; HPLC白藜芦醇(Resveratrol)又称芪三酚,现代药理研究证明:白藜芦醇具有抗肿瘤､抗氧化､抗菌､抗炎､抗自由基､保护肝脏､保护心血管和抗心肌缺血､免疫调节､降血糖､降血脂等作用[1,2]｡另外白藜芦醇还有抗衰老､皮肤保健和美容功效[3,4]｡朱鸿津采用HPLC法测定虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)中白藜芦醇含量,测定结果表明,虎杖根中白藜芦醇含量可高达千分之一,可作为白藜芦醇的提取原料[5]｡然而,由于虎杖根的野生资源有限,大量采挖使野生资源日趋减少,近年来有一些利用组织培养快速繁殖虎杖的报道｡文涛等[6]测定发现虎杖愈伤组织中也含有白藜芦醇,并对虎杖不同部位白藜芦醇含量进行分析,结果发现虎杖根､茎､叶中均含有白藜芦醇,其中多年生根中含量最高[7]｡综上所述,虎杖不同生长条件､不同部位均含有白藜芦醇｡准确测定虎杖不同生长条件及不同部位白藜芦醇含量,将为虎杖资源进一步开发利用提供参考｡1材料与方法1.1仪器与材料高效液相色谱仪检测站(含Waters 1525二元泵､Waters 2487双通道紫外检测器､Breeze分析软件)(美国,沃特斯公司);Zorbax CB-C18(4.6×250 mm,5 μm)色谱柱(美国,安捷伦公司);Gzx-9146 MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);TGL-16G台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂);W201D恒温水浴锅､申科R-205旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司);SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州市上街华科仪器厂);FA2004N电子分析天平(上海精科天平仪器厂);JL-360DT型金利牌超声波清洗器(上海杰理科技有限公司)｡野生虎杖于2007年11月份采集于安徽科技学院中药种植园,由中药教研室时维静教授鉴定,为蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.);虎杖组织培养苗由安徽科技学院生物工程实验室提供,是由野生虎杖经组织培养而来｡白藜芦醇标准品(Sigma公司,纯度99.9%);乙酸乙酯(天津市北方天医化学试剂厂,分析纯);甲醇(TEDIA公司,色谱纯);去离子水;其余试剂均为分析纯｡1.2虎杖白藜芦醇的提取把待测虎杖于50 ℃干燥箱内过夜烘干,准确称取1.000 g样品,加1 g石英砂,于研钵中研碎,加10 mL乙酸乙酯,倒入50 mL具塞三角烧瓶中,再加10 mL乙酸乙酯冲洗研钵,一并倒入三角烧瓶中,室温避光提取12 h;然后将提取液以1 000 r/min 离心10 min,取上清于棕色试剂瓶中保存,残渣加15 mL乙酸乙酯继续提取12 h(共提取3次)｡将3次提取液与去离子水以1∶1(V/V)混合,抽提30 min,以1 000 r/min室温离心15 min,取有机相｡将提取液于50 ℃､80 r/min旋转减压挥干｡用色谱纯甲醇9 mL洗涤干燥瓶,倒入10 mL容量瓶中,用色谱纯甲醇定容至10 mL,再转入棕色试剂瓶中,待测｡1.3色谱分析条件流动相:甲醇-水(V/V=35/65);流速:0.8 mL/min;测定波长:306 nm;柱温:室温｡1.4标准溶液的配制准确称取白藜芦醇标准品10.0 mg,用色谱纯甲醇定容至10 mL,配制得1.0 mg/mL 标准白藜芦醇溶液,然后依次稀释为100 μg/mL､33.3 μg/mL､20 μg/mL､12.5 μg/mL 和2 μg/mL等5个不同浓度的工作溶液,待测｡2结果与分析2.1标准曲线的绘制将上述5个不同浓度的标准白藜芦醇溶液用0.45 μm滤膜过滤｡对过滤后的流动相进行超声脱气10~20 min,依次进样,每次进样80 μL｡以标准品不同浓度为横坐标,对应峰面积为纵坐标,绘制标准曲线｡由图1获得回归方程为:y=20 000 000x-22 343,其中R2=0.999 9｡2.2精密度试验按上述色谱条件,精密吸取质量浓度为20 μg/mL的对照品溶液,重复进样6次,每次80 μL,根据对照品峰面积积分值,计算RSD为1.35%(n=6)｡2.3HPLC法测定白藜芦醇含量用0.45 μm滤膜过滤样品｡对过滤后的流动相进行超声脱气10~20 min｡依次进样,进样量为80 μL,测定结果见图3和表1｡图3为野生虎杖茎(即表1中的A1B3)白藜芦醇含量色谱图｡根据白藜芦醇标准品曲线的回归方程y=20 000 000x-22 343,按外标峰面积法求得各样品的白藜芦醇含量｡实验测得的数据有两个影响因素,生长条件(A)和部位(B),即A因素有2个水平,B因素有3个水平,共有6个组合,每一组合有3个检测值,则一共有18个检测值｡测定结果见表1｡2.4资料的方差分析将表1资料用SPSS 13.0软件作方差分析,以固定模型作F测验｡由表2可知,生长条件的F=31.226,P<0.01,部位的F=41.547,P<0.01,生长条件与部位互作的F=31.743,P<0.01,表明生长条件､部位及生长条件与部位互作虎杖中白藜芦醇含量均有极显著差异,即虎杖在不同生长条件下,白藜芦醇含量存在极显著的差异;虎杖不同部位白藜芦醇含量存在着极显著的差异;虎杖不同生长条件及不同部位白藜芦醇含量存在着极显著的差异｡3小结与讨论从测定结果看,野生和组织培养虎杖不同部位白藜芦醇含量差异很大,经方差分析表明有极显著差异｡就部位而言,根部白藜芦醇含量显著高于叶和茎的白藜芦醇含量,而茎和叶白藜芦醇含量则无显著差异,这与张烜等研究的HPLC法测定花生不同部位白藜芦醇含量中花生根部白藜芦醇含量最高相符[8]｡所有样品中白藜芦醇含量最高的是野生根,野生根中白藜芦醇含量高达0.696 1 mg/g｡这主要因为虎杖是多年生草本植物,在其根部积累的白藜芦醇含量较高,这与传统的药用部位相符,而野生的叶和野生茎都是1年生,组织培养虎杖培养时间为1个月左右,所以虎杖中白藜芦醇含量较低｡另一方面,野生的生长条件对白藜芦醇的合成创造了良好的逆境条件｡利用组织培养手段获得的虎杖无菌组培苗虽然具有繁殖率高､生长速度快等优点[9],但由于生长条件相对单一而稳定,导致“逆境物质”白藜芦醇合成能力下降｡在虎杖组织培养时,我们可以从人工创造有利于白藜芦醇合成的生长条件方面研究,如调节光照､温度等条件,以提高虎杖中白藜芦醇含量｡参考文献:[1] 李旭波,谢人明. 白藜芦醇的药理作用研究进展[J]. 西部药学,2007,4(1):37-39.[2] 郜海燕,于震宇,陈杭君,等. 白藜芦醇功能和作用机理研究进展[J]. 中国食品学报,2006,6(1):411-416.[3] 韩晶晶,刘炜,毕玉平. 白黎芦醇的研究进展[J]. 生物工程学报,2008,24(11):1851-1859.[4] 李延华,王伟君,张兰威,等. 白藜芦醇的研究现状及应用前景[J]. 中国酿造,2008,184(7):10-12.[5] 朱鸿津. HPLC法测定虎杖中白藜芦醇含量[J]. 中国野生植物资源,2001,20(1):49-50.[6] 文涛,梁莉,曾杨,等. 不同光照强度对虎杖愈伤组织的影响[J]. 中国中药杂志,2007,32(13):1277-128[7] 夏海武,吕柳新. 虎杖不同部位白藜芦醇含量的分析[J]. 植物资源与环境学报,2005,14(3):55-56.[8] 张烜,胡君萍,韩玫,等. HPLC法测定花生不同部位中白藜芦醇的含量[J]. 新疆医科大学学报,2003,26(5):440-441.[9] 杨培君,李会宁,赵桦. 虎杖的组织培养与快速繁殖[J]. 西北植物学报,2003,23(12):2192-2195.。