土壤中分解尿素细菌的分离与计数学案

土壤中分解尿素细菌的分离与计数学案
一、研究思路
1．筛选菌株
(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于________________生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时________或________其他微生物生长。

(2)选择培养基：在微生物学中，将允许__________种类的微生物生长，同时________或________其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

(3)分离分解尿素的细菌的选择培养基：①在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是____________，提供氮源的是________，琼脂的作用是凝固剂。

②该培养基对微生物具有选择作用。

其选择机制是___________才能在该培养基上生长。

③土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们体内能合成________，将尿素分解的反应式是________________________________________________________。

Taq 细菌能忍受93℃左右的高温，是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据____________________________________________。

2．统计菌落数目的方法
(1)稀释涂布平板法(也叫活菌计数法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的____________，通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②操作：第一，设置重复组，增强实验的说服力与准确性。

将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择________稀释度的菌液，分别取0.1 mL 接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。

为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出__________。

第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。

③计算公式：每克样品中的菌株数＝C V ×M，其中C 代表___________________________，V 代表________________________________(mL)，M 代表____________。

(2)显微镜直接计数法
①原理：此法利用特定的____________或______________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。

计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定
的面积1 mm 2和高0.1 mm 的计数室，在1 mm 2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每
个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由________个小格组成。

②操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。

③计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

(3)设置重复和对照
①设置重复：培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布________个平板，才能增强实验的说服力与准确性。

②设置对照：实验中应设置对照，主要目的是________________________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

如__________对照组，观察培养物中是否有杂菌污染；设置________培养基，观察选择培养基是否具有________作用。

二、实验设计（实验步骤）
1．土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土3 cm 左右，迅速取土壤并装入____________密封或事先准备好的________中。

2．制备培养基：①制备________________培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基作为________，用来判断选择培养基是否具有____________。

②放宽稀释范围，如稀释倍数为103～107范围内的要分别涂布，而每个稀释度下需要______
个选择培养基、________个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要15个选择培养基和5个牛肉膏蛋白胨培养基。

③两种培养基应各有一个作为________对照，此外还需准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。

3．样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示
意图，将10 g 土样加入盛有90 mL 无菌生理盐水的
锥形瓶中(锥形瓶体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液1 mL ，转移至盛有________ mL
生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸
取______mL 进行平板涂布操作。

按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

说明：图中的1、2、3平板是____________，4为____________________作对照，判断选择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否____________。

4．将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。

5．挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含____________培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。

6．细菌的计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。

在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出____________，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征。

7．统计表格
稀释倍数 1 1
注：一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，____________表现出________的菌落特征。

三、操作提示 1．取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要________。

2．应在________旁称取土壤。

在火焰附近将称好的土样倒入________中，塞好棉塞。

3．在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在________旁操作。

4．实验时要对________做好标记。

注明______________________________________等。

5．为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当________________。

四、结果分析与评价
菌落形态多样，菌落数偏高→培养物中混入____________
选择培养基的筛牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目________选择培养基的数目→选择培养基
具筛选作用，已筛选出一些菌落
得到2个或2个以上菌落数目在________的平板→操作成功，能进行菌落的在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的________将尿素分解成了________。

氨会使培养基的碱性增强，________升高。

因此，我们可以通过检测培养基____________来判断该化学反应是否发生。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，培养某种细菌后，如果pH 升高，指示剂将________，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。

土壤中分解尿素细菌的分离与计数学案答案
一、1.(1)目的菌株 抑制 阻止 (2)特定 抑制 阻止
(3)①葡萄糖 尿素 ②只有能够以尿素作为氮源的微生物 ③
脲酶 CO(NH 2)2＋H 2O ――→脲酶CO 2＋2NH 3 它对生存环境的要求，到相应
的环境中去寻找
2．(1)①一个活菌 菌落数 ②三个 菌落平均数 30～300 某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 涂布平板时所用的稀释液的体积 稀释倍数 (2)①细菌计数板 血细胞计数板 400 (3)①至少3 ②排除实验组中非测试因素 空白 完全 筛选
二、1.(1)无菌信封 烧杯 (2)①牛肉膏蛋白胨 实验组 选择作用 ②3 1 ③空白 (3)9 0.1 选择培养基
牛肉膏蛋白胨培养基 含有杂菌 (5)酚红指示剂 (6)30～300 平均值 (7)同种微生物 稳定
三、1.灭菌 2.火焰 锥形瓶 3.火焰 4.培养皿 培养基类型、培养时间、稀释度、培养物 5.事先规划时间
四、无 偏高 其他氮源 大于 30～300 接近
五、脲酶 氨 pH pH 的变化 酚红 变红。