蛋白纯化步骤
[应用]GST蛋白表达、纯化步骤
![[应用]GST蛋白表达、纯化步骤](https://img.taocdn.com/s3/m/725a191e591b6bd97f192279168884868762b899.png)
Protein Expression Protocol:1.Transform control construct and tag-fusion-constructs into E.coli BL21(DE3) competent cell, growovernight;2.Inoculate single colony to 2~3 ml LB medium, and grow at 37 degree for 7~10 hours or overnight;3.1:100 inoculate to 3 ml LB, bacteria grow for 2-3 hours at 37 degree, then follow 1:2000 add 1 MIPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;4.Spin down bacteria at 12000 rpm for 1 min, wash with 1 ml ddH2O, add 100 ul 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 3~5 min on ice;5. Spin down at 12000 rpm for 10min, separate the supernatants and deposition;6. Boiling with loading buffer at 100 degree for 5min, Spin down at 12000 rpm for 5min, 12%SDS-PAGE;7. After confirmed protein expressed in supernatants, increase the volume of bacteria medium. 1:100inoculate to 100 ml LB, grow bacteria for 2-3 hours at 37 degree;then follow 1:2000 add 1 M IPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;8. Spin down bacteria at 8000 rpm 4 degree for 5 min, wash with 10 ml ddH2O, add 5 ml 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 60 min on ice;9. Spin down at 12000 rpm 4 degree for 10min, separate the supernatants and deposition;10.Prepare the supernatants for purification.蛋白表达注意事项：1. E.coli BL21比DH5α生长要快，固体培养基上10～12小时即可长斑，液体培养基中8小时后即可生长成较大密度；切勿培养时间过长，防止菌体老化；2.为了后续实验的便利，应尽量减少包涵体的形成。
[应用]His-GFP蛋白的纯化步骤
![[应用]His-GFP蛋白的纯化步骤](https://img.taocdn.com/s3/m/e498d7d1ab00b52acfc789eb172ded630b1c983f.png)
以His-GFP为例简述His-tag蛋白的纯化His-tag是重组蛋白中最常用的融合标签之一。
使用镍柱纯化His-tag融合蛋白的原理为：组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。
实验中一般选用6个组氨酸（His6-tag）的标签。
His6标签有许多优点：（1）由于只有6个氨基酸，分子量很小，对蛋白结构和活性的影响较小，一般不需要酶切去除；（2）可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力；（3）His6标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。
His6标签也有一些不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。
镍柱纯化时金属镍离子容易脱落，混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。
本实验将以His-GFP（绿色荧光蛋白）为例，阐述His-tag蛋白的纯化过程。
1. E. coli重组菌体破碎表达完成的E. coli重组菌体，经超声或细胞破碎仪进行破碎。
当需要破碎的细胞沉淀较少（＜ 1 g）时，通常在Eppendorf管中，用超声法完成细胞裂解。
而当细胞沉淀较多时，可选用细胞破碎仪进行破碎。
本实验采用细胞破碎仪法。
细胞破碎仪法：称量细胞沉淀的湿重，加入细胞湿重10倍体积的裂解缓冲液。
如，1 g细胞沉淀加入约10 ml的裂解缓冲液，使得细胞在溶液中的终浓度为10-15%，在此范围内细胞破碎的效果较好。
过浓或过稀的细胞浓度均不利于破碎效率。
裂解缓冲液的组成如下：Lysis buffer：20 mM Tris-HCl, pH 7.4100 mM NaCl10 mM imidazole0.1% Triton X-1001 × protease inhibitor将细胞沉淀在裂解buffer中充分搅拌至没有结块后，进行高压破碎。
lcms前蛋白纯化步骤
lcms前蛋白纯化步骤
lcms前蛋白质提取应尽量多的提取出活性蛋白，避免各因素导致目的蛋白失活；
选用不同的溶剂提取分离lcms前蛋白质（大多数蛋白溶于水，稀盐，稀酸等，少数与脂类结合的蛋白则溶于乙醇等有机溶剂）；
提取蛋白一般在低温环境中操作，避免lcms前蛋白质在提取过程中降解（可加入蛋白酶抑制剂，如PMSF、EDTA、antipain和leupeptin等）；
提取时缓冲液的用量通常是原材料的1~5倍，提取时注意均匀搅拌，这样有利于蛋白的溶解（缓冲液通常选用PH≈7，0.15mol/L磷酸盐缓冲液或PH7.5，0.1mol/LTris-Hcl缓冲液）；
lcms前蛋白质提取常用各种水溶液，一般是在偏离等电点0.5pH 以上，此时蛋白的溶解度增加；
用稀酸提取等电点在碱性范围内的lcms前蛋白质，用稀碱提取等电点在酸性范围内的蛋白，尽可能提高目的蛋白在提取液中的溶解度。
蛋白质纯化步骤
蛋白质纯化步骤蛋白质纯化，这可是个有趣又重要的事儿啊！就好像从一堆乱糟糟的杂物里找出你最宝贝的那个小物件一样。
首先呢，得准备好你的原料，这就好比要踏上旅程，得先有个出发地呀。
这原料可以是各种生物样本，比如细胞啦、组织啦等等。
然后呢，就是把这些原料进行破碎处理，让里面的蛋白质能跑出来，就像是打开一个神秘的盒子，让宝贝有机会现身。
接下来，就到了关键的一步啦，选择合适的方法来分离这些蛋白质。
这就好像在一个大集市里，要把你想要的东西挑出来。
可以用盐析法呀，就像是用一把特殊的筛子，把蛋白质筛出来；还有层析法，就如同让蛋白质们排队，按照它们的特点依次通过不同的关卡。
哎呀，这过程可不简单呢！每一步都需要精心操作，稍有不慎，可能就把珍贵的蛋白质弄丢啦。
就好像走钢丝一样，得小心翼翼的。
在纯化的过程中，还得注意各种条件哦。
温度啦、酸碱度啦，这些都像是蛋白质的小脾气，得顺着它们来。
不然它们一不高兴，可就不乖乖听话啦。
然后呢，经过一轮又一轮的筛选和分离，慢慢的，我们就能得到纯度比较高的蛋白质啦。
这感觉，就像是经过千辛万苦，终于找到了那传说中的宝藏一样令人兴奋！你想想看，从一开始那乱糟糟的一堆，到最后得到纯净的蛋白质，这是多么神奇的过程呀！这就好比把一块粗糙的石头，经过精心打磨，变成了一颗闪闪发光的宝石。
而且啊，蛋白质纯化的意义可重大啦！它可以帮助我们更好地了解蛋白质的性质和功能，为医学研究、药物开发等提供重要的支持。
这不就像是给我们打开了一扇通往未知世界的大门吗？总之呢，蛋白质纯化可不是一件容易的事儿，但只要我们用心去做，就一定能收获满满呀！就像那句话说的，世上无难事，只怕有心人嘛！让我们一起加油，去探索蛋白质纯化的奇妙世界吧！。
镍柱蛋白纯化
镍柱蛋白纯化镍柱蛋白纯化是一种常用的基于亲和层析的蛋白纯化方法，它通过靶蛋白的亲和性与含有Ni2+离子的镍柱发生相互作用，从而实现靶蛋白的分离与纯化。
本文将介绍镍柱蛋白纯化的基本原理、实验步骤以及注意事项。
基本原理镍柱蛋白纯化基于亲和层析的基本原理。
亲和层析是一种根据靶蛋白的化学或生物特性选择性地捕捉分离靶蛋白的方法。
镍柱蛋白纯化利用含有Ni2+离子的亲和层析介质作为捕捉靶蛋白的载体。
由于Ni2+离子与组蛋白中的组氨酸以及其他氨基酸存在较强的亲和力，镍柱中的Ni2+离子能够与靶蛋白中含有组氨酸或其他靠近组氨酸的官能团结合，实现了靶蛋白的分离纯化。
实验步骤镍柱蛋白纯化的实验步骤如下：1.细胞裂解与分离：首先需要将选择的表达靶蛋白的菌株用化学或机械方法破裂，并从细胞裂解液中分离靶蛋白。
2.杂质去除：利用超速离心等手段，去除裂解液中的大量无关蛋白质，以减少后续纯化的杂质。
3.镍柱柱层析：将镍柱填充到层析柱中，使之平衡，然后将分离的靶蛋白通过柱层析，利用其与镍柱中Ni2+离子的亲和力捕捉纯化。
4.洗脱：通过改变缓冲条件（如pH、盐浓度等），使得捕获靶蛋白的镍柱发生变化，最终使其与捕获的蛋白离开。
5.透析：将洗脱得到的靶蛋白透析回目标缓冲液中，以去除与纯化过程中引入的杂质。
注意事项1.掌握柱层析的平衡、清洗和洗脱条件，以避免蛋白质在分离过程中被损坏。
2.需要选择合适的表达菌株、表达载体以及诱导条件，以提高目标蛋白质的表达水平和纯化效率。
3.超速离心过程中，建议在4°C下高速离心，以避免破坏蛋白质结构。
4.纯化过程中需要掌握蛋白质的稳定状态和活性，以确保最终得到的蛋白质具有高纯度和活性。
镍柱蛋白纯化是一种常用的基于亲和层析的蛋白纯化方法，该方法可以高效地从蛋白质混合物中纯化高丰度、高质量的靶蛋白质。
在实验过程中，需要注意掌握柱层析、表达菌株选择、超速离心和掌握蛋白质的稳定状态和活性等方面的技巧，以获得高质量的纯化结果。
蛋白表达纯化的实验原理
蛋白表达纯化的实验原理蛋白表达与纯化是生物学实验中常用的技术，可以用来研究和生产各种蛋白质。
本文将一步一步回答关于蛋白表达纯化实验的原理和步骤。
第一步：蛋白表达系统的选择蛋白表达系统是指用来制备和表达目标蛋白质的细胞或病毒载体。
常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等。
选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质、需求量和表达效率等因素。
第二步：构建表达载体表达载体是将目标蛋白的基因序列插入到细胞或病毒载体中，以实现蛋白表达的工具。
通常采用的方法是将目标基因通过限制性内切酶切割，然后与适当的载体连接。
第三步：细胞转染或感染将构建好的表达载体转染到细胞中，使目标蛋白基因在细胞内进行表达。
对于真核细胞（如哺乳动物细胞）可以通过转染的方式传递质粒DNA，而对于原核细胞（如大肠杆菌）可以通过热激转化或电穿孔等方法进行具体的转染。
第四步：培养表达细胞转染或感染后，需要将细胞培养到合适的条件下，以促进目标蛋白表达。
培养条件包括适宜的培养基、温度、氧气供应和营养物等。
此外，可以考虑添加特定的诱导剂或抑制剂，以调控蛋白表达的级别。
对于细菌目标蛋白表达，通常将细胞培养在含有抗生素的培养基上以选择表达带有目标基因的细菌。
第五步：蛋白表达检测为了确定目标蛋白是否在细胞中表达，可以使用多种方法进行检测。
常用的方法包括Western blot、ELISA、原位杂交、荧光染色等。
同时，可以通过调整培养条件或表达载体的构建来提高蛋白表达的水平。
第六步：蛋白纯化蛋白纯化是从表达系统中提取和纯化目标蛋白的过程。
纯化步骤的选择取决于目标蛋白的性质和所需的纯度。
常见的纯化方法包括亲和纯化、凝胶过滤、离子交换、大小排除层析、亲水性层析等。
此外，还可以使用亲和标签（如His标签、GST标签等）来辅助蛋白质的纯化。
第七步：蛋白质的鉴定和定量通过蛋白纯化后，需要对目标蛋白进行鉴定和定量。
可以使用SDS-PAGE、Western blot、质谱分析等方法来确定蛋白质的分子量和纯度。
质粒蛋白提取、纯化的具体步骤及方法
质粒蛋白提取、纯化的具体步骤及方法携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。
4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22 um滤膜抽滤，-20℃保存。
二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
三、构建重组表达载体1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2. PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
四、获得含重组表达质粒的表达菌种1. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
蔗糖密度梯度离心法纯化蛋白步骤
蔗糖密度梯度离心法纯化蛋白步骤下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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His-Tag蛋白纯化步骤
变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白（主要以包涵体的形式表达）的样品制备1、用1X PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5ml 1 MBS）,并按上述方法进行超声破菌。
2、12000 rpm离心10 min收集包涵体。
若有必要，用1 >PBS洗包涵体几次。
3、用Binding/Wash Buffer （约每毫升沉淀加5ml 1 XPBS）溶解包涵体，并在室温下孵育30〜60分钟。
若使沉淀充分溶解，有必要进行机械或超声均质。
4、12000rpm离心30min,取上清至一干净管中。
His 标签蛋白的重力纯化流程1ml柱子的总体积为10ml，只需加入介质。
如果样品体积大于柱子体积，可重复利用，注意不要超过树脂的结合能力。
1、平衡柱子的工作温度。
应在室温或4C下进行纯化。
2、取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。
3、用2 倍树脂体积的Binding/Wash Buffer 平衡柱子，以0.5〜1 ml/min 的流速过柱。
4、从柱子上部加入经Binding/Wash Buffer 处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。
若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。
5、用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer洗涤树脂并收集流出液。
重复该步骤，用一新的收集管收集流出液。
直到流出液的吸光度在280 nm基线处。
6、用两倍树脂体积的Elution Buffer 将His 标签蛋白从树脂上洗脱下来。
重复此步骤两次，并单独收集每次洗脱出来的液体。
7、用Modified Coomassie Bradford Assay Kit （No SK3041）。
洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE 分析。
注意：洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤（如No BSP090 gravity Desalting Column）或透析去除咪唑以便后续应用。
SDS-PAGE分析前，含6M盐酸胍的样品必须用含8 M 尿素的缓冲液透析。
蛋白纯化相关原理及方法
蛋白纯化相关原理及方法蛋白纯化是生物科学研究中常用的一项技术，它可以分离纯化出目标蛋白质，从而方便后续的研究和应用。
本文将介绍蛋白纯化的原理和方法。
一、蛋白纯化的原理蛋白纯化的原理是基于不同蛋白质的特性差异，通过采用不同的分离技术，将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且使其达到纯度较高的状态。
蛋白质的特性差异主要包括以下几个方面：1. 分子质量：蛋白质的分子质量不同，可以通过分子大小的差异进行分离。
常用的方法包括凝胶过滤层析和超速离心。
2. 电荷性质：蛋白质具有不同的电荷性质，可以通过离子交换层析、电泳等方法进行分离。
离子交换层析是利用蛋白质与固定在固相上的离子交换基团之间的相互作用进行分离。
3. 亲和性：蛋白质与其他分子之间可能存在特异的结合，可以通过亲和层析进行分离。
亲和层析是利用蛋白质与特定配体之间的结合进行分离。
4. 疏水性：蛋白质的疏水性不同，可以通过逆向相层析等方法进行分离。
逆向相层析是利用溶剂的极性进行分离，疏水性较高的蛋白质会更早洗脱。
二、蛋白纯化的方法1. 直接纯化法：直接从生物样品中纯化目标蛋白质，可以通过分离离心、沉淀和过滤等简单的操作步骤进行。
这种方法适用于目标蛋白质含量较高的样品。
2. 柱层析法：柱层析是一种常用的蛋白纯化方法，可以根据目标蛋白质的特性选择不同的层析柱进行分离。
常用的柱层析方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
3. 电泳法：电泳是利用蛋白质的电荷性质进行分离的方法，常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和等电聚焦电泳（IEF）等。
4. 超滤法：超滤是利用膜的孔径大小对蛋白质进行分离的方法，常用的超滤方法包括凝胶过滤和离心浓缩等。
5. 亲和纯化法：亲和纯化是利用蛋白质与特定配体之间的结合进行分离的方法，常用的亲和纯化方法包括亲和层析、亲和吸附、亲和沉淀等。
6. 水相两相法：水相两相法是利用两相体系的差异进行蛋白质的分离，常用的方法包括聚乙二醇硫酸铵法和聚乙二醇聚丙烯酰胺法等。
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纤溶（溶栓）酶的分离及其性质研究血栓是一种严重危害人类尤其是中老年人身体健康和生命的疾病，近年来发病率逐年增加，已成为常见病和多发病，是造成死亡和病残的首要原因。
纤溶酶对纤维蛋白（原）具有专一水解活性，纤溶酶作为溶栓药物可以降解血栓骨架结构——纤维蛋白多聚体，从而达到溶解血栓栓子的目的，因此，药物溶栓是目前临床上治疗血栓性疾病的首选策略。
对“理想”溶栓药物的要求是：快速溶栓，对纤维蛋白特异，只作用于血栓而全身反应低，效力持久；出血危险性低；无全身性副反应，无抗原性，避免全身性纤溶、价廉等。
目前对溶栓药物研究工作主要从两方面开展，一是应用基因工程和单克隆抗体技术对现有药物进行改造使之更理想；另一方面是开发新型天然来源的溶栓药物。
近几年，寻找天然来源的纤溶酶也成了一个研究热点。
在动物、植物、海洋生物、微生物中都发现了天然的溶栓物质。
在动物来源的纤溶酶中，人们研究较多的是从蚯蚓、蛇毒和蝙蝠的唾液及吸血动物中提取的纤溶酶；植物来源的纤溶酶主要是从丹参和蒲黄中提取；微生物更是纤溶酶的一种重要来源，如目前临床应用的溶栓药物链激酶、葡激酶、纳豆激酶等；在细菌、真菌、藻类中还发现了多种新型纤溶酶。
从作用机理上纤溶酶分成两类：一类是纤溶酶原激活剂，能将纤溶酶原激活为纤溶酶而降解纤维蛋白（原）；另一类是纤溶酶类活性物质，直接可以降解纤维蛋白（原）；都具有溶解血栓的作用（见下图）。
发现和筛选新型来源的纤溶酶是研发溶栓药物的基础，利用基因工程技术或蛋白质工程技术改造天然纤溶酶制成变异体、嵌合体或导向药物，是提高纤溶酶的选择性溶栓效果，延长半衰期，减少用药剂量和变态反应，降低成本的重要手段。
制药工程研究室已从土壤中筛选出70多株纤溶酶产生菌，上学期的毕业生对其中9株菌进行了鉴定，并提取了外泌蛋白，检测后其中6（30—60） ，6（60—90） ，15（20—90） ，31（30—60） ，31（60—90） ，45（20—90） ，50（20—90） ，55（20—90） ，70（30—60） ，70（60—90） ，72（20—90）（菌号（硫酸铵沉淀浓度））具有纤溶活性。
本学期主要工作有：1. 纤溶酶活性测定：琼脂糖—纤维蛋白平板法2. 蛋白含量测定：考马斯亮蓝法 →比活力测定3. 分离和纯化：离子交换层析DEAE Sepharose 或CM-Sepharose4. SDS-PAGE 电泳：硝酸银染色和考马斯亮蓝G-250染色, 检测分子量大小和分离效果。
5. 活性电泳：检测活性带位置，6. 等电聚焦电泳：分离纤溶蛋白、测定等电点7. 转膜、测序纤溶酶原激活剂纤溶酶原 纤溶酶纤维蛋白原或纤维蛋白（血栓栓子）纤维蛋白原降解物(FgDP)或纤维蛋白降解物(FDP)（血栓溶解）血栓的溶解过程8. 性质鉴定：包括Km值测定；激酶活性；最适作用温度和温度对活性的影响；最适作用pH和pH对活性的影响；金属螯合剂、酶抑制剂、蛋白变性剂、蛋白酶对活性影响；体外对小鼠血凝块的溶解作用；1 分离和纯化：DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(或CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析) 1.1 试剂1.Tris-HCl平衡液的配制：用超纯水配置0.01mol/L的Tris，然后用HCl调pH至8.0（或7.8），记为0.01mol/LTris-HCl。
2.NaCl洗脱液的配制：用配好的0.01mol/L的Tris-HCl液当溶剂，配制不同浓度的NaCl溶液，即为含0.01mol/L的平衡液的NaCl溶液。
1.2DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂的处理：（1）先用0.5mol/L NaOH 100mL浸泡30min，倒掉NaOH，加超纯水，每半小时轻轻搅拌一次，每小时换水一次，洗至中性为止。
（2）再用0.5mol/L HCl100mL浸泡30min，倒掉HCl，同前方法洗至中性。
（3）最后用0.5mol/L NaOH 100mL浸泡30min，倒掉NaOH，加超纯水，每半小时轻轻搅拌一次，每小时换水一次，洗至中性，加0.01mol/L的Tris-HCl平衡液浸泡。
1.3装柱：先在层析柱中装入4-5cm超纯水，打开柱下边的出水口，让水自然流下，以赶走柱下部的气泡，待柱中的水留有一部分时，用塑料吸管将树脂和水的混合物绕柱内壁缓缓加入柱中，使树脂达柱长的2/3。
柱上部留一部分水，不能使柱子干裂。
注意加入树脂时不要产生气泡，或出现断层，柱面一定要平，以防止样品不均匀的下降。
1.4平衡柱子用0.01mol/L的平衡液平衡柱子，打开紫外检测仪，先在0.1A下细调，平衡至0，然后在1.0A下粗调，再平衡至0。
平衡体积大约150-200ml。
1.5上样关闭柱下出水口，用塑料吸管吸取蛋白溶液7-8ml均匀的加入到树脂中。
样品的配制：用0.01mol/L平衡液溶解粗蛋白，配成30-40mg/ml。
12000rpm，离心10min。
1.5树脂再平衡待样品快要进入树脂时，向树脂中加入平衡液，待紫外吸收值上升到10以上时，用灭菌的三角瓶收集此峰，即为未结合到树脂上的蛋白。
直至平衡至A280为不在变化，大约150-200ml。
1.7洗脱平衡好树脂后，先用0.1mol/L的含0.01mol/L平衡液的NaCl洗脱，打开记录仪，紫外吸收值上升到10以上时，收集洗脱峰，并在瓶上做好标记。
待紫外吸收值在一段时间内不再下降时，换0. 3 mol/L的含0.01mol/L 平衡液的NaCl洗脱。
重复上述步骤，依次用0.5mol/L、0.7mol/L、1mol/L NaCl洗脱。
待蛋白完全洗脱后，用平衡液再平衡树脂，以备下次使用。
1.8洗脱的蛋白装透析袋透析（24h），然后冻干。
1.9检测活性，跑SDS-PAGE电泳检测纯度。
2 SDS-PAGE电泳2.1 试剂1. 30%胶：丙烯酰胺(Acr)15.2g ，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.4g，水定容至50mL。
2. PH8.9buffer：Tris9.2g,1N Hcl 12mL，水定容至50mL。
3. PH6.7buffer：Tris3g,1N Hcl 24mL，水定容至50mL。
4. APS：过硫酸铵5g，水定容至50mL。
5.10% SDS：SDS 5g,，水定容至50mL。
6.电泳液：Tris 3g，Gly 14.4g，SDS 1g，水定容至1000mL。
7.染色液：0.2g G-250溶于甲醇中，过滤，加冰乙酸10mL，水定容至100mL。
8.脱色液：甲醇10mL，乙酸7.5 mL，水定容至100mL。
9.还原样品液：PH6.7buffer2.5mL+甘油1mL+10%SDS1mL+巯基乙醇100uL+少量溴酚蓝，定容至5mL。
10.非还原样品液：PH6.7buffer2.5mL+甘油1mL+10%SDS1mL+少量溴酚蓝，定容至5mL。
11.12%胶的配置2.2 操作步骤2.2.1 灌胶按照上面分离胶12%的浓度像玻璃槽中现灌入分离胶，大约灌3.2mL，然后用水压平，待分离胶凝固后倒掉水，然后灌入浓缩胶，迅速把梳子插入浓缩胶中，凝固后迅速拔下梳子，用吸水纸吸掉胶孔里的水。
2.2 样品处理在加样之前把样品蛋白水煮10min，然后加入还原样品液（如果还原样品液是5倍，则两者比例为4比1）在12000rpm下离心10min，用进样器把上述蛋白注入胶孔内，用煮过的蛋白maker注入一个胶孔内作对比。
机上样品加入顺序和胶版正反面。
2.3 接电源插上电源，先用90v，等样品跑过分离胶后改用150v。
2.4 后处理电泳跑完后，用考马斯亮蓝G-250染色10min，脱色液脱色，摇晃过夜，观察出现的条带。
3活性电泳3.1 试剂1. 30%胶：丙烯酰胺(Acr)15.2g ，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.4g，水定容至50mL。
2. PH8.9buffer：Tris9.2g,1N Hcl 12mL，水定容至50mL。
3. PH6.7buffer：Tris3g,1N Hcl 24mL，水定容至50mL。
4. APS：过硫酸铵5g，水定容至50mL。
5.10% SDS：SDS 5g,，水定容至50mL。
6.电泳液：Tris 3g，Gly 14.4g，水定容至1000mL。
7.染色液：0.2g G-250溶于甲醇中，过滤，加冰乙酸10mL，水定容至100mL。
8.脱色液：甲醇10mL，乙酸7.5 mL，水定容至100mL。
9.天然样品液：PH6.7buffer2.5 mL，甘油1mL，少量溴酚蓝，水定容至5mL。
10.凝血酶：20mg/mL,PBS配制。
11.纤维蛋白原：20mg/mL，PH8.9buffer配制。
12.12%胶的配置3.2 步骤Fibrin-PAGE参照Kim SH等方法，在制备分离胶时，加入十二烷基硫酸钠（SDS），使其终浓度为0.1%；加入用pH8.9的Tris-HCl缓冲液配制的20 mg·mL-1的纤维蛋白原，使其终浓度为0.4 mg·mL-1；加入适量凝血酶，以催化纤维蛋白原形成纤维蛋白；进行SDS-PAGE电泳。
电泳结束后，将凝胶置于2%TritonX-100溶液中浸泡1h，而后放入PBS（pH7.2）溶液中浸泡，于37℃保温1h，用考马斯亮蓝G-250染色10min，脱色液脱色，观察透明带是否出现以及出现的位置。
4 转膜步骤：按常规条件进行SDS－PAGE，对于分子量大于20KD的蛋白质，可采用Tris－苷氨酸缓冲系统；而Tris －Tricine系统，既可用于低分子量蛋白，也可用于高分子量蛋白。
a)配制CAPS电印迹缓冲液。
方法如下：10×CAPS（100mmol/L）CAPS 22.13g加去离子水至900ml用2mol/L NaOH （约20ml）将pH值调至11.0，然后定容至1L，贮存于4ºC。
b) CAPS电印迹缓冲液（含10％甲醇的1×CAPS）10×CAPS 200ml甲醇200ml去离子水1600mlc)CAPS电印迹缓冲液中的甲醇浓度范围是0-20％，一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白的转移效果好，而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移。
d)取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。
（注：以后的操作须防止PVDF 膜干涸。
如果膜变干，须重复本步骤的操作。
e)取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。
（注：转移某些强碱性蛋白pI>9.0时，可省略本步骤。
）f)将用于电印迹实验的滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中，在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。