河南烟草镰刀菌的分子鉴定及致病性分析
豫南烟区烟草青枯病菌拮抗内生细菌的筛选及其防病效果初探
豫南烟区烟草青枯病菌拮抗内生细菌的筛选及其防病效果初探李小杰;李成军;胡亚静;李淑君;邱睿;白静科;陈玉国【摘要】为了获得烟草青枯病菌的稳定拮抗内生细菌菌株,从豫南烟区烟草栽培品种中烟100和云烟87的根茎中共分离到208株细菌,利用平板共培养法筛选出9株对烟草青枯病菌具有拮抗效果的菌株.其中菌株Rsa3对烟草青枯病菌的抑菌效果最好,抑菌圈半径达7 mm,且在转移5～6代后仍具有较强的抑制效果.依据16S rDNA序列,将拮抗菌Rsa3鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens).该细菌发酵液对烟草青枯病菌有明显的抑制作用,其作用主要在于菌体本身,在温室盆栽试验中发酵液的防病效果可达79.17％,同时具有促进烟苗根系生长的能力.以上结果表明,拮抗菌Rsa3对烟草青枯病具有较好的抑菌和防病作用,同时对烟苗的根系有明显的促生长效果,具有潜在的应用价值.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2018(047)005【总页数】6页(P57-61,68)【关键词】豫南烟区;烟草青枯病菌;拮抗内生细菌;筛选;抑菌效果【作者】李小杰;李成军;胡亚静;李淑君;邱睿;白静科;陈玉国【作者单位】河南省农业科学院烟草研究所烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南许昌461000;河南省农业科学院烟草研究所烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南许昌461000;河南省农业科学院烟草研究所烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南许昌461000;河南省农业科学院烟草研究所烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南许昌461000;河南省农业科学院烟草研究所烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南许昌461000;河南省农业科学院烟草研究所烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南许昌461000;河南省农业科学院烟草研究所烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南许昌461000【正文语种】中文【中图分类】S435.72;S476烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的危害世界烟草生产的重要根茎部细菌性病害，在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，造成了巨大损失[1-2]。
烟草DUF538基因家族鉴定及根结线虫胁迫下表达分析
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄［２０］ＷａｎｇＢ，ＹｕａｎＪ，ＬｉｕＪ，ｅｔａｌ．Ｃｏｄｏｎｕｓａｇｅｂｉａｓａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｆｏｒｃｅｓｉｎｇｒｅｅｎｐｌａｎｔｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２０１１，５３（４）：３２４－３３４．［２１］ＳｏｎｇＹＦ，ＹａｎｇＱＨ，ＹｉＸＧ，ｅｔａｌ．ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｏｄｏｎｕｓａｇｅｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｇｅｎｏｍｅｓｏｆｃｈｅｒｒｉｅｓ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｓｔｓ，２０２２，１３（１１）：１８９１．［２２］ＭｏｒｔｏｎＢＲ，ＷｒｉｇｈｔＳＩ．ＳｅｌｅｃｔｉｖｅｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓｏｎＣｏｄｏｎｕｓａｇｅｏｆｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｅｓｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００７，２４（１）：１２２－１２９．［２３］ＬｉｕＱＰ，ＸｕｅＱＺ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｉｅｓｏｎｃｏｄｏｎｕｓａｇｅｐａｔｔｅｒｎｏｆｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓａｎｄｔｈｅｉｒｈｏｓｔｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｅｓｉｎｆｏｕｒｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，８４（１）：５５－６２．［２４］陆奇丰，黄至欢，骆文华．番茄ＷＲＫＹ转录因子密码子偏性分析［Ｊ］．分子植物育种，２０２０，１８（１８）：５９０８－５９１６．［２５］段淋渊，戴国礼，焦恩宁，等．枸杞自交不亲和基因Ｓ－ＲＮａｓｅ密码子偏性分析［Ｊ］．西南林业大学学报（自然科学），２０２０，４０（２）：４４－５２．［２６］赵 森，邓力华，陈 芬．秋茄叶绿体基因组密码子使用偏好性分析［Ｊ］．森林与环境学报，２０２０，４０（５）：５３４－５４１．［２７］叶 琦，宋炎峰，李 蒙，等．迎春樱桃叶绿体基因组特征及其密码子使用偏好性分析［Ｊ］．分子植物育种，２０２２，２０（１４）：４５７６－４５８５．［２８］胡晓艳，许艳秋，韩有志，等．酸枣叶绿体基因组密码子使用偏性分析［Ｊ］．森林与环境学报，２０１９，３９（６）：６２１－６２８．［２９］喻 凤，韩 明．紫花苜蓿叶绿体基因组密码子偏好性分析［Ｊ］．广西植物，２０２１，４１（１２）：２０６９－２０７６．［３０］唐玉娟，赵 英，黄国弟，等．芒果叶绿体基因组密码子使用偏好性分析［Ｊ］．热带作物学报，２０２１，４２（８）：２１４３－２１５０．［３１］杨祥燕，蔡元保，谭秦亮，等．菠萝叶绿体基因组密码子偏好性分析［Ｊ］．热带作物学报，２０２２，４３（３）：４３９－４４６．［３２］耿晓姗，贾 魏，陈佳宁，等．金花茶叶绿体基因组密码子偏好性分析［Ｊ］．分子植物育种，２０２２，２０（７）：２１９６－２２０３．张路阳，张有建，饶聪颖，等．烟草ＤＵＦ５３８基因家族鉴定及根结线虫胁迫下表达分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（２０）：３４－４２．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．２０．００６烟草ＤＵＦ５３８基因家族鉴定及根结线虫胁迫下表达分析张路阳１，张有建２，饶聪颖２，许燕彪２，谢 可２，李 伟２，郑 聪２（１．河南农业大学烟草学院，河南郑州４５０００２；２．福建省南平市烟草公司，福建南平３５３０００） 摘要：ＤＵＦ５３８基因是没有功能注释的蛋白，在根结线虫胁迫的响应过程中，含有ＤＵＦ５３８结构域的蛋白质的基因表达发生变化。
河南省烟草赤星病病原鉴定
河南省烟草赤星病病原鉴定祖艳青;蒋士君;王海涛;孙淑君;张猛【摘要】为明确河南省烟草赤星病病原菌的种类，从河南省不同烟区采集烟草赤星病典型病斑，分离病原菌并且做致病性测定，对确定为病原菌的菌种按国际标准方法进一步做形态和分子鉴定。
结果显示分离到的85株菌株中60株被证明是烟草赤星病病原菌，从形态学上鉴定为三个种，分别是链格孢Alternaria alternata、长柄链格孢Alternaria longipes和鸭梨链格孢Alternaria yaliinifciens。
其中鸭梨链格孢Alternaria yaliinifciens引起烟草赤星病属首次报道。
三个种的代表菌株的5.8S rDNA ITS基因序列间及已报道的链格孢Alternaria alternata，长柄链格孢Alternaria longipes和鸭梨链格孢Alternaria yaliinifciens的5.8S rDNA ITS区均没有较大差异，证明该基因在链格孢小孢子种间较保守，不适合区分这些链格孢种。
%Typical disease spot specimens were collected from different areas and pathogen isolation and pathogenicity tests were carried out to determine tobacco brown spot pathogen species in Henan province. Results showed that 60 out of 85 strains isolated from disease spot were confirmed to be pathogens of tobacco brown spot by Koch's postulation. They were identified as three species of Alternaria by morphology characteristics using standard methods, i.e. Alter naria alternata, Alternaria longipes and Alternaria yaliinifciens. This is the first report of A. yaliinficiens causing tobacco brown spot. The 5.8S rDNA-ITS gene sequences of representative strains of the three species and other strainsof Alternaria alternata, Alternaria longipes and Alternaria yaliinifciens showno clear difference, which proved that the gene is not suitable for distinguishing these small-spore Alternaria species.【期刊名称】《中国烟草学报》【年(卷),期】2013(000)004【总页数】5页(P73-77)【关键词】烟草赤星病;链格孢;5.8S rDNA-ITS区【作者】祖艳青;蒋士君;王海涛;孙淑君;张猛【作者单位】河南农业大学植物保护学院，郑州 450002;河南农业大学植物保护学院，郑州 450002;河南省农业科学院烟草研究所，许昌 461000;河南农业大学植物保护学院，郑州 450002;河南农业大学植物保护学院，郑州 450002【正文语种】中文【中图分类】S432.1烟草赤星病(tobacco brown spot)是烟草生长后期主要的叶部病害，在世界各烟草产区均有发生 [1]。
《黄瓜根部致病镰刀菌(Fusarium)的病原鉴定及检测技术》
《黄瓜根部致病镰刀菌（Fusarium）的病原鉴定及检测技术》一、引言黄瓜作为我国重要的蔬菜作物之一，其产量的稳定与品质的优劣直接关系到人们的饮食健康。
然而，黄瓜根部病害一直是影响其生长和产量的重要因素之一。
其中，由镰刀菌（Fusarium）引起的根部病害尤为常见，严重威胁着黄瓜的生产。
因此，对黄瓜根部致病镰刀菌的病原鉴定及检测技术的深入研究，对于预防和控制黄瓜根部病害具有重要意义。
二、病原鉴定1. 形态学鉴定镰刀菌的形态特征是鉴定其种类的重要依据。
通过观察菌丝、分生孢子等形态特征，可以初步判断致病镰刀菌的种类。
在显微镜下，镰刀菌的菌丝细长，具有分隔，分生孢子呈镰刀状或弯曲状。
2. 分子生物学鉴定分子生物学鉴定是当前病原鉴定的重要手段。
通过提取镰刀菌的DNA，利用PCR等技术进行扩增和测序，可以获得镰刀菌的基因序列信息，从而进一步确定其种类。
此外，利用特异性引物进行PCR扩增，可以快速、准确地鉴定出致病镰刀菌。
3. 生理生化鉴定生理生化鉴定是通过测定镰刀菌的生理生化特性，如酶活性、代谢产物等，来判断其种类和致病性。
这种方法需要借助专业的仪器设备和复杂的操作流程，但具有较高的准确性和可靠性。
三、检测技术1. 传统检测技术传统检测技术主要包括形态学观察和培养法。
通过观察病组织上的菌丝和分生孢子的形态特征，结合培养法测定病原菌的生长情况，可以初步判断黄瓜是否感染了镰刀菌。
然而，这种方法耗时较长，且易受环境因素影响，准确性有待提高。
2. 分子生物学检测技术分子生物学检测技术是当前主要的检测手段。
通过提取病组织中的DNA或RNA，利用PCR、实时荧光定量PCR等技术进行扩增和检测，可以快速、准确地判断黄瓜是否感染了镰刀菌。
此外，利用基因芯片、测序等技术，还可以对病原菌进行基因型分析，为病害的防控提供更多信息。
3. 免疫学检测技术免疫学检测技术是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应来检测病原菌。
通过制备针对镰刀菌的特异性抗体，利用免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）等，可以快速、准确地检测出病组织中的镰刀菌。
3种拮抗烟草疫霉及产IAA内生细菌的分离鉴定
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河南省花生青枯病菌的分子鉴定及其生物学特性研究
河南农业科学，2024，53（4）：102⁃110Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2024.04.011河南省花生青枯病菌的分子鉴定及其生物学特性研究桑素玲，王振宇，李绍建，范腕腕，高蒙，崔小伟，张海燕，冯兰兰（河南省农业科学院植物保护研究所/农业农村部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室/河南省农作物病虫害防治重点实验室/河南省油料作物遗传改良重点实验室，河南郑州450002）摘要：为了明确河南省花生青枯病的病原菌分类属性，对采自河南省内不同市的30个青枯病菌株在16S rDNA 序列、碳水化合物利用、致病性、演化型及序列变种等方面进行了鉴定。
30个青枯病菌株的16S rDNA 测序结果表明，引起河南花生青枯病的病原为茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum ）；所有青枯病菌株可侵染茄子、辣椒、马铃薯、烟草和番茄，但不侵染姜，属于生理小种1号；根据能否利用3种双糖和3种己醇的能力，可将其中4个菌株归于生化型Ⅱ，10个菌株归于生化型Ⅲ，16个菌株归于生化型V ；所有青枯病菌株均能用多重PCR 扩增得到144bp 演化型Ⅰ特异条带和280bp 茄科雷尔氏菌特异条带，表明青枯病原菌均属于茄科雷尔氏菌演化型Ⅰ，即亚洲组13；利用egl 基因的系统发育进化分析表明，来自河南的30个菌株与Gx525、Ah-XnJn-12-6、HA 2-1聚为一支，属于序列变种14。
关键词：花生；青枯病；茄科雷尔氏菌；生理小种；生化型；演化型；序列变种中图分类号：S435.652文献标志码：A文章编号：1004-3268（2024）04-0102-09收稿日期：2023-07-05基金项目：河南省农业科学院基础科研项目（2023ZC46）作者简介：桑素玲（1983-），女，河南周口人，助理研究员，博士，主要从事花生细菌病害研究。
标准烟草黑胫病的分子生物学鉴定方法
标准烟草黑胫病的分子生物学鉴定方法我折腾了好久标准烟草黑胫病的分子生物学鉴定方法，总算找到点门道。
一开始的时候我真的是瞎摸索啊，就知道可能要从烟草植株的样本开始下手。
我先是按照普通的植物病害检测的思路，取了感染很明显的烟草叶片。
我当时就想，这就像去市场挑水果一样，肯定得挑那些病得最明显的部位去检测，这样才容易检测出来嘛。
我尝试用传统的PCR（聚合酶链式反应）方法，这PCR就像是一个复印机，可以把我们想要检测的那种和烟草黑胫病有关的基因片段大量复制出来，这样我们就能看到这些基因是不是存在于这个烟草样本里。
但是我在最开始的时候，老是失败。
我觉得可能是模板的浓度没弄好，就像做蛋糕的时候面粉放多放少都会影响蛋糕的成型一样，模板浓度不对就没法很好地进行PCR反应。
后来我就仔细调整模板浓度，试了好多次不同的浓度范围，终于找到一个比较合适的范围。
我在做样品预处理的时候也犯过错。
我忘记对样本进行充分的研磨，这就导致细胞内的物质不能很好地释放出来，那后面的一系列反应肯定就不准确了。
这就像是你想开一个盒子拿里面的东西出来，结果只开了条小缝，东西卡在里面出不来一样。
所以后来我就狠狠心，把样本研磨得特别细，就像把沙子都磨成粉末的那种感觉。
再说说引物设计这块，我可是花了大力气去研究。
引物就像是一把钥匙，要刚刚好能打开我们想要检测的那个基因的“锁”。
我找了好多之前已发表的关于烟草黑胫病的文献，看他们用的引物序列。
但那些序列有时候也并不一定完全好用，我就根据自己的理解和得到的基因序列数据，做了一些微调。
结果有的时候改得不好就失败了，后来我才明白，这引物可不能乱动，改动之前一定要谨慎再谨慎。
只要能找到精准匹配的引物，那么这个PCR反应就像火箭找到了正确的发射轨道一样顺利。
对于分子生物学鉴定来说，电泳分析也是很重要的一步。
这就好比是一场比赛完了之后的排名，让你清清楚楚看到不同大小的DNA片段跑的位置。
通过电泳我就能直观地看到我扩增出来的DNA片段大小是不是和我预期的相符，如果相符，而且条带很清晰，那就很有可能是烟草黑胫病相关的基因片段了，但是如果是模模糊糊的或者根本没有条带，那肯定就是之前哪个环节又出问题了。
洛阳市烟草黑胫病与根腐病概述
植物保护学现代农业科技2017年第5期烟草病害一直是阻碍烟草生产的重要因素,种类复杂,危害严重。
我国已经鉴定出的烟草侵染性病害有60多种[1],其中真菌病害29种,细菌病害8种,病毒病病害16种,线虫病害2种,危害最为严重的有病毒病、黑胫病、青枯病、赤星病、野火病、角斑病、根结线虫病、白粉病等,在苗期危害的有炭疽病、猝倒病和立枯病等,往往造成苗床期烟苗的大批死亡。
据报道,洛阳地区根茎类病害有黑胫病、猝倒病、白绢病、灰霉病、赤星病、炭疽病等,而大田期危害最严重的是黑胫病,可导致烟株大面积死亡,造成直接经济损失。
近年来,镰刀菌根腐病的发生也越来越严重,已成为烟区防治的主要病害之一。
本文主要阐述了危害严重的黑胫病和根腐病的症状、病原菌和防治方法。
1烟草黑胫病黑胫病最早于1896年在印度尼西亚的爪哇发现,该病流行迅速,目前已遍布全世界,特别在温带、亚热带和热带发生较严重[2-3]。
该病发展蔓延很快,大田期1~2周内可毁灭整个烟田,造成绝收[4],是烤烟、白肋烟、晾烟、晒烟、香料烟等所有栽培烟草的毁灭性根茎病害。
据全国烟草有害生物调查,我国除黑龙江省未发现该病外,其他各个产烟省(市)均有不同程度的发生。
1.1症状黑胫病在整个生育期均可发生,天气潮湿温和的时期,在苗床上会出现典型的猝倒症状。
接近土壤的茎部变为深褐色或黑色,病原菌迅速沿茎部向上生长扩展到叶部。
大田发生时,地面以上首先出现的症状是在中午时叶片萎蔫,植株在夜间恢复正常,而在第2天会萎蔫得更加严重,通常来说,所有的叶片都会萎蔫,最终导致全株枯萎,俗称“穿大褂”。
这与维管束萎蔫病原菌所造成的单侧萎蔫症状有所不同。
随着病害发展,叶片开始变黄并悬垂在茎杆上,病原菌侵入茎的内部并进入根系。
侧根和由茎部发出来的不定根会变黑甚至腐烂,而当纵剖病株的茎部时,可见髓部颜色变为棕色至黑褐色,后期常常变干并分离呈碟片状,碟片间有白色霉层[5],但不能仅凭“碟片”这一症状来判断黑胫病。
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河南烟草镰刀菌的分子鉴定及致病性分析邱睿;白静科;李成军;李淑君;李小杰;陈玉国;胡亚静;刘东升【摘要】为明确河南省不同烟叶产区危害烟草的镰刀菌种类,以河南省烟叶产区典型镰刀菌根腐病烟株及烟田土壤为供试样品,采用组织分离法和土壤分离法获得纯化菌株 ,根据菌株形态和rDNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定 ,并采用无创接种法测定病原菌对烟草的致病性.结果表明 ,获得的98个菌株在PDA培养基上均产生白色菌丝,大型分生孢子呈镰刀形或马特形,无色、多孢;小型分生孢子呈肾形、椭圆形或卵形,无色、多无分隔.序列比对结果显示,所分离的98株菌分属尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)和Fusarium nematophilum.致病性分析结果表明,尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌对烟苗具有致病性;48株致病菌中豫南烟区烟草镰刀菌根腐病致病性病原菌为尖孢镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌,以尖孢镰刀菌为主;豫中为尖孢镰刀菌;豫东、豫西为茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌.因此,尖孢镰刀菌为全省烟区重点防控对象,豫南烟区还需加强层出镰刀菌和木贼镰刀菌的防控,豫东、豫西需防范茄病镰刀菌的发生.%To identify Fusarium species in different tobacco producing areas of Henan province,tobacco plants with typical symptoms of fusarium root rot and fi eld soil were sampled to isolate pathogens by tissue separation method and soil separation method. Pure strains were identified by morphological characteristics and rDNA-ITS sequence analysis, and their pathogenicities were determined by non-invasive inoculation method. Morphological observation showed that on PDA medium, all of the 98 purifi ed stains produced white hyphae, macroconidium was sickle or matt in shape,colorless and multi-cell; microconidium was reniform, ovoid or oval in shape, colorless and most of them were single-cell. Sequence alignment indicated that the 98 isolated strains were Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium proliferatum,Fusarium equiseti and Fusarium nematophilum.Pathogenicity analysis showed that 48 strains were pathogenic to tobacco seedlings,which wereF.oxysporum,F.solani,F.proliferatum and F.equiseti.In Southern Henan,the pathogen of fusarium root rot were F.oxysporum,F.proliferatum andF.equiseti,with F.oxysporum the predominant pathogen.F.oxysporum was the pathogenic fungi in Centrol Henan,and F.solani and F.oxysporum were the pathogenic stains in Eastern and WesternHenan.Therefore,F.oxysporum was the key prevention and control objects in all tobacco planting area of Hennan province,and control ofF.proliferatum and F.proliferatum need to be strengthened in Southern Henan,and strict precautions measure be taken against the occurrence of F.solani.in Eastern and Western Henan.【期刊名称】《中国烟草学报》【年(卷),期】2018(024)002【总页数】6页(P129-134)【关键词】河南省;烟草;镰刀菌;分子鉴定;致病性【作者】邱睿;白静科;李成军;李淑君;李小杰;陈玉国;胡亚静;刘东升【作者单位】河南省农业科学院烟草研究所,烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南省许昌市永昌大道与青梅路交叉口 461000;河南省农业科学院烟草研究所,烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南省许昌市永昌大道与青梅路交叉口 461000;河南省农业科学院烟草研究所,烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南省许昌市永昌大道与青梅路交叉口 461000;河南省农业科学院烟草研究所,烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南省许昌市永昌大道与青梅路交叉口 461000;河南省农业科学院烟草研究所,烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南省许昌市永昌大道与青梅路交叉口 461000;河南省农业科学院烟草研究所,烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南省许昌市永昌大道与青梅路交叉口 461000;河南省农业科学院烟草研究所,烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南省许昌市永昌大道与青梅路交叉口 461000;河南省农业科学院烟草研究所,烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南省许昌市永昌大道与青梅路交叉口 461000【正文语种】中文镰刀菌（Fusarium spp.）是一类世界性分布的真菌，可以侵染多种植物，引起植物的根腐、茎腐、花腐和穗腐等多种病害。
镰刀菌侵染烟草引起的枯萎病和根腐病是世界性的土传真菌病害，在美国、韩国、加拿大、澳大利亚、南非、日本等产烟国普遍发生[1-3]。
近两年镰刀菌根腐病在我国烟区的发病范围和发病程度呈上升趋势，目前在云南、河南、湖南、山东、贵州、福建、湖北、安徽等地均有发生[4-11]，重病烟田发病率达30%以上[4]。
目前，国内外学者在镰刀菌的分类地位与寄主范围、形态学与分子特征、致病机理等方面均有报道[12-16]。
河南省烟草镰刀菌根腐病已有报道[4]，但有关不同生态区域镰刀菌类型、主要致病菌种类鉴定、菌株致病力的差异及病原菌侵染烟草引起病害的发生、流行规律等均缺乏系统性研究。
而明确病原菌的种类及其致病力是指导烟草镰刀菌根腐病防治的基础。
rDNA-ITS序列分析可有效弥补传统形态学鉴定的局限性，目前主要依据结合培养条件的形态学鉴定和真菌18S rDNA的ITS区序列分析解决病原镰刀菌菌种的分类地位[17-18]。
因此，本试验选择河南省烟区为切入点，在河南省各大烟区烟草根际土壤中及发病烟株上分离纯化疑似烟草镰刀菌菌株，并对其进行形态鉴定、致病性测定与rDNA-ITS序列测定及分析，旨在明确该病在河南烟区的基本分布及各烟区主要致病菌种类，为今后各烟区防治该病提供科学依据。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 样品来源2016—2017年，选择河南省豫南、豫东、豫中和豫西4个生态区的12个烟叶产区，每个烟叶产区选择不同区域、不同田块类型的烤烟烟田，在烟草团棵期、旺长期和成熟期分别进行系统调查和普查，每个烟叶产区选择不同生长期根茎类病害发病较重的9块烟田，取具有典型症状的病株5～10株，截取茎基部与发病根系，同时在每块烟田按5点取样法采取土样（见表1），由河南省农业科学院烟草研究所植物保护研究室进行相关病原菌的分离与鉴定。
表1 采集样品信息Tab.1 Sample information采集地点样品类型数量土壤 27份病株 63株豫西土壤 27份病株 51株豫中豫南土壤 27份病株 71株豫东土壤27份病株 37株1.1.2 试剂和仪器Taq PCR MasterMix(Cat# KT201-02)购于TIANGEN公司，通用引物ITS1和ITS4由上海生工生物工程技术服务有限公司提供，BIO-RAD PCR仪(美国BIO-RAD公司)，Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。
1.2 试验方法1.2.1 病原菌的分离（1）组织分离法。
参照文献[19]的方法对病原菌进行分离。
在样品病健交界处切取适当大小的组织块，用75%酒精消毒30 s，15%次氯酸钠消毒2 min，再用无菌水清洗3次。
无菌吸水纸吸干组织块表面水分后直接接种于含25%乳酸的PDA 培养基平板上，25℃恒温培养3～7 d，待组织块周围长出菌落后，挑取边缘菌落进行纯化[11]。
依据纯化后的菌落特征分类编号，保存备用。
（2）土壤分离法。
参照文献[20]的方法对烟田土壤真菌进行分离。
称取混合均匀的土壤1.0 g，放入带有玻璃珠的100 mL三角瓶中，加99 mL无菌水，置摇床震荡10 min使土样均匀分散在稀释液中成为10-2土壤悬浮液，将土壤悬浮液继续稀释成10-3稀释液后涂布于含25%乳酸的PDA培养基平板上，25℃恒温培养3 d，挑取具有镰刀菌特征的菌落进行纯化[11]。
依据纯化后的菌落特征分类编号，保存备用。
1.2.2 病原菌的形态学观察在PDA培养基平板上培养3～4 d的菌株，用打孔器打成直径约4 mm的菌饼，接种于PDA平板中央，25℃恒温培养,观察菌落颜色及形态变化。
挑取培养菌丝制作临时水玻片，在光学显微镜下观察菌丝、孢子、产孢细胞、子实体的形态特征，依据Booth分类系统对镰刀菌进行分类鉴定[21]。