密度梯度离心法取单个核细胞具体方法
单核细胞处理过程
单核细胞处理过程以下将详细介绍单核细胞的处理过程，主要包括细胞分离、纯化和保存等步骤。
1. 细胞分离：单核细胞通常从外周血、骨髓或者组织中获得。
对于外周血单核细胞的分离，常用的方法有密度梯度离心和磁珠分离。
密度梯度离心是通过在离心过程中离心介质的密度差异，将单核细胞分离出来。
常用的离心介质如Ficoll-Hypaque。
磁珠分离是通过将针对单核细胞特异性抗体（如CD14抗体）结合在磁珠上，然后将其与细胞混合，利用磁力将单核细胞与其他细胞分开。
2.细胞纯化：分离得到的单核细胞通常含有其他细胞类型的污染物，如红细胞、淋巴细胞和血小板。
为了提高单核细胞的纯度，可以使用巨噬细胞亲和柱或负选择方法进一步纯化。
巨噬细胞亲和柱是一种利用巨噬细胞表面表达的特定受体与抗体结合的纯化方法。
常用的巨噬细胞亲和柱有CD14柱，可以高效地将单核细胞纯化。
负选择方法则通过使用针对非单核细胞特异性抗体和磁珠结合，将非单核细胞选择性地去除。
3.细胞保存：为了进行后续的实验操作或长期保存，单核细胞需要被储存。
常用的保存方法有冷冻和低温保存。
冷冻保存是将单核细胞在冷冻液中快速冷冻并保存在液氮或者低温冰箱中。
常用的冷冻液为含有10%二甲基亚砜（DMSO）和90%胎牛血清的培养基。
低温保存是将单核细胞在低温液态氮中保存，可以避免冷冻和解冻过程对细胞的损伤。
4.细胞培养：单核细胞可以通过培养来进一步研究其生物学特性和功能。
常用的培养基为RPMI1640，其中添加胎牛血清、抗生素和细胞增殖剂等。
为了促进巨噬细胞的分化，还可以添加刺激因子，如大肠杆菌脂多糖（LPS）。
培养过程中，需要定期更换培养基并观察细胞的生长情况。
5.细胞实验：处理得到的单核细胞可以用于各种实验，如流式细胞术、酶联免疫吸附实验（ELISA）和功能实验等。
例如，流式细胞术可以用于检测单核细胞表面分子的表达水平，从而研究其分化和激活状态。
ELISA可以用于检测细胞培养上清液中的细胞因子水平。
密度梯度离心法分离细胞器顺序
密度梯度离心法分离细胞器顺序
密度梯度离心法分离细胞器有多种不同方法和顺序，以下是其中两种常见的方法：
1.Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。
其分布由上到下依次为：稀释的血浆层和血小板层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。
2.Percoll分层液法：是连续密度梯度离心分离法，由上到下依次为：死细胞层和血小板层、血浆层、富含单核细胞组分层、富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。
Percoll分层液法是纯化分离单核细胞和淋巴细胞的一种较好方法。
外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞的分离
概述
外周血单个核细胞是一种白细胞。
通过分离单个核细胞，可以进行多种分子生物学实验和临床应用。
本文将介绍两种分离外周血单个核细胞的方法。
方法
密度梯度离心
1.将外周血收集到 EDTA 管中。
2.将 3 毫升 Ficoll-Paque™ PLUS 加入到 15 毫升离心管中。
3.轻轻加入同等体积的外周血到离心管，保持液面平整。
4.以 400g 的速度离心 40 分钟。
在离心温度达到室温前离心室门不得
打开。
5.用温和的力度将上清液吸出到新的离心管中，并在 1200g 的速度下
洗涤 2-3 次。
6.已经分离的单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。
此过程中加入生长
培养基以维持细胞质稳定。
磁性负选择法
1.将外周血收集到 EDTA 管中。
2.加入红细胞淋巴细胞分离液，根据厂家指南染色。
3.加入磁性微珠混合液，使单个核细胞与微珠组合。
4.放入磁场中过滤掉未与微珠组合的细胞及其他血细胞。
5.经过多次洗涤和离心，单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。
此过程
中加入生长培养基以维持细胞质稳定。
密度梯度离心法和磁性负选择法是分离外周血单个核细胞的两种有效方法。
这些方法对于多种分子生物学实验和临床应用都非常有用。
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
密度梯度离心法分离血液单个核细胞
密度梯度离心法分离血液单个核细胞14级拔尖赵子杰 141270054一．实验目的1.掌握密度梯度离心法。
2.进一步熟练显微镜的细胞观察方法。
二．实验原理1.血液单个核细胞分离原理外周血细胞由密度不同的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板等组成。
对人血液来讲，其中红细胞密度最大，为1.09~1.11g/L；粒细胞密度次之，为1.080~1.092g/L；单核细胞、淋巴细胞及NK细胞密度相近，为1.050~1.077g/L；血小板密度最小，只有1.030~1.060g/L；将其中的单核细胞、淋巴细胞、NK细胞等统称为外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）。
图1：血细胞分类当将稀释的抗凝血叠加于适宜密度（与单个核细胞密度相近）的淋巴细胞分离液之上，经适当的离心力离心一段时间后，不同种类细胞因密度而分布于离心管的不同位置，红细胞和粒细胞密度大于分层液，沉积于管底；血小板则因密度小而悬浮在血浆中；其中与分层液密度相当的单个核细胞分布在血浆层和分层液之间的界面。
图2：分离液分离原理2.显微镜操作技巧（1）旋转物镜转换器到10×物镜，先将粗调焦螺旋外旋，使标本升至最高点。
（2）一边用眼睛通过目镜观测标本，一边逐渐向内旋转粗调焦螺旋，直至视野中出现晃动的液体，观测细胞即在其中。
（3）如视野中细胞太小，转换物镜至40×高倍镜，一般稍微向外旋转微调焦螺旋即可看到清晰的物像。
三．实验器材1.肝素抗凝鸡血：先给注射器中吸入0.1mL 180IU／mL肝素钠溶液，鸡翅下静脉采血5mL。
2.10mL低速离心机。
3.托盘天平。
4.10mL离心管。
5.胶头滴管。
6.40mL小烧杯等。
四．实验试剂1.肝素钠溶液：用生理盐水配成180IU/mL。
2.D-Hanks液。
3.人淋巴细胞分离液：市售。
20℃时密度应为（1.077±0.001）g/L。
Percoll密度梯度离心法分离中枢神经系统组织中的单个核细胞
Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心法分离中枢神经系统 组织中的单个核细胞
吕 翠，冯金红，侯召华ຫໍສະໝຸດ 魏云波，韩婷婷（齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，环境与健康免疫研究室，山东 济南 ２５００１４）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１８．０７．０２６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１８）０７－１０３０－０７ 中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ３２２８１；Ｒ３２９２４；Ｒ３３１１２５；Ｒ７４４３； Ｒ７４５７ 摘要：目的 建立快速分离小鼠中枢神经系统（ＣＮＳ）组织中 单个核细胞的方法。方法 以正常 Ｃ５７ＢＬ／６小鼠、实验性 变态反应性脑脊髓炎（ＥＡＥ）和阿尔茨海默病（ＡＤ）模型小鼠 为研究对象，通过 ７０％ ～３０％ Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心法，获取 小鼠脑组织和脊髓中单个核细胞，利用台盼蓝染色检测细胞 存活率后，通过流式细胞术进一步分析细胞的表型特点。结 果 分离得到的单个核细胞存活率在 ９０％以上；流式细胞 术分析结果表明，ＥＡＥ和 ＡＤ小鼠中浸润到 ＣＮＳ的淋巴细胞 群比例明显升高，且介导炎症反应的 Ｔｈ１和 Ｔｈ１７细胞亚群 比例明显升高，而具有免疫调节作用的 Ｔｒｅｇ细胞亚群比例 明显下降。结论 采用 ７０％ ～３０％ Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心法 从小鼠 ＣＮＳ中分离的单个核细胞存活率高，细胞活性不受 分离过程的影响，可进一步利用流式细胞术分析细胞的表型 特征。此方法操作简单快速，适用于对 ＣＮＳ淋巴细胞等单 个核细胞的分析。
量［４］，但由于受到染色方法和检测手段的限制，这种方法不 能同时分析淋巴细胞的多个指标，具有很大的局限性。 流式细胞术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）是一种先进的细胞定 量分析技术，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从 １个 细胞中测得多个参数，与传统的荧光显微镜检查相比，具有 参数多、速度快、精度高、准确性好等优点。因此，利用 ＦＣＭ 分析 ＣＮＳ中的淋巴细胞无疑是当前较全面、高效的方法。 近两年，在国内的研究中，这种方法开始被研究者采用，但在 处理组织样本的过程中，多数采用简单的机械研磨或酶消化 的方法来获得单个细胞［５－６］，而由于 ＣＮＳ中细胞种类繁多， 且淋巴细胞所占比例又较低，使得这两种方法获得的细胞纯 度、活性和产量均较低，不利于进行流式细胞分析。因此，本 研究在参照国外相关文献的基础上［７－８］，利用正常 Ｃ５７ＢＬ／６ 小鼠、实验性 变 态 反 应 性 脑 脊 髓 炎 （ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｌｌｅｒｇｉｃｅｎ ｃｅｐｈａｌａｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）和 阿 尔 茨 海 默 病 （Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓ ｅａｓｅ，ＡＤ）模型小鼠，通过 Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心法提取了小 鼠脑组织和脊髓中单个核细胞，并利用 ＦＣＭ 进行了细胞表 型的分析。旨在总结和建立一种方便、高效的从脑组织和脊 髓组织中获取单个核细胞的方法，为 ＣＮＳ中单个核细胞（包 括神经元、神经胶质细胞、浸润的淋巴细胞等）功能的研究提 供重要分析手段。 １ 材料与方法 １．１ ＡＤ模 型 小 鼠 ＡＰＰ／ＰＳ１小 鼠，Ｃ５７ＢＬ／６ＪＴｇＮ（ＡＰＰ／ ＰＳ１）品系，合格证号：ＳＣＸＫ（京）２０１４－００１１，♂，２２～２４周， 体质量（３０±２）ｇ，１０只，购于至善（北京）健康医学研究院有 限公司，饲养于山东省科学院分析测试中心动物房。动物饲 养完全遵照山东省分析测试中心实验动物管理委员会条例。 动物房湿度为 ５０％ ～５５％，温度为（２３±２）℃，１２ｈ明暗交 替采光，饲喂无菌普通鼠粮，自由饮水。本研究动物实验通 过山东省分析测试中心医学伦理委员会审查和监督。 １．２ ＭＯＧ３５～５５诱导 Ｃ５７ＢＬ／６小鼠 ＥＡＥ模型 １．２．１ 实验动物 ８～１０周龄♀Ｃ５７ＢＬ／６小鼠，合格证号： ＳＣＸＫ（京）２０１２０００１，体质量（２０±２）ｇ，１０只，购于北京维通 利华实验动物技术有限公司。利用 ＭＯＧ３５～５５多肽（Ｍｉｍ ｏｔｏｐｅｓＰｅｐｔｉｄｅｓ公司）、弗氏完全佐剂（ｃｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ’ｓａｄ ｊｕｖａｎｔ，ＣＦＡ）（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ公司，Ｃａｔ＃７００１）和百日咳毒素（ｐｅｒ ｔｕｓｓｉｓｔｏｘｉｎ，ＰＴ）（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ公 司，Ｃａｔ＃１８０） 诱导 ＥＡＥ模型。 １．２．２ Ｃ５７ＢＬ／６小鼠 ＥＡＥ模型的建立 ＥＡＥ模型的建立 参照已报道的方法［９］。简述如下：ＭＯＧ３５～５５多肽用 ＰＢＳ
密度梯度离心法取单个核细胞具体方法
密度梯度离心法
• 密度梯度离心法又称为区带离心法，可以 密度梯度离心法又称为区带离心法， 同时使样品中几个或全部组分分离， 同时使样品中几个或全部组分分离，具有 良好的分辨率。 良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于 一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中， 一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中， 离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱 中。
实验所需试剂的配置方法
四、血球保存液 葡萄糖 2.05克 枸椽酸钠 0.8克 氯化钠 0.42克 蒸馏水 100毫升 将上述成分混匀，略加温使其溶解，分 装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭 菌。4℃保存备用。
实验所需试剂的配置方法
五、RPMI-1640培养液 RPMT-1640(FLOW公司出品) 1袋 三蒸水 1000毫升 电磁搅拌30分钟：1N HCl调PH7.2～ 7.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验， 4℃保存。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞（PBMC）的实验方法
一、步骤 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混 匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚 的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液， 下层主 要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中 层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单 个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
实验所需试剂的配置方法
PH 7.0 7.2 7.4 19.0 81.0 7.6 13.0 87.0 7.8 8.5 91.0 8.0 5.5 94.5 39.0 28.0 A液 （ml） 61.0 72.0 B液 （ml）
密度梯度离心法分离脐血单个核细胞方法的优化
密度梯度离心法分离脐血单个核细胞方法的优化任思坡;吴秀娟;罗小虎;李全双;韩光宇;谭昆;拾莉;耿跃春【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2012(027)001【摘要】目的对密度梯度离心法分离脐血单个核细胞的方法进行优化,以提高该方法分离脐血单个核细胞的收率.方法脐血40份,每份40 ml,分为常规组和优化组,每组20份.常规组脐血与NS1∶1混合稀释后,直接通过Ficoll分离液分离单个核细胞；优化组通过先将脐血洗涤一次,加入等量NS充分吹打混匀,200目筛网过滤,保持细胞悬液和Ficoll分离液1:1的体积比进行分离操作.对每份分离得到的脐血单个核细胞通过白细胞稀释液稀释后计数.结果常规组分离后的白膜层有11份界面不清晰,同时均混有少量的红细胞.优化组分离后的白膜层有1份界面不清晰,仅有极少的红细胞混入.两种方法收集的脐血单个核细胞数比较,优化组多于常规组(P＜0.01).结论通过对密度梯度离心法的步骤进行优化,可提高脐血单个核细胞的分离效果.【总页数】3页(P101-103)【作者】任思坡;吴秀娟;罗小虎;李全双;韩光宇;谭昆;拾莉;耿跃春【作者单位】徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006;徐州医学院,江苏徐州221002;徐州医学院,江苏徐州221002;徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006;徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006;徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006;徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006;徐州市医学科学研究所,江苏徐州221006【正文语种】中文【中图分类】R446.113【相关文献】1.密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞方法的优化 [J], 郝洪波;任思坡;谢晓东2.密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞方法的优化 [J], 郝洪波;任思坡;谢晓东;3.Ficoll密度梯度离心法分离腹水单个核细胞方法的优化 [J], 杨永强;张巧玲4.密度梯度离心法分离单采浓缩白细胞悬液中单个核细胞方法探讨 [J], 王富英; 廖群艳5.Ficoll密度梯度离心法分离猪外周血单个核细胞条件的探讨 [J], 张素华;林丹丹;张美娟;陈雪松;徐进梅;单昊;吴观陵;吴海玮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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密度梯度离心法
• 密度梯度离心法又称为区带离心法，可以 同时使样品中几个或全部组分分离，具有 良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于 一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中， 离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱 中。
密度梯度离心法
密度梯度离心原理
• 不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定 离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降， 在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
10％
混合，测比重为1.077～1.078，G５玻璃滤
器过滤除菌。４℃冰箱保存备用。
实验所需试剂的配置方法
三、磷酸缓冲液(PB)
原液: A液: 0.2M NaH２PO４溶液 NaH２PO４ 或NaH２PO４·2H２O 蒸馏水 溶解至 B液：0.2M Ha２HPO４溶液 Ha２HPO４·12H２O 蒸馏水溶解至1000毫升 各种不同PH值PB的配法
实验补充知识
• 本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴 细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80 ％以上，其高低与室温有关，超过25℃时 会影响细胞获得率。
Na２HPO４·12H２O ： 0.12 克
KH２HPO４：0.06克
葡萄糖
1.0克
双蒸水
1000毫克
1％酚红液
2毫克
将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅
15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
实验所需试剂的配置方法
二、细胞分层液配制法
9％聚蔗糖
24份
34％泛影葡胺
A液
28ml
B液
72ml
加蒸馏水 100ml
实验所需试剂的配置方法
四、血球保存液
葡萄糖 2.05克 枸椽酸钠 0.8克 氯化钠 0.42克 蒸馏水 100毫升
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分 装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭 菌。4℃保存备用。
实验所需试剂的配置方法
五、RPMI-1640培养液
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞（PBMC）的实验方法
一、步骤 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混
匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚 的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液， 下层主 要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中 层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单 个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
活细胞百分率＝
活细胞数 总细胞数
×100％
用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达 80～90％，活细胞百分率在95％以上。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
二、试剂和材料 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞
分离液)。 Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋) 10％小牛血清RPMI1640 0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。 肝素用Hank‘s液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝
蔗糖密度梯度离心法
• 采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心 机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上 一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成 层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分， 就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码， 取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与密 度梯度离心法不同的一种沉降速度法，除了以相 同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出 分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度 梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样 原理，也可使用分析超离心机进行测定。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单
个核细胞(PBMC)的实验方法
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。 置入另一短中管中，加入５倍以上体积的 Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟， 洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛 血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞 悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球 计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数
4
×104×2 （稀释倍数）
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞 不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百 分率。
实验补充知识
• 分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳， 因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个 核细胞在1.076～1.090之间。而不同动物血中的单个核细 胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为1.088，马为 1.090。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全 血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液 上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心 管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细 胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串 钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中， 唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层 液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
95毫
1毫
1毫升 1毫升 1毫升 1毫升
实验所需试剂的配置方法
七、完全RPMI-1640培养液 不完全1640培养液 灭活胎牛(或新生牛)血清
90毫升 10毫升
实验补充知识
• 聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液， 其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖 （商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密 度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶 液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低 浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛 影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品 Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分 层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即 可配制成密度合适分层液。
• 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要 小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、 甘油；
• 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由 管口到管底逐步升高的密度梯度。
密度梯度离心可用来分离核酸、蛋 白质、核糖体亚基及其它成分。
密度梯度离心法
• 也称“平衡密度梯度离心法”：用超离心机对小 分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降 平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度 梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶 液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比 溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力 平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种 现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据 其差别进行分析的一种沉降平衡法。
胞数。 • 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的
增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
• 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相 应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
实验所需试剂的配置方法
一、Hank‘s液(无Ca２＋、Mg２＋)配制法
NaCl ： 8.0 克
KCl ： 0.4 克
27.6克 31.2克 1000毫升
71.6克
实验所需试剂的配置方法
PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
A液 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5 （ml） B液 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5 （ml）
举例：0.1M PH7.2 PB
RPMT-1640(FLOW公司出品) 1袋
三蒸水
1000毫升
电磁搅拌30分钟：1N HCl调PH7.2～
7.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验，
4℃保存。
实验所需试剂的配置方法
六、不完全RPMI-1640培养液
RPMI-1640
0.1M丙酮酸钠
0.2M谷氨酰胺 1M Hepes 7.5％ NaHCO３ 青霉素、链霉素(各1万单位)
分离活细胞的介质要求
• 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不 高；
• 2）PH中性或易调为中性； • 3）浓度大时渗透压不大； • 4）对细胞无毒。
密度梯度离心法应用
• 利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或 precoll液分离和纯化人或动物外周血单个核 细胞（PBMC）。
• 目前比较常用ficoll密度梯度法。
人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。 短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。 无菌干燥注射器针头。 血球计数板、显微镜、水平式离心机。 碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
三、注意事项 • 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。 • 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细