Western Blot 详细实验步骤
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Western Blot protocol
1,制样:将获得的细胞用PBS洗涤,300gx4℃x5min,弃去上清。加SDS loading buffer 搅拌转移到1.5ml离心管。放到干浴锅100℃煮10min,放入冰上5min,最后存入-20℃冰箱待用。
2,将样品取出待用,可100℃煮2min,待上样。
3,配胶:浓缩胶5%,分离胶8%,10%或12%(分子大用低浓度,分子小用高浓度Caspase3 35kD,12%浓度(活性形式17kD);DAPK1/p-DAPK1 160KD 18%浓度):ddH2O,30%Acrylamide, 1.0M/1.5MTris-HCL, 10%SDS, 10% AP, TEMED按比例加。
1)夹好板子,用ddH2O捡漏,5min。
2)按照顺序加入试剂配胶配分离胶(50ml管子),混匀。
3)加胶7ml,大致与夹子的门平齐。随后轻轻加3ml乙醇液封页面。静置
30min。
4)将乙醇倒掉,用ddH2O清洗3遍。
5)制备浓缩胶,加入3ml左右只玻璃板界面,插入梳子。
6)静置30min后拔掉梳子。取下玻璃板用ddH2O 冲洗边缘。
7)若不立即使用可用保鲜膜将其包好放在4℃冰箱。(TEMED在灌胶前加入)4,上样:
1)固定好玻片,加入running buffer 没过底板,盖上盖子。
2)浓缩胶75-80V 30min左右,分离胶100V-120V 1h左右。
5,转膜:
1)取出玻璃板,用切胶器轻轻撬动取掉小玻片,切去浓缩胶(将分离胶放入放
入ddH2O水中浸泡5min,重复三次)再放入trans buffer中放置10min。2)剪一块与胶一样大的PVDF膜放在甲醇中浸泡,使其带正电。
3)将PVDF,海绵垫,滤纸放入trans buffer浸泡几分钟。
4)在黑色面板依次放入海绵垫,至少3层滤纸,胶,转移膜,注意不能有气泡,再放滤纸,海绵垫形成夹心结构。(大分子用0.4 um PVDF 膜,小分子用0.25um PVDF膜)。
5)关上夹子将其转入放在冰上的电泳槽,黑对黑,白对红,加trans buffer关上盖子。200mA 1-2h或恒压100V 1-2h(大分子250mA 3小时左右)。
6,免疫反应:
1)取出膜,与胶接触的为正面,正面朝上,放入牛奶或5%TBST牛血清中摇床2h封闭,或放入4℃冰箱过夜。
2)倒掉封闭液,分别剪下有内参蛋白和待测蛋白的膜,分别加内参抗体TBST:抗体=10000:1 5ml左右,待测抗体TBST:抗体=1000:1 5ml左右(最好分开孵育当A蛋白和B蛋白分子量差别5KDa以上(10KDa左右更保险),可将膜分割开(分别标记不同的抗体),这样就不需要stripping膜重新标记,且一次就能得到想要的结果。有人会将两种抗体混在一起标记整张膜,这样操作的前提是非常熟悉这两种抗体的杂带位置,且各自的杂带都不会干扰目的蛋白才可以如此操作;并且这样的抗体下次使用有了局限性,因此不太推荐) 在摇床上孵育1-2h,较难杂的4℃孵育过夜或者更久。
3)回收一抗。用TBST在摇床洗膜4次,每次10-15min左右。(再用TBS洗一次10min)。
4)孵二抗浓度1:1000,1h。
5)用TBST在摇床洗膜4次,每次10-15min左右。(再用TBS洗一次10min)。
7,显影:显影液A和显影液B 1:1 配制,避光现用现配。
(TBST要测PH值7-7.4之间)