碳素墨水鉴定Kupffer细胞
实验三十四增强免疫力功能试验
实验三十四增强免疫力功能试验一、实验目的与要求1 熟悉动物实验的操作技术与要求；2 掌握保健食品增强免疫力功能检验与评价的方法。
二、实验原理1 免疫力是人体免疫系统进行自我保护的一种能力，主要的作用之一是指身体抵抗细菌或病毒等感染的能力。
健全的免疫系统主要有三大功能：（1）防御功能——保护机体不受损害，帮助机体消灭外来的细菌、病毒以及避免发生疾病；（2）稳定清洁功能——不断清除衰老死亡的细胞，保持体内的净化更新；（3）监控功能——及时识别和清除染色体畸变或基因突变的细胞，防止肿瘤和癌变的发生。
2 机体的免疫力功能包括细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面，通过检测动物实验后免疫系统的变化来判断样品是否具有增强免疫力的功能。
三、实验仪器与试剂1 仪器（1） 200目筛网；（2） 24孔培养板；（3） 96孔培养板（平底）；（4）玻片架；（5）微量血凝实验板；（6）血色素吸管；（7）手术器械；（8）打孔器；（9）计时器；（10）二氧化碳培养箱；（11）超净工作台；（12）恒温水浴；（13）离心机；（14）酶标仪；（15） 721型分光光度计；（16）显微镜。
2 试剂（1）生理盐水；（2）丙酮；（3）甲醇；（4）盐酸；（5）异丙醇；（6） DNFB；（7）麻油；（8）硫化钡；（9） Na2CO3；（10） RPMI1640细胞培养液；（11）小牛血清；（12） 2巯基乙醇（2ME）；（13）青霉素；（14）链霉素；（15）刀豆蛋白A（ConA）；（16） Hank s液；（17） PBS缓冲液（pH7.2~7.4）；（18） SA缓冲液；（19）琼脂糖；（20）印度墨汁；（21） SRBC；（22）鸡红细胞；（23） YAC1细胞；（24）补体（豚鼠血清）；（25） MTT；（26） Giemsa染液；（27）乳酸锂或乳酸钠；（28）硝基氯化四氮唑（INT）；（29）吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）；（30） NAD；（31） 0.2mol/L的TrisHCl缓冲液（pH8.2）；（32） 1%NP40或2.5%Triton。
小鼠墨汁吞噬实验报告
一、实验目的1. 观察小鼠腹腔巨噬细胞对墨汁颗粒的吞噬现象。
2. 了解巨噬细胞的吞噬功能及其在免疫反应中的作用。
3. 掌握小鼠腹腔巨噬细胞的采集和制片方法。
二、实验原理吞噬作用是巨噬细胞等免疫细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的较大固体物质的过程。
巨噬细胞在非特异性免疫中起着重要作用，能够识别、结合并吞噬病原体、凋亡细胞及其它异物。
三、实验材料与试剂1. 实验动物：清洁级小鼠（体重20-25g）。
2. 实验材料：墨汁颗粒、生理盐水、载玻片、盖玻片、显微镜、注射器、无菌手术器械等。
3. 实验试剂：台盼蓝染色液、0.1%结晶紫染色液、5%戊二醛固定液、0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）等。
四、实验步骤1. 小鼠腹腔巨噬细胞的采集：- 将小鼠用颈椎脱臼法处死，打开腹腔，取出肝脏。
- 将肝脏剪成小块，放入装有生理盐水的培养皿中，用无菌手术器械轻轻研磨，制成细胞悬液。
- 将细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液，加入适量的生理盐水重悬细胞。
- 用血细胞计数板计数细胞浓度，调整细胞浓度至1×10^6 cells/ml。
2. 墨汁吞噬实验：- 将细胞悬液加入装有盖玻片的载玻片中，滴加适量墨汁颗粒，使其均匀分布在细胞表面。
- 将载玻片放入37℃温箱中孵育30min。
- 取出载玻片，用生理盐水冲洗3次，去除未吞噬的墨汁颗粒。
- 用0.1%结晶紫染色液染色3min，用蒸馏水冲洗，晾干。
- 在显微镜下观察巨噬细胞对墨汁颗粒的吞噬现象。
3. 结果分析：- 观察巨噬细胞对墨汁颗粒的吞噬百分率和吞噬指数。
- 吞噬百分率 = 吞噬墨汁颗粒的巨噬细胞数 / 总巨噬细胞数× 100%- 吞噬指数 = 吞噬的墨汁颗粒总数 / 吞噬墨汁颗粒的巨噬细胞数五、实验结果1. 在显微镜下观察到巨噬细胞对墨汁颗粒的吞噬现象。
2. 吞噬百分率为15.3%，吞噬指数为18.9%。
六、实验分析本实验结果显示，小鼠腹腔巨噬细胞对墨汁颗粒具有较强的吞噬能力。
临床微生物学检验理论课：02细菌鉴定试验-涂片染色
涂片抗酸染色结果观察
镜检时，油镜下仔细查遍整个涂片或至少100个视野； 抗酸性菌呈红色，其它细菌及细胞呈蓝色； TB为细长，着色不均匀，可2个以上的菌形成V、Y、T
等或平行排列等。
涂片抗酸染色结果报告
结果报告，1984年国内统一暂行规定报告方式： 未找到抗酸菌-； 找到抗酸杆菌1或2个，全视野发现1或2个； 找到抗酸杆菌+，全视野发现3-9个； 找到抗酸杆菌++，全视野发现10-99个； 找到抗酸杆菌+++，每视野发现1-9个： 找到抗酸杆菌++++，每视野发现10个以上。
（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验
吲哚（靛基质或蛋白胨水）试验： 阳性：色氨酸酶，分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚，
加入指示剂形成红色界面； 阴性：加入指示剂不变色； 区分普通变形杆菌（+），奇异变形杆菌（-）。
尿素分解试验： 阳性：尿素分解酶分解尿素产生大量的氨，使培养基
呈碱性，加入指示剂为红色； 阴性：加入指示剂不变色。
4、墨汁染色查隐球菌
新生隐球菌广泛分布于自然界，也可存在于人体体表、 口腔及肠道中；
经呼吸道侵入人体，由肺经血行播散时，可侵犯所有脏 器组织，主要侵犯肺、脑及脑膜；
好发于细胞免疫功能低下者，如AIDS、恶性肿瘤、糖尿 病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者；
临床上怀疑脑膜炎时，常抽取脑脊液检查细菌真菌、抗 酸菌、隐球菌。
3、涂片抗酸染色：检查抗酸杆菌
据世界卫生组织估计，全球每年增加结核病人约800万 1000万，死亡病人约300万；
全人类的三分之一即17亿人曾感染过结核杆菌； 结核病人主要见于发展中国家，尤其经济落后地区； 我国是结核病高发国家，广东地区发病率较高。
小细胞肺癌的免疫组化标记
小细胞肺癌的免疫组化标记小细胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）是一种高度侵袭性的肺癌类型，其特征是细胞体积小、核-浆比高、细胞核略大、染色质深染，通常呈现出明显的神经内分泌现象。
免疫组化标记是一种常用的实验技术，用于检测肿瘤细胞中的特定分子标记物，可以辅助诊断和判断肿瘤的类型、预后和治疗方案。
以下是小细胞肺癌常见的免疫组化标记及其相关参考内容。
1. TTF-1（Thyroid transcription factor-1）：TTF-1是一种核转录因子，在正常肺组织中主要在甲状腺和肺泡上皮中表达。
在小细胞肺癌中，TTF-1的表达呈现阳性，可作为小细胞肺癌的诊断标志。
研究发现，TTF-1阳性小细胞肺癌更容易发生胸膜腔转移和淋巴结转移。
参考文献：- Hiroshima K, et al. Expression of thyroid transcription factor-1 in 402 consecutive lung carcinomas: clinicopathological features and molecular phenotypes. Clinic Cancer Res. 2003;9:2118-2124.- Zhang Y, et al. Thyroid transcription factor-1 expression in breast carcinomas. Am J Surg Pathol. 2010;34:1881-1885.2. CD56（Neural cell adhesion molecule，NCAM）：CD56是一种细胞黏附分子，主要在神经元中表达。
在小细胞肺癌中，CD56的表达呈现阳性，可以用于鉴别小细胞肺癌和非小细胞肺癌。
参考文献：- Fujiwara T, et al. Expression of neural cell adhesion molecule L1 protein in small cell lung carcinoma: its implication in cell adhesion and drug resistance. Cancer Res. 1993;53:5269-5273.- Ishiwata T, et al. Neural cell adhesion molecule L1 in small cell lung carcinoma and its involvement in cell motility and invasion. Cancer Res. 1996;56:5902-5910.3. Chromogranin A：Chromogranin A（CGA）是一种神经内分泌肿瘤的标志物，在小细胞肺癌中广泛表达。
原代细胞鉴定免疫荧光检测Keratin、vimentin、Ki67表达
免疫荧光检测Keratin、vimentin、Ki67表达
将P2/P5代处于对数生长期的PICs制备成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/mL，以每孔1 mL
接种于6孔细胞培养板(内置直径为18 mm的圆型培养盖玻片)，置入37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，间隔3 d换液1次。
7 d左右可观察到细胞均匀覆盖于盖玻片上，将载有细胞的盖玻片从孔板中取出，
PBS液冲洗3次，4%多聚甲醛(含0.1 mol/L PBS)固定10 min，PBS液冲洗3次，0.5% Triton X-100处理30 min，PBS液冲洗3次，分别滴加Keratin抗体(1∶50)、vimentin抗体(1∶50)、Ki67抗体(1∶50)，以PBS代替一抗作为阴性对照，一抗过夜，二抗，封片，激光共聚焦显微镜下观察细胞染色情况，
拍照。
Ki67-阳性率越高，表示处于增殖期的细胞比例越高，阳性部位：核内。
(CK)Keratin-肿瘤干细胞的标志物，阳性部位：胞浆，
因上皮细胞表达角蛋白，间质细胞表达波形蛋白，分别以CK19和Vimentin为一抗，（PBS代替一抗作为空白对照），分别鉴定上皮细胞和间质细胞。
(CK+,vimentin-)表示细胞不是间质来源的细胞，如上皮来源的肿瘤细胞。
(CK-,vimentin+)表示细胞为间质来源的细胞，如成纤维细胞，。
大鼠肝星状细胞中多种细胞色素P450亚型的表达
， 提取总 Ｒ Ｎ Ａ 。 ｍ ＬＴ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ １ ． ８ Ｈ Ｓ Ｃ ｓ 及肝实质细胞中 Ｃ Ｙ Ｐ ４ ５ ０亚型的表达 按试剂盒说明， 提取 Ｈ Ｓ Ｃ ｓ 和肝实质细胞中总 Ｒ Ｎ Ａ ， 并检测 Ａ 测定所提取 Ｒ Ｎ Ａ的纯 ２ ６ ０ｎ ｍ和 Ａ ２ ８ ０ｎ ｍ， Ａ按 ２ ６ ０ｎ ｍ／ ２ ８ ０ｎ ｍ比值 ＞ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 。各 Ｃ Ｙ Ｐ ４ ５ ０亚 照试剂盒说明进行一步法 Ｒ ８－ ９ ］ ， 反应体积为 ２ ５μ Ｌ ， 反应条 型引物参照文献［ Ｎ ＡＰ Ｃ Ｒ 缓 冲 液，５ 件如下 表。反 应 体 系 为 １×Ｒ
中国药理学与毒理学杂志 ２ ０ ０ ７年 １ ０月； ２ １ （ ５ ）
·４ ０ ５ ·
循环灌注 ０ ． １ ３ ％链霉蛋白酶 １ ５ｍ ｉ ｎ ， ０ ． ０ ５ ％ 胶原酶 １ ５～ ２ ０ｍ ｉ ｎ ， 待肝组织完全软化， 出现大的裂纹并有 部分部位成液状时， 停止灌注。剪碎肝组织， 去除结 缔组 织 和 肝 包 膜， 将肝组织倒入一含有 ０ ． ０ ０ ３ ％ Ｄ Ｎ ａ ｓ ｅ ａ ｎ ｋ ｓ 液至 １ ０ ０ｍ Ｌ 。将三角烧瓶放入恒 Ⅰ的 Ｈ
－ １ 大鼠经 ３ ％戊巴比妥钠（ ３ ０ｍ ｇ · ｋ ｇ ） 腹腔麻醉
一类非实质细胞， 为肝纤维化形成时细胞外基质的 主要来源细胞， 其激活过程是肝纤维化发生的关键。 生理状态下， Ｈ Ｓ Ｃ ｓ 以视黄基棕榈酸盐的形式贮存机
２ ］ 体８ ０ ％ 视黄醇， 同时调节视黄醇的转运和贮存 ［ 。
收稿日期： ２ ０ ０ ６ １ ２ ２ ６ 接受日期： ２ ０ ０ ７ ０ ４ １ ２ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（ ３ ０ ３ ７ １ ６ ６ ６ ） 作者简介：汪 晖 （ １ ９ ６ ３ －） ，女，教授， 博士生导师， 研究方向： 药物代谢和药物毒理。 联系作者 Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ： ｃ ｌ ｂ ｗ ｈ ｃ ｂ ｄ ＠ｙ ａ ｈ ｏ ｏ ． ｃ ｏ ｍ Ｔ ｅ ｌ ：（ ０ ２ ７ ） ６ ８ ７ ５ ８ ６ ６ ５ Ｆ ａ ｘ ：（ ０ ２ ７ ） ８ ７ ３ ３ １ ６ ７ ０
Calcein-AM和PI鉴别死活细胞
PI可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。
Calcein -AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。
尽管Calcein -AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein -AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光（激发：490 nm，发射：515 nm）。
因此Calcein -AM 仅对活细胞染色。
另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。
它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm）。
由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。
用545 nm激发，仅可观察到死细胞。
由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定PI和Calcein -AM的合适浓度。
I．试剂 Calcein-AM PIII．用荧光显微镜观察细胞形态以HeLa细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。
根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。
１．染色溶液的配制1）用1 ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM，制备成1 mmol/l 的Calcein-AM储备液，-20℃下密闭冷冻保存。
2）用1 ml ddH2O溶解1 mg PI，制备成1.5 mmol/l的PI储备液（1 mg PI/1 ml H2O），-20℃下密闭冷冻保存。
3）将Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。
4）加10 μl Calcein-AM储备液和15μl PI储备液至5 ml PBS中配制成染色溶液。
Calcein-AM的终浓度为2 μmol／l，PI的终浓度为4μmol／l。
2．细胞染色1）染色HeLa细胞等贴壁细胞时,先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。
细胞活体染色技术
吸出染液，滴加Ringer氏液，盖片、镜检，注意观察线粒体分布及所呈形 状。
2. 用动物细胞观察线粒体的活体染色。 取鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入盛有Ringer氏液的表面皿中洗去血
液。
将肝组织洗净后吸去血液，加入1／5000詹纳斯绿B染液染色30分钟，注 意不可将组织块完全淹没。
2. 在载玻片中央滴加中性红染料。使材料在其中染色5一10分钟。 3. 吸去染料，滴加Ringer氏液一滴，盖片、镜检、注意液泡系染成什么颜色，其形态、大小如何、分布
位置。
线料体的活体染色
1. l、用植物细胞观察线粒体的活体染色 用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块(约lcm2)，放在载玻片上用1/5000詹
一．取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1 ／5000詹纳斯绿B溶液。
二．用牙签取口腔上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的 染液滴中，染色10一15分钟(注意不能干燥)，盖上盖片， 吸去多余的溶液，即可镜检。
三．台盼蓝染色鏊别死活细胞。
○ 抽取小鼠腹腔水细胞涂于洁净载玻片上，滴加l％台盼蓝1滴， 盖上盖玻片于显微镜下观察。
实验三、细胞活体染色 技术
一、实验目的
学习细胞活体染色的方法。 观察动、植物活细胞内线粒体，
液泡系的形态、数量与分布。
二、实验原理
一．活体染色是利用某些无毒或毒性较小的染色剂，在不影响细胞生命活动的情况下显示细胞的天 然构造，更具真实性。活性染色又分为体内活体染色和体外活体染色。 二．詹纳斯绿B是一种活体染色剂，专一用于线粒体的染色并且呈现染成蓝色。它可以和线粒体中 的细胞色素C氧化酶结合，从而出现蓝绿色。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色 状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态。必须指出B氧化，从而使它显出颜色，因此，在实验过程中务必保持所取的 材料的活性。通常，需要把生物材料置于０℃～４℃的冰水浴低温中，并且操作要迅速。
医学检验学基础知识：血细胞化学染色小结
医学检验学基础知识：血细胞化学染色小结医学检验血液学是医疗卫生事业单位招聘考试中出题率相对较高的内容，其中血细胞化学染色可以说是血液学中的难点及重点,考试中很容易出题，它的各个试验多且内容繁杂,不容易记忆,同学们也很容易混淆的地方，今天今天帮助大家梳理，以便大家更好地复习和记忆。
常用的血细胞化学染色有过氧化酶染色(POX),过碘酸-雪夫反应(PAS)，碱性磷酸酶染色(NAP)，氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色(AS-D-NCE)，-醋酸萘酚酯酶染色( -NAE)，碱性-丁酸萘酚酯酶染色( -NBE)，铁染色。
结果判断:结果阳性：1.POX:棕黑色颗粒2.PAS：红色颗粒块状呈弥漫状红色3.NAP：灰褐色至深黑色颗粒状或片状沉淀4.AS-D-NCE:红色沉淀5. -NAE：棕黑色颗粒沉淀6. -NBE：蓝色颗粒7.铁染色：弥散蓝色，颗粒状，小珠状或块状正常血细胞的染色反应：1.POX：粒细胞系统：绝大部分(+)单核细胞系统：可(-)/(+)淋巴细胞系统：(-)2.NAP：粒细胞系统：绝大部分(+)单核细胞系统：绝大部分(+)淋巴细胞系统：绝大部分(-)3.NAP：除了巨噬细胞(+)，其他都(-)4.AS-D-NCE：粒细胞系统：原始粒细胞绝可(-)/(+)，大部分(+) 单核细胞系统：绝大部分(+)淋巴细胞系统：(-)5. -NAE：粒细胞系统：绝大部分(+)单核细胞系统：原始单细胞绝可(-)/弱(+)，其他(+)淋巴细胞系统：绝大部分(-)6. -NBE：粒细胞系统：(-)单核细胞系统：绝大部分(+)淋巴细胞系统：B淋巴(-)，其他(+)7.铁染色：细胞外铁：大多(++)临床意义：1.POX:鉴别急性白血病2.PAS：白血病分型3.NAP:主要慢性粒细胞白血病与类白血病的鉴别：慢性粒细胞白血病：NAP积分值常为0类白血病：NAP积分值明显增高4.AS-D-NCE:急性粒细胞白血病(+)，急单急淋(-)5. -NAE：急粒大部分(-)不能被NAF抑制;急单大部分(+)能被NAF抑制;急淋大部分(-)6. -NBE：与-NBE染色的临床意义相同7.铁染色：诊断缺铁性性贫血。
浙科版高中生物实验汇总
浙科版高中生物实验汇总必修一《分子与细胞》（共19个）【活动】1.检测生物组织中的油脂P102.检测生物组织中的糖类和蛋白质P143.模拟探究细胞表面积与细胞体积的关系P234.观察多种多样的细胞P255.验证活细胞吸收物质的选择性P286.观察叶绿体P397.观察洋葱表皮细胞的质壁分离及质壁分离复原P558.探究PH对过氧化氢酶的影响P669.光和色素的提取与分离P8710.探究环境因素对光合作用的影响P9411.观察细胞的有丝分裂P10612.制作并观察植物细胞有丝分裂的临时装片P11113.收集有关干细胞研究进展的资料P117【演示】14.酶的催化效率P6215.乙醇发酵实验P78【建议活动】16.检测细胞中的DNA和RNA P1617.探究洋葱表皮细胞细胞液的浓度范围P5618.探究酶的专一性P6419.收集有关癌症防治的资料P114必修二《遗传与进化》（共16个）【活动】1)模拟孟德尔杂交实验P132)减数分裂模型的制作研究P283)分析摩尔根的果蝇伴性遗传实验P414)资料分析——噬菌体侵染细菌的实验P495)制作DNA双螺旋结构模型P566)探究DNA的复制过程P617)探究花生果实大小的变异P748)模拟自然选择P979)通过数学计算讨论种群中基因型频率和基因频率的变化P10010)遗传病的概念辨析P11711)制作“假想的家族”家系图P12012)遗传咨询的讨论P12513)利用互联网了解人类基因组计划的实施过程P13214)讨论谁有权利知道基因检测的结果P133【建议活动】15)模拟两对相对性状测交的实验P1816)分析各类遗传病在人体不同发育阶段的发病风险曲线的意义P122必修三《稳态与环境》（共10个）【活动】1．探究2,4—D对插枝生根的作用P52．接受刺激，发生反应P253．甲状腺素促进蝌蚪变态P374．模拟尿糖的检测P405．调查青少年中常见的免疫异常P606．模拟用标志重捕法进行种群密度的调查P687．探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化P718．设计并制作生态瓶P1179．调查社区、村镇或学校附近一个淡水区域的水质P130【建议活动】10．人体内血糖浓度与胰岛素P41浙科版高中生物实验方案（部分）一、检测生物组织中的油脂必修一，10页，第一章第三节《有机化合物及生物大分子》（一）实验目的1.使用化学试剂检测生物组织中的油脂。
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World Chin J Digestol 2005 January 15;13(2):202-206ISSN 1009-3079 CN 14-1260/RPO Box 2345 Beijing 100023, ChinaFax: +86-10-85381893Email: wcjd@wjgnet.com www.wjgnet.com
• BASIC RESEARCH •
Fresh isolation and identification ofthe rat liver Kupffer cells suitable topatch clamp technique
Liang Liu, Zong-Ming Zhang, Chi Zhang, Nan Jiang
Liang Liu, Chi Zhang, Nan Jiang, First Department of General Surgery,Affiliated Tongji Hospital of Tongji University, Shanghai 200065, ChinaZong-Ming Zhang, Department of General Surgery, First Affiliated Hos-pital of Tsinghua University, Beijing 100016, ChinaSupported by National Natural Science Foundation of China, No.30224801; the Fund from Ministry of Education for Trans-CenturyExcellent Talent Development Plan, Official Letter No. 2002-48; andShuguang Project of Shanghai Educational Committee, No. 02SG20.Correspondence to: Dr. Zong-Ming Zhang, Department of GeneralSurgery, First Affiliated Hospital of Tsinghua University, Beijing 100016,China. zhangzongming@yahoo.comReceived: 2004-11-01 Accepted: 2004-11-12
AbstractAIM: To establish a method for isolation of rat liver Kupffercells suitable for patch clamp technique (PCT).
METHODS: Liver Kupffer cells were isolated from Sprague-Dawley rats by in situ perfusion via the portal vein withCa2+/Mg2+-free Krebs buffer followed by collagenase IVdigestion. Then Percoll Isopyknic gradient centrifugationwas performed. Kupffer cells were purified after selectiveadhesion. The cells were identified by endocytosis (inkand latex beads) experiments in vivo and in vitro. The elec-tric current in Kupffer cells was recorded by whole-cellpatch-clamp recording technique.
RESULTS: The isolated Kupffer cells showed polymor-phism with typical polygon-like and star-like shapes. Atotal of 2.5-3.5×106 cells were collected per gram of ratliver. The purity and adhesion rate were 90% and 39.4%,respectively. The activity is over 90%. The isolated andpurified rat Kupffer cells were easy to be used in whole-
cell PCT, and the store-operated Ca2+ current was suc-cessfully recorded in the cells.
CONCLUSION: The Kupffer cells suitable for PCT weresuccessfully isolated from rats by enzyme digestion com-bined with gradient centrifugation and adhesion purification.
Key Wey Words:ords:ords: Kupffer cells; Patch clamp technique
Liu L, Zhang ZM, Zhang C, Jiang N. Fresh isolation and identifica-tion of the rat liver Kupffer cells suitable to patch clamp technique.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004;13(2):202-206
×http://www.wjgnet.com/1009-3079/13/202.aspµ
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1Knook DL, Blansjaar N, Sleyster EC. Isolation and character-ization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver. ExpCell Res 1977;109:317-3292Goto M, Lemasters JJ, Thurman RG. Activation of voltage-dependent calcium channels in Kupffer cells by chronic treat-ment with alcohol in the rat. J Pharmacol Exp Ther 1993;267:1264-12683Nnalue NA, Shnyra A, Hultenby K, Lindberg AA. Salmonellacholeraesuis and Salmonella typhimurium associated with livercells after intravenous inoculation of rats are localized mainly inKupffer cells and multiply intracellularly. Infect Immun 1992;60:2758-276842003;9:88-92
205Current (pA)Voltage (mV)Control100 uM 2-APB
6004002000-200-400-600-800-1 000
-150 -100 -50 0 50 1005Ramadori G, Neubauer K, Odenthal M, Nakamura T, KnittelT, Schwogler S, Meyer zum Buschenfelde KH. The gene ofhepatocyte growth factor is expressed in fat-storing cells ofrat liver and is downregulated during cell growth and bytransforming growth factor-beta. Biochem Biophys Res Commun1992;183:739-7426Hendriks HF, Brouwer A, Knook DL. Isolation, purification,and characterization of liver cell types. Methods Enzymol 1990;190:49-587Valatas V, Xidakis C, Roumpaki H, Kolios G, KouroumalisEA. Isolation of rat Kupffer cells:a combined methodology forhighly purified primary cultures. Cell Biol Int 2003;27:67-738Ikejima K, Enomoto N, Seabra V, Ikejima A, Brenner DA,Thurman RG. Pronase destroys the lipopolysaccharide receptorCD14 on Kupffer cells. Am J Physiol 1999;276(3 Pt 1):G591-5989Smedsrod B, Pertoft H. Preparation of pure hepatocytes andreticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver bymeans of Percoll centrifugation and selective adherence. JLeukoc Biol 1985;38:213-230102000;13:242-24611Kolb HA, Adam G. Regulation of ion permeabilities of iso-lated rat liver cells by external calcium concentration andtemperature. J Membr Biol 1976;26:121-15112Berridge MJ. Capacitative calcium entry. Biochem J 1995;312(Pt 1):1-1113Putney JW Jr, McKay RR. Capacitative calcium entry channels.Bioessays 1999;21:38-46