圆形纸层析法鉴定转氨基作用的实验改进
氨基移换实验中纸层析方法的改进研究
氨基移换实验中纸层析方法的改进研究刘美艳;营孙阳;张健;朱爱华【摘要】由于传统氨基移换实验中的展层剂水饱和苯酚是有毒物质，寻找低毒或无毒的展层剂是十分必要的。
文章通过对展层剂的种类、配比、展层时间及染色方法的研究，确定了以正丁醇：甲酸（88％）：水为15：3：2的展层剂，展层时间为1．5h，以展层剂为溶剂的0．3％茚三酮为染色液，并使展层与染色同步进行。
%The traditional chromatographic solution in the experiment of paper chromatography of amino transfer and exchange was saturation phenol which was toxic. It is necessary to find chromatographic solution which was low toxic or non-toxic. This paper investigates the chromatographic solutions, proportion, chromatographic time and staining method. The results showed that the suitable chromatographic solution was n-butanol, formic acid and water, and corresponding proportion is 15: 3: 2. The suitable chromatographic time was 1.5h. The staining solution was 0. 3 % ninhydrin which solved with chromatographic solution, and chromatography and staining were synchronous.【期刊名称】《实验科学与技术》【年(卷),期】2012(010)006【总页数】3页(P21-22,37)【关键词】氨基移换;纸层析;展层剂;染色【作者】刘美艳;营孙阳;张健;朱爱华【作者单位】江苏师范大学生命科学学院,江苏徐州221116;江苏师范大学生命科学学院,江苏徐州221116;江苏师范大学生命科学学院,江苏徐州221116;江苏师范大学生命科学学院,江苏徐州221116【正文语种】中文【中图分类】Q5;Q503纸层析法是分离混合氨基酸的常用方法。
05纸层析法鉴定转氨基作用
6.显色 将滤纸平放在培养皿上，用喷瓶向滤纸均匀喷洒 0.1%茚三酮溶液，再用吹风机吹干，可见紫红色的同 心弧形斑点。 7.计算 按下表记录有关数据，计算Rf值。
“谷” “丙” “对” “测1、2”
点样处至色斑中心距离(A)
点样处至溶剂前沿距离(B) Rf值(A/B)
将“对”、“测”各色斑的 Rf值与已知氨基酸的 Rf 值进行对比，确定它们各是什么氨用采血管吸取测定管上清液、对照管 上清液、谷氨酸溶液、丙氨酸溶液各 1 滴，依次点在 滤纸上标明测、对、谷、丙的点样处。注意点样斑点 不可太大。直径应小于 0.5cm 。必要时可再点一次， 每点一滴，用吹风机吹干后方可再点第二滴，并且点 样量应力求均匀相等。 5. 层析 将滤纸放在培养皿上，灯芯下端浸入层析液 中进行层析。约40分钟后，去除灯芯，立即用铅笔划 出溶剂前沿，用吹风机吹干。
[步骤] 1.制备肝匀浆 2. 转氨基反应 取干净试管 2 支，分别标明测定管与 对照管，按下表操作。
管号 试剂（滴） 肝匀浆 丙氨酸 α-酮戊二酸 测定管 对照管
10d 10d 37℃水浴10min 沸水浴10min 10d 10d 10d 10d 37℃水浴20min
3. 准备：取直径 15cm 圆形滤纸 1 张，用圆规在滤纸正 中作一半径为 1cm 的小圆圈，用铅笔通过圆心作两点 互相垂直的线，并在两线外端等距离点 4 个原点，标 明测、对、谷、丙。在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔 芯粗细），另取同类滤纸小片 1.5cm×3cm，下三分之 二剪成须状。将其卷成圆筒如灯芯状，插入小孔（略 突出于滤纸面）
原理在转氨酶的作用下某一氨基酸去掉氨基生成相应的酮酸而另一种酮酸得到此氨基生成相应的氨基酸的过程称为在转氨酶的作用下某一氨基酸去掉氨基生成相应的酮酸而另一种酮酸得到此氨基生成相应的氨基酸的过程称为氨基酸的转氨基作用
氨基酸纸上层析实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除氨基酸纸上层析实验报告篇一：实验六氨基酸的纸层析法氨基酸的纸层析法一．目的了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。
二、原理以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。
纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。
展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。
有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。
将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。
在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、ph 值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。
用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。
这种方法称为双向层析法。
本试验主要介绍的是单向层析法。
其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。
三、实验仪器1、新华滤纸2、层析缸3、细线4、点样管5、橡皮筋6、电吹风7、喷雾器四、实验试剂1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml 无水丙酮，贮于棕色瓶中五、实验步骤1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。
2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。
3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。
22 生物化学实验--纸层析法测定肝组织的转氨基作用
纸层析法测定肝组织的转氨基作用【目的】1 ．掌握纸层析法的原理和方法。
2 ．熟悉相关转氨酶的临床意义。
【原理】转氨基作用是氨基酸代谢的一个重要反应。
在转氨酶作用下，将氨基酸的氨基转移到α - 酮酸上。
每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化。
转氨酶广泛分布于机体各器官、组织，例如肝细胞中存在的丙氨酸氨基转移酶，能催化α - 酮戊二酸与丙氨酸之间的转氨基作用。
反应式如下：纸层析是以滤纸作为支持物，与滤纸纤维素结合的水（约占纸重 20 ～ 30 ％）称为层析中的“固定相”。
另一种和固定相不能混合或部分混合的溶剂则为“流动相”。
把欲分离的物质加在纸的一端，并使流动相借滤纸的毛细现象移动，此时，待分离溶质因分配系数不同而逐渐分布于滤纸的不同部位。
层析过程中或层析结束时，用显色剂使被分离的物质显出颜色，成为一个个色斑。
分配在固定相中趋势较大的成分在纸上随流动相移行的速度就小，色斑距原点的位置就较近。
反之，分配在固定相内趋势较小的成分移行就远，色斑位置离原点也远。
溶质在纸上的移动速率可用比移（R f ）表示：同一氨基酸在相同的层析条件下 R f 值相同，不同氨基酸在相同层析条件下 R f 值不同，因此可以根据 R f 值来鉴定被分离的氨基酸。
层析时，用显色剂茚三酮使氨基酸显色，将样品氨基酸的 R f 值与标准氨基酸的 R f 值比较，即可确定所分离氨基酸的种类。
【器材】1 ．研钵2 ．剪刀3 ．恒温水浴4 ．点样毛细管5 ．漏斗6 ．表面皿或小平皿7 ．新鲜动物肝脏8 ．直径 10cm 圆型新华滤纸9 ．中试管和小试管10 ．电炉或吹风机或烘箱11 ．直径 10cm 的培养皿【试剂】1 ． 0.2mol/L ， pH7.4 磷酸缓种液Na 2 HPO4 溶液 81ml 与 0.2mol/L NaH 2 PO4 溶液 19ml 混匀，再用蒸馏水稀释 20 倍。
2 ． 0.1mol/L 丙氨酸溶液称取丙氨酸 0.891g 先溶于少量 pH7.4 磷酸盐缓冲液中，以 0.1mol/LNaOH 仔细调节至 pH7.4 后，用磷酸缓冲液加至 100ml 。
氨基酸的分离鉴定纸层析法
氨基酸的分离鉴定纸层析法引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于生物体的正常生理功能至关重要。
因此，准确地分离鉴定氨基酸成分对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
纸层析法是一种简单而有效的分离和鉴定氨基酸的方法。
本文将介绍氨基酸的分离鉴定纸层析法并探讨其应用。
一、纸层析法的原理纸层析法是利用气相平衡原理进行物质分离的一种方法，其原理是根据物质在纸上各组分的相对亲疏性，通过运动距离的差异来分离物质。
在氨基酸的分离鉴定中，纸层析法通过将待测氨基酸溶液滴于纸上，然后将纸立起来，将纸的下端浸入相应的溶剂中，使得溶剂上升，通过毛细作用将氨基酸上提，最终实现氨基酸的分离和鉴定。
二、纸层析法的步骤1. 准备工作：制备纸层析板和显色剂。
2. 样品处理：将待测氨基酸溶解于适量的溶剂中，使其浓度适宜，然后滴于纸层析板上。
3. 运行纸层析：将纸层析板立起，纸的下端浸入相应的溶剂中，待溶剂上升到一定高度后，取出纸层析板。
4. 显色：将纸层析板放置于显色剂中，通过氨基酸与显色剂的反应，使得氨基酸在纸上显色。
5. 结果鉴定：根据显色的位置、颜色和强度等特征，对氨基酸进行鉴定和定量分析。
三、纸层析法的应用1. 氨基酸组成分析：纸层析法可用于分析蛋白质中氨基酸的组成，从而揭示蛋白质的结构和功能。
2. 质量控制：纸层析法可用于对食品、药品等中氨基酸含量的快速检测，保证产品质量和安全性。
3. 生物体内氨基酸代谢研究：纸层析法可用于研究生物体内氨基酸的代谢途径和代谢产物。
四、纸层析法的优缺点纸层析法作为一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法，具有以下优点：1. 简单易行：操作简单，不需要复杂的仪器设备，成本低廉。
2. 分离效果好：对于氨基酸的分离效果较好，可以得到较为准确的结果。
3. 易于观察：通过显色剂的反应，可以直观地观察到氨基酸在纸上的分离和鉴定结果。
然而，纸层析法也存在一些缺点：1. 分离效果有限：对于某些结构相似的氨基酸，纸层析法的分离效果不佳，难以实现准确鉴定。
氨基酸移换反应
根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠 之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。
试剂和器材
1. 材料 动物：家兔 2. 试剂 (1)Locke氏溶液：取0.9g氯化钠、0.042g氯化 钾、0.024g 氯化钙、0.015g碳酸氢钠及0.1g葡萄糖，溶于 水中，稀释到100ml (2)0.1mol/L碘溶液:称取12.7g碘和约25g碘化钾, 溶于水中,稀释到1000ml,混匀,用标准硫代硫酸 钠溶液标定.
本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可 用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘 生成碘仿。反应式如下：
2NaOH+I2→NaIO+NaI+H2O CH3COCH3+3NaOI→CHI3+CH3COONa+2NaOH
碘仿 剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。
NaOI+NaI+2HCl→I2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI
实验原理
根据β—氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化 生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可再缩合 成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成 丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的 中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患糖 尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高， 尿中也能出现酮体。
氨基转移反应的定性鉴定
ʺ₪实验目的 ʺ 学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及 其原理 ʺ进一步掌握纸层析的原理和操作技术 ʺ了解氨基移换作用在中间代谢中的意义
₪实验原理
ʺ 氨基移换酶也称转氨酶,它能催化α-氨基酸的
实验十三氨基移换反应——谷丙转氨酶活性的测定（纸层析法）
实验十三氨基移换反应——谷丙转氨酶活性的测定（纸层析法）一、目的进一步理解转氨基作用。
学习应用纸层析法鉴定氨基移换反应。
二、原理转氨基作用是指在转氨酶的催化下α-氨基酸和α-酮酸之间的氨基转移作用。
转氨酶广泛存在于生物体内，目前已发现的转氨酶至少有50种以上，其辅酶均为磷酸吡哆醛，酶反应的最适pH为7.4。
生物体内分布最广、活力最强的转氨酶有两种：一种为谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶，GPT）主要存在于肝脏；另一种为谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶，GOT）在心肌中活力最大，其次在肝脏。
GPT⎯⎯→+α⎯−丙氨酸酮戊二酸丙酮酸谷氨酸+GOT⎯→⎯⎯+α草酰乙酸天冬氨酸酮戊二酸谷氨酸+−正常情况下转氨酶主要存在于细胞中，人及动物的血清中含量很少，活性很低。
而当组织细胞受到损伤（如发生肝炎、心肌梗死等病变）时，这些细胞中的转氨酶就会释放到血液中去，此时血清中转氨酶的含量及活性均显著增加。
因此转氨酶活性的测定在临床诊断上有重要意义。
三、仪器、试剂与材料剪刀、镊子、研钵、大烧杯、试管及试管架、吸量管、漏斗、滤纸、培养皿、表面皿、酒精灯、喷雾器、恒温水浴箱、烘箱、离心机。
1%谷氨酸溶液、1%丙酮酸钠溶液、0.1%碳酸氢钾溶液、0.025%溴乙酸溶液、2%醋酸溶液、0.9%氯化钠溶液、标准谷氨酸溶液、标准丙氨酸溶液、酚饱和水溶液（扩展剂）、0.1%水合茚三酮正丁醇溶液（显色剂）。
兔肝、海砂。
四、操作1、肝匀浆液制备在研钵中加入兔肝1g＋0.9%氯化钠3ml＋海砂200mg→置于放有冰水的大烧杯上面，研磨成匀浆→3000r/min离心5min→弃沉淀、得到肝糜匀浆液。
2、氨基移换反应：取干燥试管2支，分别标明测定管与对照管。
实验管1 对照管21%谷氨酸溶液（ml） 0.5 0.51%丙酮酸钠溶液（ml） 0.5 0.50.1%碳酸氢钾（ml） 0.5 0.50.025%溴乙酸（ml） 0.25 0.25混匀后加入肝糜提取液（ml） 0.5 0.5立即酒精灯加热或沸水浴2~3min加盖胶塞，置45℃水浴保温1h，并时常振荡2%醋酸（滴） 4 4 沸水浴中（或酒精灯）2~3min（终止反应、沉淀蛋白）离心（或过滤），收集上清液做层析使用3、层析：取3＃滤纸一张，用圆规作半径1cm的圆，通过圆心作两条相互垂直的线，与圆相交的4点作为点样位置，在滤纸圆心处剪一小孔φ2mm。
酶促转氨基作用及其层析鉴定
酶促转氨基作用及其层析鉴定一、实验原理转氨基作用又称氨基转移作用，发生在a 氨基酸和a 酮酸之间，即在转氨酶的催化下，a 氨基酸的氨基转移到a 酮酸的酮基碳原子上，结果原来的a 氨基酸生成相应的a 酮酸，而原来的a 酮酸则形成了相应的a 氨基酸。
转氨基作用是生物体内普遍存在的一种生化反应，是氨基酸脱氨基作用的一种途径。
转氨酶种类多，专一性强，催化的转氨反应是可逆的。
转氨酶的最适pH 一般为7.4左右，其辅酶是磷酸吡哆醛。
目前已经发现的转氨酶有50余种，其中最重要的是谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)。
本实验以谷氨酸和丙酮酸混合溶液在谷丙转氨酶作用下的反应来观察酶促转氨基作用，其反应式为反应产物可用纸层析法分离鉴定。
纸层析是以滤纸作为层析支持物，以纸上吸附的水为固定相的一种层析技术，其分离的原理属于分配层析。
层析时，将一定量的样品点在滤纸上，用适当的有机溶剂作为流动相。
当流动相流经固定相时，样品即在水相和有机相之间进行反复分配。
由于样品中各组分在两相中的溶解度不同，因而在两相中的分配系数不同，各组分随有机溶剂迁移的速度也就不同，最后被完全分离开。
被分离组分在滤纸上的迁移速度可用相对迁移率R 值表示。
f 展层后用茚三酮溶液显色，将样品各显色斑点的R 值与同时展层的标准氨基酸f 的R 值比较，即可鉴定其氨基酸种类。
二、实验步骤1•酶液的制备去掉绿豆芽种皮称取3g,放入研钵内加2mLO.1mol/LpH8.0的磷酸缓冲液研成匀浆，然后转移至离心管中，再用1mL 缓冲液冲洗研钵，溶液并入离心管中，3000r/min 离心10min,取上层清液备用。
HHOHOGPT H °OH凋戊二醸酶液也可以用动物材料制备，称取猪肝脏2g,剪碎置研钵中，加入0.9%氯化钠溶液和少量石英砂，研磨成匀浆，离心，取上清，即为酶提取液。
2.酶促反应取两支试管，编号；按表1-5分别从左到右加入相应试剂并进行相处理。
纸层析法鉴定转氨基作用
6.显色 将滤纸平放在培养皿上，用喷瓶向滤纸均匀喷洒 0.1%茚三酮溶液，再用吹风机吹干，可见紫红色的同 心弧形斑点。 7.计算 按下表记录有关数据，计算Rf值。
“谷” “丙” “对” “测1、2”
点样处至色斑中心距离(A)
点样处至溶剂前沿距离(B) Rf值(A/B)
将“对”、“测”各色斑的 Rf值与已知氨基酸的 Rf 值进行对比，确定它们各是什么氨基酸。据此解释转 氨基作用。
[步骤] 1.制备肝匀浆 2. 转氨基反应 取干净试管 2 支，分别标明测定管与 对照管，按下表操作。
管号 试剂（滴） 肝匀浆 丙氨酸 α-酮戊二酸 测定管 对照管
10d 10d 37℃水浴10min 沸水浴10min 10d 10d 10d 10d 37℃水浴20min
3. 准备：取直径 15cm 圆形滤纸 1 张，用圆规在滤纸正 中作一半径为 1cm 的小圆圈，用铅笔通过圆心作两点 互相垂直的线，并在两线外端等距离点 4 个原点，标 明测、对、谷、丙。在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔 芯粗细），另取同类滤纸小片 1.5cm×3cm，下三分之 二剪成须状。将其卷成圆筒如灯芯状，插入小孔（略 突出于滤纸面）
[步骤]
4. 点样 分别用采血管吸取测定管上清液、对照管 上清液、谷氨酸溶液、丙氨酸溶液各 1 滴，依次点在 滤纸上标明测、对、谷、丙的点样处。注意点样斑点 不可太大。直径应小于 0.5cm 。必要时可再点一次， 每点一滴，用吹风机吹干后方可再点第二滴，并且点 样量应力求均匀相等。 5. 层析 将滤纸放在培养皿上，灯芯下端浸入层析液 中进行层析。约40分钟后，去除灯芯，立即用铅笔划 出溶剂前沿，用吹风机吹干。
纸层析法鉴定转氨基作用
[目的] 1.验证氨基酸的转氨基作用 2.掌握纸上层析法分离和鉴定氨基酸的基本原 理和方法。 [原理] 在转氨酶的作用下，某一氨基酸去掉α- 氨基 生成相应的α-酮酸，而另一种α-酮酸得到此氨基 生成相应的氨基酸的过程，称为氨基酸的转氨基作 用。
氨基转换作用实验报告
氨基转换作用实验报告一、实验目的了解氨基转换作用的基本原理，掌握测定氨基转换作用的实验方法，观察组织中氨基转换作用的现象。
二、实验原理氨基转换作用是指在转氨酶的催化下，一种氨基酸的氨基转移到另一种酮酸上，生成相应的氨基酸和酮酸的过程。
本实验以丙氨酸和α酮戊二酸为底物，在谷丙转氨酶（GPT）的催化下，丙氨酸的氨基转移到α酮戊二酸上，生成谷氨酸和丙酮酸。
反应式如下：丙氨酸＋α酮戊二酸谷丙转氨酶谷氨酸＋丙酮酸丙酮酸可以与 2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性条件下呈棕红色。
通过比色法测定生成的丙酮酸含量，可以计算出氨基转换作用的强度。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物肝脏（如猪肝）2、实验试剂（1）01mol/L pH74 磷酸盐缓冲液（2）001mol/L 丙氨酸溶液（3）001mol/L α酮戊二酸溶液（4）2,4-二硝基苯肼溶液（5）04mol/L NaOH 溶液（6）标准丙酮酸溶液（2μmol/mL）3、实验仪器（1）离心机（2）分光光度计（3）恒温水浴锅（4）移液器（5）试管、量筒、烧杯等四、实验步骤1、制备酶液称取新鲜猪肝 5g，剪碎后放入研钵中，加入少量石英砂和 5mL 磷酸盐缓冲液，研磨成匀浆。
将匀浆倒入离心管中，在 3000r/min 下离心10min，取上清液即为酶液。
2、反应体系的建立取 4 支试管，按下表加入试剂：｜试管编号|试剂（mL）｜｜：：｜：：｜｜1（对照管）｜磷酸盐缓冲液 05<br>丙氨酸溶液05<br>α酮戊二酸溶液 05|｜2（测定管）｜酶液 05<br>磷酸盐缓冲液 05<br>丙氨酸溶液05<br>α酮戊二酸溶液 05|将上述 4 支试管摇匀后，在 37℃恒温水浴锅中保温 30min。
3、终止反应并测定丙酮酸含量保温结束后，向各试管中分别加入 2,4-二硝基苯肼溶液 05mL，摇匀后在 37℃恒温水浴锅中保温 20min。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第３３卷第４期
２００８年８月 贵 阳 医 学院 学报
ＪＯＵＲＮＡＬ ｏＦ ＧＵＩＹＡＮＧ Ｍ匮ＤＩＣＡＬ ＣｏＬＬＥＧＥ
、ｒ０ｌ－３３ Ｎｏ．４
）８．８
圆形纸层析法鉴定转氨基作用的实验改进
王筑婷，吴青青
（贵阳医学院生物化学教研室，贵州贵阳５５０００４）
［关键词】实验室技术和方法；氨基酸类；展层剂；迁移率
［中图分类号】Ｒ３４１．７；Ｒ３４—３３ ［文献标识码］Ｂ ［文章编号］１０００－２７０７（２００８）０４－０４１８－０２
传统实验中常用的苯酚是一种有毒物质，有强
烈的刺激气味，对皮肤有较强的腐蚀性，而且价格
较贵。２００７年６月通过不断的比较与反复试验，
将实验中原有的苯酚和水改进为无水乙醇：水：尿
素的配方，目的在于降低实验试剂对人体的危害，
简化实验步骤，降低实验成本。 １材料与方法 １．１材料 新鲜猪肝组织１ ｇ、１％谷氨酸溶液、１％丙酮酸 溶液、０．２５％碘乙酸溶液、０．１％丙氨酸、 ０．Ｏ１ ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）磷酸盐缓冲液、０．１％茚三酮 乙醇溶液、原展层剂（苯酚、水）、新展层剂（无水乙 醇、水、尿素）。 １．２实验方法 １．２．１肝匀浆制备取新鲜猪肝１ ｇ置于研钵中 研碎，加预冷的０．０１ ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）的磷酸盐缓冲 液４ ｌＩｌｌ，磨成匀浆。 １．２．２转氨基反应取２支试管，分别标记为测 定管和对照管，测定管内加入肝匀浆１Ｏ滴，对照管 内加入煮沸过的肝匀浆１Ｏ滴，然后两支管内都依 次加入０．２５％碘乙酸５滴、１％谷氨酸１Ｏ滴、１％ 丙酮酸钠１Ｏ滴，在４ｏ℃水浴箱中保温１０ ｍｉｎ，加 入５％三氯醋酸２滴，最后在沸水中加热５ ｍｉｎ冷 却后，离心５ ｍｉｎ，取上清液备用。 １．２．３标记划线取圆形滤纸（直径１２ ｃｍ）８ 张，用铅笔从圆心画长度各１ ｃｍ的端点作为点样 处，在各点对应的滤纸边缘标上“谷”、“丙”、 “对”、“测”字样。 １．２．４点样取４根毛细管，用顶端分别沾取测 定管、对照管、０．１％谷氨酸、０．１％丙氨酸样品液， 在滤纸相应点样处点样，每处点２次。 ４１８ １．２．５层析和显色在８个直径为５ ｃｍ的表面 皿中分别加人４种不同的展层剂，即苯酚：水（４： １）和无水乙醇：水：尿素（分别为：８０：２０：０．５、７０： ３０：０．５、６０：４０：０．５三种比例），每种展层剂平行做 两份。将表面皿置于直径为ｌＯｃｍ培养皿正中，把 滤纸平放在培养皿上，使灯芯浸入展层溶剂中，取
另一同样大小的培养皿反向盖上，溶剂将沿灯芯上
升到滤纸，并向四周扩散，待溶剂前沿扩散至滤纸
边缘约１ ｃｍ时，取出滤纸，用铅笔划出溶剂前后，
在烤箱中烤干。由于无水乙醇：水：尿素展层剂中
直接加入了茚三酮，故从烤箱中取出的６张滤纸上
有紫色的弧形色斑；而原配方的展层剂中没有加入
茚三酮，故从烤箱中拿出的滤纸要喷０．１％茚三酮
乙醇溶液，再放人烤箱中第二次烤干，才出现紫色
的弧形色斑。用铅笔描出色斑轮廓，计算迁移率
耻值，取两份平行结果的平均值。
２ 结果
经过转氨基作用后，谷氨酸与丙氨酸在四种展
层剂中的迁移率见表１。从８张滤纸的层析图谱
结果看到，苯酚：水和乙醇：水：尿素（８０：２０：０．５）
这４张滤纸上，氨基酸分离效果较为明显，而乙醇：
水：尿素（７０：３０：０．５）和乙醇：水：尿素（６０：４０：
０．５）这４张滤纸的氨基酸无法分离。
３讨论
３．１纸层析图谱和迁移率
从４张能分离氨基酸的纸层析图谱结果可以
看到，对照管中没有发生转氨基作用，只有一个色
斑，而测定管中‘发生了转氨基作用，有两个色斑。
维普资讯 http://www.cqvip.com
４期 王筑婷等 圆形纸层析法鉴定转氨基作用的实验改进
表１ 两种氨基酸在四种配方中的迁移率（Ｒｆ值）
Ｔａｂ．１ Ｒｆ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｂｕｆｆｅｒｓ
ｗｉｔｈ ｆｏｕｒ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ
从谷氨酸和丙氨酸的点样色斑相比较得出，距点样
处近的是谷氨酸，距点样处远的是丙氨酸。４张纸
层析图谱的色斑都分得很明显，证明新旧两种配方
的展层剂均能较好的分离氨基酸。从表１的结果
也可看到，通过两种不同配方的展层剂分离出来的
氨基酸迁移率基本相同，说明用新配方制成的展层
剂也能达到分离氨基酸的目的，而且效果很好。
３．２原有展层剂中使用苯酚的缺点
原有展层剂中的有机溶剂苯酚（Ｃ Ｈ ＯＨ）主
要有以下缺点。（１）苯酚的毒性和腐蚀性对皮肤
和黏膜有刺激和致坏死的作用，浓苯酚溶液使皮肤
坏死而硬化，先白而后红，接触处形成不化脓的干
痂。吸人苯酚中毒后对肝、肾和心肌都受损害。
（２）苯酚作为实验试剂价格贵。由于腐蚀性极
强…，可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜
等，所有操作均应在通风橱中进行；而且苯酚在低
温下呈固态；实验前，需要在水浴中加热数小时才
会溶解，现配现用，随配随用 ，这些都给实验的
操作带来不方便；（３）有较强的生物富集作用，对
环境污染较大 。
３．３新展层剂中使用乙醇的优点
新展层剂的成分为乙醇、水和尿素，比较原有
的展层剂，新配方具有以下几个优点：（１）安全无
毒，没有腐蚀性，对人体没有副作用；（２）与苯酚相
比较，乙醇价格便宜，由于没有腐蚀性，且易挥发，
在实验操作中，无须戴手套，也不用在通风橱中进
行，这些都大大的简化了实验的操作过程，缩短了
实验时间，给实验人员带来了极大的方便。
３．４显色方法比较
原实验中的展层剂里没有加入茚三酮，故等滤
纸干后要将茚三酮乙醇溶液喷在滤纸上显色，在这
个操作过程中茚三酮的量无法固定，会使茚三酮很
难均匀的喷在滤纸上，色斑显色不均匀，易扩
散 ，甚至会被冲散，使得滤纸表面显得很不干
净，影响Ｒｆ值的测定。为了克服传统喷雾显色造
成的重现性差，本实验改进了显色方法，将一定量
的茚三酮溶解于展层剂中，在层析过程中，茚三酮
随展层剂沿滤纸向四周扩散，由于固定了显色剂的
量 Ｊ，茚三酮与Ｏｔ一氨基酸共热，生成还原型水合
茚三酮，还原型水合茚三酮再与茚三酮反应生成蓝
紫色化合物 Ｊ，故从烤箱中取出滤纸后能看见蓝
紫色色斑均匀分布在滤纸上，显色效果较好，滤纸
表面比较干净，利于Ｒｆ值的测定，大大缩短了实验
时间，使操作更简单，效果也很好。
综上所述，用无水乙醇、水、尿素按照８０：２０：
０．５的比例配制的新展层剂，可以代替原有的苯酚
和水的展层剂，同样能够较好的分离氨基酸，对人
体没有任何毒性和腐蚀性，简化了实验步骤；另外，
将茚三酮加入新展层剂中，能够更好的显色，实验
时间大大缩短，优化了实验结果，达到了改进实验
的目的。
４参考文献
［１］榻金彩，周桂．对“植物体内的转氨基作用”实验的改
进［Ｊ］．生物学通报，２００６（１）：５０—５０．
［２］杨培俊，秦峰秀．几种层析液对滤纸圆盘分离叶绿体
色素的影响［Ｊ］．生物学通报，２００７（９）：５２—５２．
［３］星炯浩，张运陶．卤代酚对水生梨形四膜虫急锐毒性
的ＱＳＡＲ研究［Ｊ］．计算机与应用化学，２００７（１）：８７—
８７．
［４］陈海军，林亲录，王婧，等． 一氨基丁酸测定方法的研
究［Ｊ］．食品工业科技，２００７（５）：２３６—２３６．
［５］李海星，江英英，曹郁生．产 一氨基丁酸乳酸菌的筛
选及初步鉴定［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００７（３）：
４５７—４５７．
［６］张丽萍，李伟辉，马晓贝．啤酒中ｄ一氨基酸含量的分
析［Ｊ］．酿酒科技，２００７（７）：１３５—１３５．
（２００８－０１—１１收稿，２００８－０４—１７修回）
４ｌ９
维普资讯 http://www.cqvip.com