血清学凝集反应
双向琼脂扩散实验
双向琼脂扩散试验一、实验目的1、掌握双向琼扩试验的原理和用途2、掌握双向琼扩试验操作方法3、观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线二、原理血清学反应：•凝集反应•沉淀反应•补体参与的反应•中和反应凝集反应：颗粒性抗原，或吸附在颗粒性载体表面的可溶性性抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在，经过一定时间，成肉眼可见的凝集团块参与凝集反应的抗原称凝集原，抗体称为凝集素沉淀反应：将可溶性抗原与相应抗体混合，在电解质存在条件下，即可形成肉眼可见的沉淀物沉淀物只在抗原抗体比例合适时才出现补体参与的反应：补体结合试验是根据补体能与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独同抗原或抗体结合的特性，用特定的补体来检测抗原抗体间有无特异性结合中和反应：针对病毒的一些蛋白质抗原或抗原表位的抗体与病毒结合后可以中和病毒的感染性（病毒中和试验可以在细胞培养、鸡胚或动物上进行，一般将抗体作稀释，与一定量的病毒混合，然后检测其在细胞培养、鸡胚或动物上的残余感染性）•终点是以抑制细胞病变（细胞培养）或病毒复制（鸡胚或动物）的抗体最高稀释度来表示。
（中和试验具有很强的特异性，是检测病中和试验具有很强的特异性，毒和新分离病毒毒株的鉴定最经典的方法，也可用于检测病毒感染动物血清中的抗体）双向琼脂扩散试验，是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。
两者相互扩散，当扩散到他们的浓度比例合适的部位相遇时，就会形成抗原抗体复合物的沉淀【可溶性抗原（如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等）与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。
抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。
每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。
且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。
《兽医免疫学教学资料》免疫名词解释
名词解释1、免疫（immune）：是指机体识别自己与非己，并能将非己成分排出体外的复杂的生理学过程，它可能对机体产生不同的影响。
正常情况下，免疫功能使机体的内环境得以维持稳定，具有保护作用；在异常情况下，免疫功能可能导致某些病理过程的发生和发展。
免疫的三大功能（包括异常情况）：（1）免疫防御（immune defence）即抗感染免疫，是指阻止病原微生物侵入机体，抑制其在体内繁殖、扩散，从体内清除病原微生物及其产物，保护机体生存的功能。
该功能异常，可发生超敏反应和重复感染。
（2）自身免疫稳定（immune homeostasis）是指清除体内变性、损伤及衰老的细胞，维持内环境稳定的功能。
该功能异常，可导致自身免疫病的发生。
（3）免疫监视（immune surveillance）由于各种体内外因素的影响，正常个体的组织细胞也可不断发生畸变和突变。
免疫监视具有识别、杀伤与清除体内突变细胞的功能。
若该功能发生失常，可能导致肿瘤的发生。
2、中枢免疫器官：是各类免疫细胞发生、分化和成熟的场所。
包括骨髓、胸腺或法氏囊。
3、外周免疫器官：是淋巴细胞和其他免疫细胞定居、增殖以及产生免疫应答的场所。
淋巴结、脾脏、扁桃体及皮肤粘膜淋巴相关组织等。
4、抗体（antibody Ab）是由抗原致敏的B细胞分化为浆细胞产生的病能与相应的抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
Ab存在于血清、其他体液或外分泌液中，在血清中的浓度最高。
5、免疫球蛋白(Immunoglobuling，Ig)具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白；Ig是化学结构的概念，它包括正常的抗体球蛋白和尚未证实有抗体活性但结构与抗体相似的球蛋白。
6、多克隆抗体：由多个克隆细胞产生的多种抗体的混合物即多克隆抗体，也称第一代人工抗体7、单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)：由一个克隆B细胞产生的、只作用于单一抗原表位的高度特异性抗体称为单克隆抗体。
红细胞凝集试验
(二) 间接血凝试验和反向间接血凝试验1.原理凝集反应中抗体球蛋白分子与其特异的抗原相遇时，在一的条件下，便可形成抗原抗体的复合物，由于这种复合物分子团很小，如果抗原抗体的含量过少时，则不够形成肉眼可的凝集。
若设法将抗原结合或吸附到比其体积大千万倍的红细胞表面上，则只要少量的抗体就可以使红细胞通过抗原抗体的特异性结合而出现肉眼可见的凝集现象。
这就大大地提高了凝集反应的敏感性。
于是人们将红细胞经过鞣酸或其他偶联剂处理后，使得多糖抗原或蛋白质抗原被红细胞表面的受体结合或吸附，这种被抗原致敏的红细胞遇到相应的抗体时，在一定的条件下，由于抗原抗体的特异性结合而间接地带动着红细胞的凝集，这一反应称为间血凝反应。
若在抗血清中先加入与致敏血球相同的抗原，在一定的条件下，经过一定时间后再加上这种抗原致敏的红细胞就不再发生红细胞的凝集，即抑制了原有的血凝反应，这种现象称为间接血凝抑制反应。
同样，如果用抗体球蛋白致敏红细胞上，也能与相应的抗原在一定的条件下起凝集反应，这称为反向间接血凝试验。
当在与致敏红细胞的抗体相应的抗原液中，先加入相应的特异性抗体，在一定的条件下，经过一定的时间后再加入这种抗体致敏的红细胞，由于抗原先和特异性抗体结合，这种抗体致敏的红细胞就不能与抗原起反应，呈现血凝抑制现象，这叫反向凝抑制试验。
见图2-13、2-14。
一般抗原致敏红细胞比较容易，而用抗体致敏红细胞比较困难，主要原因是抗血清中蛋白质的成分很复杂，其中除了具有抗体活性的免球蛋白之外，还有非抗体活性的免疫球蛋白，这两种免疫球蛋白很难使之分开，而且这两种免疫球蛋白均能同时结合或吸附在红细胞表面，一旦非抗体活性免疫球蛋白在红细胞表面达到一定数量时，致敏的红细胞就不能再与相应的抗原形成可见的凝集。
因此，一般实验室均用抗原来致敏红细胞。
2.材料(1) 红细胞悬液很多动物的红细胞，如绵羊、家兔、鸡、鸽了、马、猴子及人的O型血都可用来作为间接血凝试验的红细胞载体，实验室多选用绵羊细胞。
临床医学检验技术(师)：凝集反应考试试题
临床医学检验技术(师)：凝集反应考试试题1、单选引起冷凝集素综合征的自身抗体主要是（）A.IgAB.IgGC.IgMD.IgEE.IgD正确答案：C参考解析：本题要点是冷凝集素综合征的特点。
冷凝集素综（江南博哥）合征是免疫球蛋白M（IgM）抗体引起的自身免疫性疾病，其特点是在较低的温度下，这种抗体能作用于患者自己的红细胞，在体内发生凝集，阻塞末梢微循环，发生手足发绀症或溶血。
在体外，抗体与抗原发生作用的最适宜温度是0~4℃，在37℃或30℃以上的温度，抗体与红细胞抗原发生可逆的分解，症状迅速消失。
2、单选根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝聚反应方式，间接凝集反应不包括（）A.正向间接凝集反应B.反向间接凝集反应C.间接凝集抑制反应D.协同凝集反应E.间接血细胞凝集反应正确答案：E参考解析：根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝聚反应的方式，间接凝集反应可分为正向间接凝集反应、反向间接凝集反应、间接凝集抑制反应、协同凝集反应。
3、单选Coombs试验的直接法和间接法的主要区别是（）A.前者是检测完全抗体，后者是检测不完全抗体B.前者是凝集反应，后者是沉淀反应C.两者判断结果的方法不同D.前者是检测IgG型抗体，后者是检测IgM型抗体E.前者是检测在体内已致敏的红细胞上的不完全抗体，后者是检测游离在血清中的不完全抗体正确答案：E参考解析：抗人球蛋白参与的血凝试验包括直接Coombs试验和间接Coombs试验，分别检测红细胞上的不完全抗体和游离在血清中的不完全抗体。
4、单选冷凝集试验使用的红细胞是（）A.O型红细胞B.AB型红细胞C.A型红细胞D.B型红细胞E.绵羊红细胞正确答案：A参考解析：由肺炎支原体感染引起的原发性非典型肺炎患者的血清中常含有较高的冷凝集素，它能与患者自身红细胞或O型人红细胞于4℃条件下发生凝集，在37℃时又呈可逆性完全散开。
5、单选将红细胞悬液分别加到血型卡的两个区域内，再分别加入抗"A"和抗"B"血清，检测结果：血"AB"型。
血清学试验方法。
血清学试验方法。
以血清学试验方法血清学试验是一种常用的诊断和研究疾病的方法，通过检测血液中的抗体或抗原来判断机体免疫状态以及感染情况。
本文将介绍血清学试验的基本原理、常用的血清学试验方法以及其在临床和科学研究中的应用。
一、血清学试验的基本原理血清学试验基于机体免疫系统的特性，通过检测血液中的抗体和抗原来判断机体的免疫状态。
抗体是机体对抗原产生的一种特异性免疫应答物质，可以与抗原结合形成可见的免疫复合物。
血清学试验利用这种抗原与抗体的特异性结合关系，通过不同的方法来检测和测定血液中的抗体或抗原，从而获得有关机体免疫状态和感染情况的信息。
二、常用的血清学试验方法1. 免疫沉淀法：该方法利用抗原与抗体结合后形成的可见免疫复合物在溶液中的沉淀性质，通过观察沉淀现象来判断抗体和抗原的存在与否。
常见的应用包括免疫沉淀反应和双向免疫沉淀反应。
2. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA是一种高灵敏度、高特异性的血清学试验方法，常用于检测血液中的抗体或抗原。
该方法通过抗体与抗原结合形成复合物，再利用酶标记的二抗与复合物结合，最后通过底物的反应产生可见的颜色或荧光信号来定量检测。
3. 病毒中和试验：该试验主要用于检测抗体对病毒的中和作用。
通过将病毒与抗体混合后，观察病毒的感染和复制能力来判断抗体的中和效果。
病毒中和试验常用于病毒感染的诊断和疫苗效果的评估。
4. 血凝试验：该试验利用抗体与抗原结合后形成凝集反应，通过观察凝集现象来判断抗体和抗原的存在与否。
血凝试验常用于血型鉴定和某些感染性疾病的诊断。
三、血清学试验在临床应用中的意义血清学试验在临床应用中具有重要的意义。
首先，血清学试验可以用于疾病的早期诊断和筛查，如乙肝病毒感染的血清学检测可以早期发现感染者。
其次，血清学试验可以用于疾病的鉴别诊断，如通过检测自身抗体来判断自身免疫性疾病的类型。
此外，血清学试验还可以用于评估疫苗的效果、监测疾病的进展和判断治疗效果。
食品卫生七沙门氏菌检验三
四、实验步骤
1、在玻片一端加一滴沙门氏菌多价O血清，另一端加 一滴生理盐水。
2、用接种环自沙门氏菌可疑斜面上挑取少许细菌混入 生理盐水内，并搅匀；同法挑取少许细菌混入血清内， 搅匀。
3、将玻片略为摆动后静置室温中，1~3min后观察结果。
注：如果A-F多价O血清不凝集，应考虑是否有Vi抗原 阻止了O凝集反应，将待检菌液加热后（挑取菌苔于 1ml生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯上煮沸），再进 行A-F多价O血清凝集试验。
阴性：液体仍然混浊，无凝集块出现。
间接凝集反应：将可溶性抗原或抗体先吸 附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载 体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原 结合，在适量的电解质存在下，出现特异 性凝集现象，称为间接凝集反应。
三、器材
沙门氏菌A-F多价O血清 沙门氏菌可疑斜面培养物（TSI） 生理盐水、玻片、接种环、酒精灯等。
由于凝集反应方法简便，目前在临床检验中 仍被广泛应用。
直接凝集反应：细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当 最高稀释度仍有凝集现象者，为血清的效价，也称滴度，以表示血清中抗体的相对含量。
凝集反应是一种定性的检测方法，也可以进行半定量检测。
检42样℃匀1液电8h2～5m2L解4h＋M质M 参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称
注意：取细菌培养物时不宜过多，与免疫血清混合时，必须将
细菌涂散、涂均匀，但不宜将面积涂得过大，以免很快干涸而影
响结果观察
五、结果观察
阳性：液体变清，并有乳白色凝集块出现。 阴性：液体仍然混浊，无凝集块出现。 记录结果之后，将玻片放入指定容器内，切勿任意放置或
冲洗。
中华人民共和国国家标准
加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察 掌握玻片凝集反应的原理和应用；
沉淀反应与凝集反应
3. 影响因素：
琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则; 电泳终点时间的确定; 标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形; IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化）， 抵消了电渗作用。
二）技术要点：
制备琼脂板，打孔，加样于孔内，电泳2～3mA/cm ， 0.5～1h后，槽内加入相应抗血清作双向扩散。
三）影响因素
① 抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比; ② 抗血清的抗体谱，混合抗血清的使用; ③ 电泳条件直接影响分辨率。
四）应用
纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋的 识别与鉴定
对流免疫电泳
通电
蛋白质抗原常 带较强的负电 荷，在电场中 向正极移动 抗体球蛋白 带负电荷较少， 籍电渗作用向 负极泳动
－
＋
对流免疫电泳
结果分析：
• 无沉淀线出现则表明无相 应的抗原。 • 沉淀线位于抗原抗体孔中 间，说明两者比例较适合。 • 沉淀线偏向抗原孔一方， 表示抗体浓度＞抗原，反 之，则是抗体浓度＜抗原 浓度。
2.沉淀反应分两个阶段
第一阶段：
抗原抗体特异性结合，快速但不可见。
第二阶段：
形成肉眼可见的大的免疫复合物。
3.沉淀反应的类型
①液体内沉 淀试验 •免疫 浊度测 定 •絮状 沉淀试 验
②凝胶内沉 淀试验
③凝胶免疫 电泳技术
•对流免疫电泳 •火箭免疫电泳 •免疫电泳 •免疫固定电泳
•单向 扩散试 验 •双向 扩散试 验
•对新生儿溶血性贫血性疾病的诊断；
微生物检测
微生物试验检测设备仪器：酶标仪、显微镜、恒温培养箱、干燥箱、冰箱、冰柜、恒温水浴锅、离心机、离心沉淀器、微量振荡器、电子天平、生物天平、高压锅、超净工作台、煤气灶、煤气罐、移液器、酒精灯、手术剪、止血钳、镊子等。
实验检测项目：一、血清学1. 红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）操做方法2．凝集反应⑴鸡白痢和鸡伤寒的诊断⑵鸡霉形体的诊断3．免疫扩散试验（AGP）操作方法⑴鸡传染性囊病的诊断⑵鸡淋巴白血病的诊断二、孵化厅的微生物学检测1.种蛋表面的细菌检测2.绒毛的细菌检测3.终止胚的细菌检测4.一日龄雏鸡的健康检测5.空气中细菌的检测6.设备表面细菌的检测7.水样的细菌的检测三、鸡舍的细菌检测1.空气中细菌的检测2.物体表面细菌的检测3.水样的细菌检测4.垫料的细菌检测5.饲料的细菌检测四、消毒剂及其使用效果的测定五、细菌对药物的敏感性试验检测流程一、血清学1. 红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）操做方法1.1 红细胞凝集试验（HA）1.1.1 在“V”型微量反应板上进行。
每孔加入50微升（用微量进样器或将16号注射针头磨去斜尖，调整针头孔径使每滴恰好25微升）pH 7.2的0.01摩尔／升PBS液或生理盐水，向第1孔滴加新城疫抗原50微升，吸放3～5次混匀，然后从第一孔吸出50微升加入第二孔，以相同方法混匀，再从第二孔吸50微升加入第三孔，如此做倍比稀释至倒数第二孔，再从倒数第二孔吸出50微升弃去，最后一孔不加病毒（抗原）作为红细胞对照。
1.1.2 吸取0.5％鸡红细胞悬浮液，每孔滴加50微升，加毕后在微量振荡器上振荡15～30秒，使其混合均匀，静置室温下或37℃温箱中作用20～40分钟。
1.1.3 当对照孔红细胞全部沉入孔底中间，即可判定各孔的红细胞凝集情况。
以病毒最大的稀释度孔出现100％凝集现象者为这个病毒的凝集价，即一个血凝单位。
1.2 血凝抑制（HI）试验1.2.1 4单位抗原（病毒）的配制如上述血凝试验表中病毒的血凝价为第八孔（256，即1:256倍稀释），4个单位的病毒则除以4，即64倍（64）稀释即可。
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血清学凝集反应
颗粒性抗原（、红细胞等）与相应的抗体（）结合后，在电解质作用下形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应
（agglutinationreaction)。
其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
在该反应中，由于单位体积抗体量大，做定量试验时，应稀释抗体。
早在1933年，Lancefield就胜利地用多价血清对链球菌举行了分型。
随着抗体制备技术的进一步完美，尤其是单克隆抗体的制备，显然提高了细菌凝集试验的特异性，今日广泛用于细菌的分型和鉴定，如沙门氏菌、霍乱弧菌等。
(1)挺直凝集反应颗粒性抗原与相应抗体挺直结合所浮现的反应，称为挺直凝集反应(directagglutionreaction)。
①玻片凝集法：玻片凝集法是一种常规的定性实验办法，原理是用已知抗体来检测未知抗原。
常用于鉴定、血型。
如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分钟后若浮现肉眼可见的凝集块，即阳性反应，证实该菌是痢疾杆菌。
此法迅速、简便，但不能举行定量测定。
②试管凝集法：试管凝集法是一种定量实验办法。
多用已知抗本来检测血清中有无相应抗体及其含量。
常用于帮助诊断某些传染病及举行流行病学调查。
如肥达反应就是诊断伤寒、副伤寒的试管凝集实验。
由于要测定抗体的含量．故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度，然后加人等量抗原，37℃或56℃，2-4h观看，最高稀释度仍有显然凝集现象的，为该抗血清的凝集效价。
(2）间接凝集反应间接凝集反应又称乳胶凝集实验是将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒载体（红细胞或乳胶颗粒表面），制成致敏载体颗粒．然后与相立抗体（抗原）作用．在有电解质存在的条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应(indirectagglutination)因为载体增大了可溶性抗原的反应面积。
当载体上有少量抗原与抗体结合就浮现肉眼可见的反应，敏感性很高。
乳胶凝集实验可用于检测多种致病菌．许多致病菌如大肠埃希氏菌O157,金黄色葡萄球菌等都有乳胶凝集试剂盒。
【关键词】细菌凝集素血清上一篇：下一篇：
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