病毒学检验

绪论

◼ 病毒 是一类光学显微镜下不可见，专性细胞内寄生的非细胞型微生物。

特点：①极小（10~300 nm ）；②能与细胞受体结合；③酶系统缺失或不全；

④离体条件下以无生命的大分子形式存在；⑤通过复制进行增殖。

形态：多数呈球状或近似球状，少数为杆状、丝状、子弹状，细菌噬菌体呈蝌蚪状。

1. 病毒变异 包括遗传漂变和遗传转移。

◼ 遗传漂变

由于基因组复制时发生碱基变异所导致，其引起的抗原变异，称为抗原漂变。 ◼ 遗传转移 由于基因组重组（如片段交换）引起。——快速变异（如流感病毒）

第一章 细胞培养技术

一、细胞培养技术

◼ 细胞培养技术 是模拟体内生理环境条件，提供细胞适宜的营养和温度条件，在无菌操作的基础上，使立体组织细胞生长增殖并进行传代的技术。

1. 体外培养细胞的组织来源

（1）胚胎或成体组织；（2）正常或肿瘤组织

2. 体外培养细胞的生物学特性

（1）细胞异质性：来源于同一组织或不同组织的细胞之间均存在差异。

（2）细胞的增殖与分化

（3）细胞生长特征与形态

形态贴壁依赖性，分为上皮样细胞型（呈不规则多角形）、成纤维细胞型（梭形三角形） 生长接触性抑制→单层生长；密度抑制→停止生长

贴壁过程：重力作用→细胞下沉至瓶底→分泌细胞外基质和黏附分子→贴壁

适合于大规模细胞培养，便于细胞传代

3. 体外细胞培养生长增殖过程

（1）细胞周期：G 1期（DNA 合成前期）→S 期（DNA 合成期）→G 2期（分裂前期）→M 期（分裂前期）

（2）细胞一代周期：两次传代接种间隔的时间，分为迟缓期、对数期、平衡期和衰亡期。

根据贴壁状况、细胞界限、折光率、胞内颗粒来判断。

（3）细胞的生命周期

原代培养期：从初次培养到第一次传代培养。异质性→单一性

传代培养期：中间

衰亡期：出现细胞凋亡，即细胞程序性死亡。

4. 体外培养细胞的基本条件

（1）细胞接种——对数期的细胞

（2）营养物质——天然营养液、合成培养基

①天然培养液——主要为血清（血浆去除纤维蛋白）

作用：提供基本营养与结合蛋白；提供激素及各类生长因子；提供促进细胞壁的蛋白；提供抗损害的保护性物质；提供蛋白酶抑制物质；提供pH 缓冲物质。

②合成培养基——DMEM 、MEM 、RPMI1640

③无血清培养液

（3）酸碱度——7.0~7.4，主要为CO 2-NaHCO 3系统。

（4）气体——O 2和CO 2（5%）

（5）温度——35~37℃

（6） 水 ——去离子水或三蒸水（电阻率达到18.2MΩ·cm ）

（7）抗生素——青、链霉素或庆大霉素抑制细菌，两性霉素B 抑制真菌，卡那霉素抑制支原体

——持续渐进的

（8）实验室——正压状态（避免外界微生物污染）

（9）其他常用试剂

①平衡盐溶液（BSS）——Hanks、PBS，用于配制细胞生长液和含胰蛋白酶的基础溶液；洗涤组织和细胞。

②消化液——胰蛋白酶、EDTA、胰酶-EDTA消化液（时间过短不能充分解离细胞，过长易损害细胞）

③指示剂——0.4%的酚红溶液

④pH调整液——NaHCO3溶液

5. 实验流程

新鲜组织小块/单层细胞胰酶、EDTA

→ 单个细胞（细胞活力检测

→）生长条件

→贴瓶→繁殖(5%CO2培养)→观察

6. 细胞的冻存、复苏和运输

（1）冻存：对数期细胞、缓慢冰冻避免细胞受到严重损伤。

（2）复苏：快速融化。

7. 污染来源

（1）组织：分离的组织本身可能存在潜伏感染的病毒。

（2）血清和消化液：由于多来源于和，潜伏病毒或支原体。

（3）操作：周围环境或不规范操作。

（4）空气：空气微生物（如真菌孢子）。

（5）器材：要求无毒无害。

二、细胞培养技术在病毒学检验中的应用

1. 病毒的分离培养和鉴定

（1）敏感细胞——敏感性和可获得性——MDCK：狗肾细胞。

（2）标本前处理——无菌清液

（3）敏感细胞单层培养——生长液；标本接种——维持液。

（4）病毒鉴定方法

①细胞病变CPE：指病毒侵染敏感细胞后，细胞出现聚集、脱落、融合等改变。

包括细胞圆缩、细胞聚合、细胞融合形成合胞体。

②红细胞吸附试验

③干扰试验：一种病毒感染细胞后，可以干扰另一种病毒在该细胞内的增殖。

④中和试验：病毒被特异性标准血清中和。

2. 病毒定量检测

（1）空斑试验

第二章鸡胚和动物接种技术

一、鸡胚接种技术

优点：鸡胚为一机体；组织分化程度低，易于病毒繁殖；来源充足，很少携带细菌和病毒，不产生抗体。

缺点：鸡胚本身可能有病毒；不能对所有病毒进行接种培养；除痘病毒外，不产生特异性的感染指征；鸡胚内可能存有抗生素，抑制立克次体及鹦鹉热等病原体。

1. 鸡胚来源：健康来亨鸡受精卵，病毒接种选择无特定病原体鸡群（SPF鸡群）

2. 孵育温度：38~39℃；湿度：40~70%。

3. 鸡胚接种程序：检卵→划记号→消毒→打孔或开口→接种→封口→培养→收获

4. 接种途径与方法

（1）羊膜腔接种——从临床材料中分离流感病毒。

（2）绒毛尿囊膜接种——牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离→肉眼可见的斑点或痘疱状病灶。

（3）尿囊腔接种——流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养。

（4）卵黄囊接种——虫媒病毒、衣原体及立克次体等的分离与繁殖。