大鼠离体心脏灌流技术
介绍Langendorff离体心脏灌注装置在实验教学中的应用
介绍Langendorff离体心脏灌注装置在实验教学中的应用发表时间：2012-03-15T10:03:53.460Z 来源：《中外健康文摘》2011年第47期供稿作者：李树学周波康天济陈飞仲维娜陈莹宋春燕[导读] 心脏的张力反映心脏的收缩舒张等情况，观察心脏的功能活动以及药物对心脏的作用，同时能够分析其离子调节情况。
李树学周波康天济陈飞仲维娜陈莹宋春燕（黑龙江中医药大学黑龙江哈尔滨 150040）【摘要】 Langendorff离体心脏灌流装置是一套恒温恒压、受外界干扰因素较少的科研、教学实验装置，此实验装置能够排除在体实验中机体的神经和体液因素对心脏的影响，可控制性强，可以复制出不同的实验模型，也可运用于生理荮理病理生化等科研和实验教学中,对培养学生综合运用各科所学的知识和学生创新动手能力有着重要的意义，应将此应用于实验教学中。
【关键词】Langendorff 离体实验教学应用Langendorff离体心脏灌注装置是一套为小动物（如家兔、大鼠和豚鼠）心脏灌流而设计的一套实验装置，此装置对于心脏的内、外科研究具有非常重要的意义，同时在生理、电生理、病理生理、药理以及生物化学研究中已得到广泛地应用，对学生知识的综合运用、激发和培养学生的创新和创造能力也有着重要的意义，应该应用于学生的实验教学中，本文主要介绍langendorff离体心脏灌注装置在实验教学中的应用及其意义。
1 Langendorff离体心脏灌注装置应用于实验教学的背景1.1 Langendorff离体心脏灌注装置的简介Langendorff离体心脏灌注装置是一套为小动物（如家兔、大鼠和豚鼠）心脏灌流而设计的一套实验装置，在离体心脏灌流系统中，心脏被保存在具有温度控制系统的浴槽中，通过不同的控制环境（如一定的灌注压力、温度、酸碱度等）及各种因素（如营养物质、缺血、缺氧及药物等）观察对心脏活动的影响，还可以观察对冠脉流量的影响等，研究心脏功能的生理、电生理、病理生理、生物化学和药理学实验，对心脏的内外科研究有着重要的意义。
高渗盐液灌流对大鼠离体心脏功能的影响
高渗盐液灌流对大鼠离体心脏功能的影响
周继红;朱佩芳;刘大维;王正国
【期刊名称】《第三军医大学学报》
【年(卷),期】2000(22)5
【摘要】目的探讨不同浓度高渗盐液对心脏功能的影响。
方法采用大鼠离体灌流模型 ,用不同钠离子浓度的灌流液进行顺性灌注 2 0min ,随后再用等渗灌流液灌注 5min ,连续观察冠状动脉血流量、心率、心输出量 (CO)、动脉压及左心室功能等指标的变化 ,并测心脏含水率。
结果含 16 5mmol LNa+ 的灌流液可明显增加CO、改善心脏的收缩舒张功能 ;而用高于 2 15mmol LNa+ 的灌流液灌流时 ,最初有短暂但十分明显的心脏收缩舒张功能障碍 ,但 5～ 10min后恢复到正常水平以上 ;各组在由高渗灌流液换为等渗时心脏收缩舒张功能都非常显著的增强。
结论高渗盐液能直接作用于心脏。
【总页数】4页(P420-423)
【关键词】心脏功能;离体灌流;高渗盐水;大鼠
【作者】周继红;朱佩芳;刘大维;王正国
【作者单位】第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第四研究室
【正文语种】中文
【中图分类】R331.31
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大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
离体血管实验报告
一、实验目的1. 了解离体血管实验的基本原理和方法。
2. 观察和分析血管在不同理化因素作用下的变化。
3. 掌握实验数据的记录和分析方法。
二、实验原理离体血管实验是研究血管生理和病理生理的重要方法。
通过模拟体内环境，将血管取出体外，观察和分析血管在不同理化因素作用下的变化，从而揭示血管的生理和病理机制。
三、实验材料1. 动物：成年大鼠2. 实验仪器：手术显微镜、剪刀、镊子、注射器、针头、试管、离心机、CO2培养箱、显微镜等3. 实验试剂：生理盐水、肝素钠、RPMI-1640培养基、EDTA、NaOH、HCl等四、实验方法1. 取成年大鼠，处死并迅速取出心脏，将心脏放入含有生理盐水的容器中，清洗血管。
2. 使用手术显微镜和剪刀，将心脏周围的脂肪和结缔组织去除，暴露血管。
3. 使用镊子将血管从心脏上分离下来，剪成约2-3mm的血管段。
4. 将血管段放入含有肝素钠的生理盐水中，防止血管内血栓形成。
5. 将血管段放入含有RPMI-1640培养基的培养皿中，置于CO2培养箱中培养。
6. 根据实验目的，分别对血管进行以下处理：a. 调整培养基的pH值b. 调整培养基的温度c. 添加EDTAd. 添加NaOH或HCle. 添加不同浓度的药物7. 观察血管在不同处理下的变化，包括血管收缩、舒张、通透性等。
8. 使用显微镜观察血管的形态变化。
9. 收集实验数据，进行统计分析。
五、实验结果1. 调整培养基的pH值后，血管收缩程度明显增加。
2. 调整培养基的温度后，血管舒张程度明显增加。
3. 添加EDTA后，血管通透性增加，红细胞渗出。
4. 添加NaOH后，血管收缩程度增加。
5. 添加HCl后，血管舒张程度增加。
6. 添加不同浓度的药物后，血管收缩或舒张程度发生改变。
六、实验结论1. 离体血管实验可以模拟体内环境，研究血管在不同理化因素作用下的变化。
2. pH值、温度、EDTA、NaOH、HCl和药物等理化因素可以影响血管的收缩、舒张和通透性。
大鼠灌注取脑
大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。
2.冰冻切片可以不做脑组织固定。
3.不可用于western blot和PCR。
4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。
原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。
多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。
必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。
2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。
3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。
大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1)麻醉2)开胸3)心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取脑7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。
Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。
用1.0mol/L的NaOH 值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。
简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。
若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。
注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。
离体心脏灌流实验报告
一、实验目的1. 熟悉离体心脏灌流技术的基本操作。
2. 观察和分析不同生理、病理因素对离体心脏功能的影响。
3. 掌握记录和分析心脏功能指标的方法。
二、实验原理离体心脏灌流实验是生理学研究中常用的一种方法，通过将心脏从机体中取出，在体外模拟生理环境条件下进行灌流，观察和分析心脏功能的变化。
实验中，通过改变灌流液的成分、温度、pH值等条件，可以研究不同因素对心脏功能的影响。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：青蛙、蛙心夹、蛙板、蛙类手术器械、二道仪、任氏液、长滴管、铁支架、玻璃管、量筒、秒表等。
2. 实验仪器：显微镜、电子天平、恒温器、恒温水浴箱、高压消毒锅等。
四、实验方法与步骤1. 实验准备（1）取一只青蛙，用蛙类手术器械进行解剖，暴露心脏。
（2）将心脏夹在蛙心夹上，用线固定在蛙板上。
（3）在心脏主动脉下方穿一线，结扎并留出一段备用。
（4）将心脏主动脉左支结扎，于动脉圆锥处剪一向心斜切口，插入灌流管。
2. 灌流实验（1）将灌流管一端插入恒温器中的任氏液中，另一端与心脏主动脉相连。
（2）调整恒温器，使任氏液温度保持恒定。
（3）开启灌流泵，使任氏液以恒定速度灌流心脏。
（4）观察心脏收缩情况，记录心率、收缩幅度等指标。
（5）依次改变灌流液的成分、温度、pH值等条件，观察心脏功能的变化。
3. 实验数据记录与分析（1）记录不同灌流条件下心脏的心率、收缩幅度等指标。
（2）分析不同生理、病理因素对离体心脏功能的影响。
（3）绘制心脏功能曲线，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 灌流液中加入肾上腺素后，离体心脏心率加快，收缩幅度增强。
2. 灌流液中加入乙酰胆碱后，离体心脏心率减慢，收缩幅度减弱。
3. 降低灌流液温度后，离体心脏心率减慢，收缩幅度减弱。
4. 提高灌流液pH值后，离体心脏心率加快，收缩幅度增强。
六、实验结论1. 肾上腺素和乙酰胆碱对离体心脏功能具有调节作用，肾上腺素使心脏兴奋，乙酰胆碱使心脏抑制。
2. 温度和pH值对离体心脏功能有显著影响，低温和碱性环境有利于心脏功能的维持。
适用于Langendorff离体心脏灌流大鼠心肌梗死动物模型的建立
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心脏灌流实验报告
一、实验目的1. 学习离体心脏灌流技术的基本原理和方法。
2. 观察不同灌流液成分对离体心脏活动的影响。
3. 分析Na+、K+、Ca2+等离子及肾上腺素、乙酰胆碱等药物对心脏功能的作用。
二、实验原理离体心脏灌流实验是通过将离体心脏置于特定的灌流液中，模拟心脏在体内的生理环境，研究心脏生理功能的一种实验方法。
在实验过程中，通过改变灌流液的成分，可以观察心脏的收缩、舒张、心率、传导性等生理指标的变化，从而了解不同因素对心脏功能的影响。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：青蛙、常用手术器械、蛙板、蛙心夹、计算机采集系统、张力传感器、支架、双凹夹、双针形露丝刺激电极、滴管、培养皿、棉线、任氏液、0.65%NaCl、2%CaCl2、1%KCl、1:10000肾上腺素、1:10000乙酰胆碱、3%乳酸。
2. 实验仪器：手术显微镜、手术刀、镊子、剪刀、缝针、线、电子天平、量筒、移液器、秒表、温度计等。
四、实验方法与步骤1. 蛙心制备：- 取青蛙一只，用手术刀在颈部背侧切开皮肤，暴露心脏。
- 用镊子轻轻夹住心脏周围的组织，使其脱离周围组织。
- 将心脏置于蛙板上，用手术刀将心脏周围的血管和神经分离。
- 将心脏固定在蛙心夹上，连接张力传感器。
2. 灌流液准备：- 将任氏液、0.65%NaCl、2%CaCl2、1%KCl、1:10000肾上腺素、1:10000乙酰胆碱、3%乳酸等试剂按照实验要求配置好。
3. 实验操作：- 将蛙心置于任氏液中，调节温度至37℃。
- 用移液器将配置好的灌流液滴入蛙心，记录心脏的收缩、舒张、心率等生理指标。
- 依次更换灌流液，观察不同灌流液成分对心脏功能的影响。
- 记录实验数据，并进行统计分析。
4. 结果分析：- 分析不同灌流液成分对心脏收缩、舒张、心率等生理指标的影响。
- 分析Na+、K+、Ca2+等离子及肾上腺素、乙酰胆碱等药物对心脏功能的作用。
五、实验结果与分析1. 正常灌流液对心脏功能的影响：- 心脏在正常灌流液中呈现规律性的收缩和舒张，心率稳定。
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附录三 大鼠离体心脏灌流技术
大鼠离体心脏灌流（Langendorff）是研究离体心脏在人工控制条件下，观察各种因素（药物、缺氧、离子等）对大鼠心脏活动（心脏的收缩功能、舒张功能、冠脉流量、心肌电活动等）的影响的一种可靠方法。
心脏从大鼠体内摘出之后，以一定压力、温度及充氧的生理溶液经主动脉根部流入进行灌流。
灌流液经冠状动脉口进入冠状血管营养心脏，维持心脏的节律活动。
灌流液经冠状血管进入右心房，然后由腔静脉口和肺动脉口流出，其流出量即为冠状血管的管流量。
离体心脏的节律性活动及心肌电活动变化可以通过记录系统进行记录和分析。
用Langendorff发灌流心脏，其节律性活动可维持较长的时间（一般可维持3~6h）。
仪器装置：仪器的核心部分是恒温、循环和浴槽三部分组成，一般进口这套设备需人民币十几万元。
我们教研室因经费十分紧张又急需这样的设备，针对这种情况，我们自行设计和制作出这套离体心脏灌流设备（见下图）。
经过反复的试验，验证了这套灌流装置无论在性能上、稳定性上都达到了要求，而且只用了二千元人民币。
循环装置
恒温装置
离体心脏及浴槽
操作步骤
1．摘取心脏
先准备好手术器械（手术剪1把、无勾镊1把、眼科剪1把、眼科镊1把、止血钳2把、50ml烧杯1个、5ml和20ml注射器各1个、1号缝合线等）和充氧之冷台氏液（4℃左右）。
将大鼠麻醉或颈部脱臼后，打开胸腔充分暴露心脏，轻轻提起心脏并迅速摘取心脏。
手术过程中注意不要损伤心脏。
主动脉根部要保留0.5cm长以备插管用。
心脏摘取后立刻置于预先准备好的充氧冷台氏液中，用手指轻压心室将腔内的血液排出，防止血块形成。
心脏停跳后迅速剪去心脏周围的组织，操作中注意避免损伤静脉窦。
2．灌流心脏
先将灌流系统的管道内充满台氏液（或其他灌流液），并连续充气（纯氧或O2 95%+CO2 5%的混合气体），灌流液温度保持在37℃。
将主动脉套进灌流管末端的动脉套管上并结扎
固定好。
套管进入主动脉不易过深，以免损伤主动脉瓣或堵住冠状动脉开口处影响冠状血管的灌流。
心脏经充氧的温台氏液灌流后，在1min内即可开始恢复跳动，起初心率较慢，常伴有心律失常，以后心率逐渐加快，心律失常消失，并心跳可稳定在300次/min左右，可维持数小时。
当灌流液充氧不够或酸碱度不适宜时，均可引起心脏机能的降低，主要表现为心率减慢、心室做工能力减弱，甚至出现心脏僵硬导致心脏停跳。
为了保证心脏机能维持较长时间的正常活动，实验中必须注意下列事项。
注意事项：
1. 灌流液要保证有足够的氧，灌流压力要保持恒定。
在实验过程中如果发现心跳变慢、收缩力减弱时，要立刻检查氧的供应是否充足，灌流的压力是否足够，温度是否适宜。
如果发现心室肌发生僵硬，则说明心肌缺氧严重，一般不易恢复应终止实验。
2. 冠状血管要保持通畅。
通常引起冠状血管堵塞的主要原因有两个方面：①主动脉套管插的过深，堵塞了冠状动脉入口导致灌流不通畅。
导致灌流量明显减少，心率减慢、心缩力减弱。
经过及时调整可使心脏活动恢复正常。
②冠状血管内有小的栓子堵塞了小冠脉形成栓塞。
故在置备离体心脏的过程中，一方面要防止血液凝固，另一方面要把冠脉血管中的血液冲洗干净，最好是在手术前1~3h腹腔或静脉注射（1~2.5mg/kg体重）肝素，可有效防止冠脉内凝血。
③灌流液的选择：常用的溶液有Kreb-Hense-Leit氏液、台氏液、洛氏液、修正洛氏液等。
修正洛氏液中的NaHCO3的含量为0.15g/L，而洛氏液中的NaHCO3含量为0.67g/L，其他成分相同。
用修正洛氏液惊醒离体心脏的灌流，能维持心脏较长时间的正常活动，只充氧不需要加二氧化碳，且充氧之后也不需再测定酸碱度故较简便。
（王跃民、裴建明）。