大鼠冰冻切片
课题_大鼠冰冻切片
+ 未经固定的组织切片时冰晶较多，这是公
认的事实，即使固定后的组织切片仍然会 有一定的冰晶，为防止冰晶的形成，常可 采取如下方法： 1.速冻法：将组织置入低 温环境，使组织骤然降温。2.利用高渗溶液 吸收组织分子：将组织置于20% ——30%的 蔗糖溶液中， 置4摄氏度冰箱足够时间，观 察组织快，待其沉底后，取出切片。这样 即可大大减少冰晶的形成。
+ 冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的
固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切 片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹 干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未 经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核 内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后 镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于 载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这 样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变 化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻 切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染 色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。
+ 破碎的组织切片必然丢失实验信息，切片的完整性对研究结果的分析
无疑十分重要。切片破碎不全、有缺损的常见原因有： 1组织固定不 完全； 2温度设置不当。组织块过冷、过硬，则切片就容易破碎。组 织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同样易粘、易碎；3组织 块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多；4 切片刀钝或较脏，切片出现 刮痕，使切片不完整；5操作手法不当，如速度不适宜，切片也可能 不完整。遇到上述情况，应有针对性的采取相应的措施。如注意组织 固定充分、尽量减少冰晶的形成，保持刀片的清洁与锋利，冷冻温度 要适宜，不同的组织应设置不同的温度，如较大组织块或含有较多脂 肪的组织应设置温度相对较低 ，冷冻时间稍长些。而脑、脊髓等温度 设置相对高些有作者采用“边冻边切”法制作切片，同样也取得较好 的效果。若组织带有不必要的皮肤或包膜，应尽量去除干净；如必须 保留皮肤或包膜，应注意采取相应的切片技术，如最好将皮肤或包膜 的平面与刀面垂直。此外，在切片时，应注意速度均匀。当然，要做 好这些，必须有一定的实践经验。
大鼠肾脏冰冻切片的体会
大鼠肾脏冰冻切片的体会【中图分类号】R５８７．２【文献标识码】B【文章编号】１００１－５３０２(２０１５)０９－０８５７－０１０．引言由于肾脏组织质地柔软,含水量高,或在取材过程中肾组织与水分接触, 突遇低温,易形成冰晶,快速冷冻切片的制作难度大,我们通过对大鼠肾脏的冰冻制片,总结经验如下. １材料使用德国产Leica—CM１９５０型冰冻切片机,Leica一次性刀片,冷冻组织包埋剂(O．C．T．),AF固定液,改良Gill苏木素染色液,２％碳酸氢钠返蓝液,逐级梯度酒精,中性树胶. ２方法２．１取材及包埋２．１．１取新鲜大鼠肾脏标本常规取材,标本要新鲜,无需固定,严禁浸入甲醛, 酒精,生理盐水等液,尤其是不可以用酒精固定,酒精固定后组织将无法冷冻.２．１．２将样本托放入冰冻切片机的冻台上预冷,加少许O．C．T．,在OCT 未完全冻结前快速的将组织放于样本托上,在组织周围适量的补充O．C．T,待包埋剂约１/３未冻结时压上冷冻锤,打开加强冷冻,使组织快速冷冻.２．１．３冰冻切片机温度设定在－１６oC—－１８oC为宜.冷冻时间一般为１min~２min.冷冻时间过长,组织易变硬变脆,细胞结构会发生改变,难于切片.２．１．４包埋组织时应将组织周边多留出O．C．T．用于牵引展开切片,O．C．T．中的小气泡应尽量去除,以免切片时挤压旁边组织产生皱褶,影响切片效果. ２．２切片组织切片厚度设定为５um－６um.刀具提前安放好,调整好刀具角度,切片时控制好操作窗,以利保温.肾脏组织细胞比较致密,若时间过长会变脆且易碎,在冰冻切片时可用手指轻压组织回温,再进行切片.２．３固定切片后立即放入AF固定液固定３０s—１min,不可待切片干后再固定,这样会造成细胞核染色质不清晰,呈现毛玻璃样改变,细胞胞浆边界不清等组织细胞的退变现象. ２．４染色封片固定好的冰冻切片在苏木素染液中染色３０s—５０s,经１％盐酸分化,２％碳酸氢钠水溶液返蓝,伊红染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片. 制好的切片核浆对比分明,红蓝适度,颜色鲜艳,达到理想染色效果.３讨论与分析:３．１冰晶是由于冷冻缓慢,冷冻时间过长,胞质内与组织间隙未结合的水分析出形成的.肾脏因其组织结构,在组织冷冻过程中,组织内易产生大量的冰晶影响冰冻切片的诊断,为了防止组织内冰晶的产生,最佳的办法一是使用冻锤:新鲜标本包埋后放入冷冻台时,不能将冻锤马上按压在组织上,那样会使组织受挤压变形.应该待O．C．T．凝固６０％~７０％时,再将冻锤轻压在组织上, 这样既能防止冰晶的产生,又能得到较平整的切面;另一种方法为使用液氮冷冻,可将组织放入液氮中２s－３s,待组织冻至８０％时即可取出制片,否则过冻会引起组织发脆,冻头与组织分离[２]. ３．２将包埋剂放入－１０OC或－４OC冰箱内保存,包埋剂要使用OCT,而不能用胶水等替代,因OCT的主要成分为PVP,其能通过渗透的作用将细胞内的水分移出,减少冰晶形成.３．３冰冻的速度与样品的表面积和体积成正比,取材时组织块尽可能薄,０．２cm 为宜,扁平状冷冻速度快,切片的前几张冰晶少,越后冰晶越多,切片不能求快,而要确保切片质量,力争一次完成一张高质量的切片[１]. ３．４可预先做好OCT冻头,将冻头上的OCT 修平,有利于将组织放平,再在冰冻机内在肾组织上滴加OCT,有利于OCT迅速降温,避免组织复温,减少冰晶形成. ３．５肾脏冰冻制片时易产生不规则裂痕,与切片时温度和切片速度有关,操作时应注意操作窗不要开太大,免工作箱的温度升高;OCT的用量太少易产本皱褶,滴加OCT时要上下俩端多,俩侧少,同时要注意OCT不要有小气泡. ３．６冰冻切片机应安放在冷室内,避免压缩机反复工作,仪器要定期维护,除霜,清洁消毒.总之,冰冻切片技术是病理科最重要的常规工作之一,也是较难掌握的病理实验技术.要做好一张冰冻切片需要病理技术人员具有严格的责任心、严谨的工作态度、丰富的工作实践经验[３]在日常的工作中还需不断摸索经验提高切片质量,冰冻切片不仅要求病理技师在短时间内制出高质量的切片,还需要病理技师具有娴熟的技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用.参考文献[１]陈乐真,徐庆中,陈国璋手术中病理诊断图鉴１版北京:科学技术文献出版社,２００５:２(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[２]范慧,陈立华,刘宇冷冻切片的制作体会及常见问题分析．诊断病理学杂志,２００８,１３８(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[３]吴艳霞．冰冻切片的制作方法分析．吉林医学,２００９,３０(６):４９３．。
大鼠脊神经结扎术手术步骤
①位于双侧髂前上棘连线大约为L4/5横突后,手术周围5cm范围剃毛,常规消毒皮肤,铺孔巾。
②以大鼠两骸前上脊连线的中点作中线,中线旁往左5mm,在L5-S1水平做一长约2cm的纵行切口,钝性分离皮下组织和椎旁肌肉。
③钝性分离至暴露L6下关节突,充分显露L6横突。
④用刮骨刀将L6横突周围的肌肉和结缔组织清除干净,暴露骨性结构。
⑤用小咬骨钳小心的咬除L6横突,仔细的分离L6横突下的筋膜,暴露下方的L4和L5神经,L4和L5神经以一定的夹角并排行走,通常靠里靠下粗大的神经为L5,操作时避免触碰到L4神经。
（可以先找坐骨神经，3分支时，中间的是坐骨神经，4分支时。
上2是坐骨神经）⑥用玻璃分针将L5神经充分的游离出来,用镊子将6-0铬肠线穿过L5神经并紧紧的打上两个结,在线结远端5mm处将L5神经剪断。
⑦用无菌生理盐水冲洗伤口,充分止血,擦干血渍,确认无活动性出血后,在伤口洒上链霉素粉防止术后伤口感染,逐层缝合伤口。
⑧手术后将大鼠置于温暖干净的鼠笼中苏醒,并给予自由进食和饮水。
⑨假手术组在进行套线后,不结扎剪断神经,其它步骤与手术组完全一样。
每天检查一次后续L5脊神经结扎的第十天,对大鼠行为学测试后,用戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔麻醉。
打开胸腔,暴露其心脏,向左心室插入灌流针管,用止血钳将针管固定。
用憐酸盐缓冲液(O.Olmol/LPBS, pH7.4)冲洗大鼠体内血液。
再用4%多聚甲酸的磷酸盐缓冲液灌流、固定。
待大鼠组织固定后,取脊髓腰膨大节段,放在4%多聚甲醛中4°C冰箱内固定4小时。
后将脊髓转移到30%蔗糖溶液中,4°C冰箱脱水至组织下沉。
用冰冻切片机切片,脊髓厚度为35tim。
切好后将组织贴于载玻片上,放进一2(rc冰箱保存。
用PBS冲洗切片三次,每次7 —10分钟。
然后孵育一抗二抗4.2.1提取脊髓背角上蛋白大鼠断头,取脊髓腰膨大处脊髓背角侧半,保留SNL侧。
然后在装有液氮的碾钵中将组织碾磨成粉末状,移入EP管内,加入蛋白提取试剂,混合均勻放在冰上反应30min。
冰冻切片和石蜡切片对免疫组化染色效果的对比分析
冰冻切片和石蜡切片对免疫组化染色效果的对比分析方雪松【期刊名称】《中外医疗》【年(卷),期】2017(036)013【摘要】目的研究皮肤、肉芽组织采用石蜡切片以及冰冻切片免疫组化的染色效果.方法 2014年8月—2016年8月期间选取Wistar大鼠共60只,双盲法随机分为A、B两组各30只.实验前对60只大鼠进行背部切割伤,脱毛后在每只大鼠背部切割伤部位取1 cm×1 cm大小的皮肤块作为标本,A组大鼠皮肤块标本采用石蜡制片,B组大鼠皮肤块标本采用冰冻制片.对两组大鼠标本切片进行免疫组化染色,观察两组大鼠标本切片染色情况.结果 B组SP、EGF、EGFR以及FGF强阳性率分别为96.67%、100.00%、96.67%、93.33%,明显高于A组的0.00%(P<0.05).A1组抗原活性阳性率分别为93.33%、96.67%、93.33%、100.00%.明显高于A2组的13.33%、13.33%、3.33%、6.67%以及A3组的10.00%、16.67%、13.33%、3.33%(P<0.05).B1组EGF、FGF抗原活性强阳性率分别为100.00%、93.33%,高于B2组的6.67%、3.33%(P<0.05).结论冰冻制片免疫组化染色效果更佳,值得临床应用及推广.【总页数】3页(P16-18)【作者】方雪松【作者单位】安徽省立医院病理科,安徽合肥 230001【正文语种】中文【中图分类】R5【相关文献】1.卵巢肿瘤快速冰冻切片与石蜡切片病理诊断的对比分析 [J], 郭玲;董兵卫;黄明2.冰冻切片抗体在石蜡切片免疫组化中的应用 [J], 赵培荣;王一菱;吴景兰;宫璀璀3.脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较 [J], 钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪4.冰冻,石蜡切片ATP酶酶染色效果的对比观察 [J], 刘绍霖;侯文5.改良硬脂酸石蜡切片的免疫组化染色效果观察 [J], 胡小安;卢静;张润;戴瑜珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
冰冻切片法破碎大鼠心肌组织提取RNA的实验研究
用于免疫荧光染色的大鼠视网膜冰冻切片的制作体会
［ 关键词 ］ Ｓ Ｄ大鼠 ；视 网膜 ；冰冻切 片；免疫 荧光 ［ 中图分类号 ］ Ｒ ７ ７ ４ ． １ ３ ［ 文献标识码 ］ Ａ ［ 文章 编号 ］ １ ０ ０ ８— ２ ３ ４ ４ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ３— ０ １ ６ ２— ０ ２
ｄ ｏ ｉ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ８— ２ ３ ４． ２ ０ １ ４ ． ０ ３ ． ０ １ ２
Ｐｒ ｏ ｄｕｃ ｔ ｉ ｏｎ ｏ ｆ Ｒａ ｔ Ｒｅ ｉｎａ ｔ Ｆｒ ｏ ｚ ｅ ｎ Ｓ ｅ ｃ ｉｏｎ ｔ Ｕｓ ｅ ｄ ｆ ｏ ｒ Ｉ ｍｍｕ ｎｏ ｌｕｏ ｆ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎｃ ｅ Ｓｔ ａｉ ｎｉ ｎ ｇ
用荧光显微 镜观 察其细胞排列及标记状 况。结果 ：完整眼球视 网膜结构形 态可保持相对规 则 ，但 偶 尔发生组 织牵拉 ；玻 璃
体 去除的视 杯标本免疫 荧光染 色结果相 对理 想。标 本厚度介于 ｌ ０～１ ２ ｍ冰冻切 片视 网膜血 管免疫荧光染 色结果优 于其他
厚度 者。结论 ：用于免疫 荧光的组织标本应尽量保持 其完整的 固有形 态，通过对 目标 结构的定性 、定位以及 定量 ，再现视
ｖ ｉ ｔ ｒ ｅ ｏ ｕ ｓ ｒ ｅ ｍｏ ｖ ａ ｌ ｗｅ ｒ ｅ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌ ｙ ｉ ｄｅ ａ １ ． Ａｎ ｄ ｔ ｈｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｏ ｆ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ｈ ｉ ｃ ｋ ｎｅ ｓ ｓ ｂｅ ｔ ｗｅ ｅ ｎ １ ０ —１ ２ ｍ ｗｅ ｒ ｅ ｓ ｕｐ ｅ ｒ ｉ ｏ ｒ ｔ ｏ ｏ ｔ ｈ ｅｒ ｓ． Ｃ ｏ ｎｃ ｌ ｕ－
冰冻切片实验技术
实验技术：组织切片的制备点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润仅供参考，谢绝转载，否则责任自负组织切片的制备二）切片方法-细节注意1 切片方法的选择光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。
1.1 冰冻切片是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。
冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。
冰晶小而多，对组织结构损害大。
因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。
具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。
用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。
将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。
此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。
②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
冰冻切片一般用恒冷切片机。
切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，进行短暂预固定干燥后贮存于低温。
【目的】组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。
【原理】苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。
大白鼠组织冰冻切片制备
大白鼠组织冰冻切片制备
肖全槐;陆锦标
【期刊名称】《吉林医药学院学报》
【年(卷),期】1995(000)003
【摘要】1 方法动物组织切片作为抗原底物检测自身抗体技术已被广泛应用,但抗原底物对实验结果影响很大,现就临床上常用作为抗原底物大白鼠组织切片制备作一探讨.取成年健康大白鼠,体重200g左右,断颈取心、肝、肾、胃、胰和骨骼肌等组织,生理盐水浸泡,去其脂肪、胃粘膜,心脏去掉心底、心尖留取中间部分并作纵向剖开.将经处理后的组织改切(?)2.0cm×0.5cm×0.5cm小块,用滤纸将
【总页数】1页(P202-202)
【作者】肖全槐;陆锦标
【作者单位】空军沈阳军械修理厂!沈阳市110021
【正文语种】中文
【中图分类】R361.2
【相关文献】
1.冰冻切片技术制作药用植物组织永久切片的研究 [J], 张建逵;王冰;许亮;康廷国
2.脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较 [J], 钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪
3.冰冻切片后剩余组织制作石蜡切片与常规石蜡切片的比较 [J], 班翔;黄淇;田云云;赵瑞波
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【操作步骤】
1．小鼠的灌注固定：动物经麻醉后开胸暴露心脏，经左心室先快速灌注生理盐水
(50mL左右)至流出液变清亮，然后换4％多聚甲醛继续灌注大约100ml至组织变硬。
2．取材：小心剥离脑组织，置广口瓶中用4％多聚甲醛后固定12～24h。
3．脱水：将标本移入30%蔗糖溶液（用4％多聚甲醛配制），4℃放置至组织块沉底
4．将少量包埋剂OCT滴加到标本台，放入恒冷箱切片机内至变白，然后取出快速将
表面用单面刀片修平。
5．用安全刀片将标本底部修平后迅速粘附于标本台，然后置入-24℃恒冷箱切片机的
冷冻台。
待组织略微发白时用OCT在标本表面涂一薄层，继续冷冻20min。
6．调好切片厚度后开始切片。
如果是采用漂片，切片厚度一般20～30μm，切好的片子可以连续收集也可以每隔5～6片收集一片，移入含4％多聚甲醛的6孔板、24孔板
或别的容器。
如果是准备做贴片，片厚一般10μm；可以连续裱片，也可以每隔5片或10片裱一片，贴好后放切片盒，50度左右烤片1小时使其贴牢.
7．将切好的片子放4℃保存备用。
做室旁核的话可以将脑袋反过来，在腹侧面，大概切掉视交叉前和下丘脑之后的部分、只保留中间部分然后连续切片就可以了。
如果是漂片，室旁核的部分切不了很多；如
果贴片那切出来的要多一点。
做免疫组化的话漂片就可以了。
液氮或低温冰箱里的冻存必须要有防冻液，否则必然切片会碎掉。