免疫荧光定量检测
免疫荧光定量检测仪可行性报告
随着国家经济的不断提升，国民生活水平的不断提高，居民对医疗的需求也在不断增加，重症医学科的发展已成为现代化医院综合救治能力提升的标志性体现，为紧跟医院的发展步伐，做好危重病人的积极救治，院领导已给予重症医学科较大支持，但目前我院重症医学科软硬件构建与卫生部关于“重症医学科规范性建构细则”规定相比较仍存在巨大差距，目前国内二级以上医院均配备了完善的床边快速检测设备，对于危重病人的即时检测（POCT）提供了极大的帮助。目前由于我院缺少床旁快速检测平台，无法及时完成危重病人的血液方面相关检测，造成病情无法及时得到有效的评估及针对性治疗，延误疾病的诊断及救治。为提升我院急危重症科的诊疗水平及危重患者抢救成功率，现申请配备床边免疫荧光定量检测仪1台。
床旁免疫荧光定量检测平台则具有以下优势：1.更便捷：全自动，可自动完成质控、吸样、稀释、混匀、测量、计算、打印报告全过程。 2.更精简：所需样本量小，支持全血、血清、血浆、尿液样本检测。更功能：具备样本随机插入功能，可随时进行急诊样本检测。3.更丰富：心肌标志物类项目：心肌蛋白cTnl、N末端B型钠尿肽原（NT-proBNP）、肌红蛋白MYO、肌酸激酶同工酶CK-MB、心肌损伤三项联检ctnl/CK-MB/MYO、D-二聚体（D-Dimer）等；炎症标志物类项目：降钙素原(PCT)、高敏C反应蛋白（hs-CRP）等；尿微量蛋白（MAU）等。
床旁免疫荧光定量检测平台在临床应用范围极为广泛，使用频率
极高，尤其对于急危重患者，可随时随地进行操作，对于急危重病人的早期诊断及针对性治疗起到至关重要作用，可显著提升诊断准确率，提升急危重症患者抢救成功率，从而产生较好的经济效益及社会效益。
以上为我科针对申购床旁免疫荧光定量检测平台可行性的评估报告，有不详之处望领导指正。床旁免疫荧光定量检测平台作为重症医学科必备基础高端设备，在科室发展中起到非常重要的作用，望领导给予最大的支持，予以配备1台品质优良的床旁免疫荧光定量检测仪，这将对我科建设及我院整体诊疗水平提高起到非常关键的推动作用。
感谢院领导的支持与关怀！
重症医学科
李太伟
2016-09-23
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能
时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能 时间分辨荧光免疫分析仪采用现代光学、机械、计算机等先进技术，通过标记离子螯合物产生的特异性荧光寿命长、强度高，消除本底干扰荧光；利用激发光波谱宽、荧光发射波谱窄，增强荧光强度，提高分辨率的原理，对临床免疫血样进行定量分析，为临床血样提供灵敏、准确、可靠的数据。 概述 时间分辨荧光免疫法所用的标记物是镧系元素螯合物，利用这类荧光物质荧光寿命长等特点，通过波长和时间两种分辨技术，有效排除了非特异本底荧光的干扰。 特点 1、灵敏度高； 2、标记物制备简单； 3、稳定性好； 4、标准曲线线性范围宽； 5、操作方便。 技术性能 电源：210～240V，50～60Hz；外型尺寸：550mm×600mm×270mm；重量：25 kg；灵敏度：10-13 mol/L；线性度：10-12～10-8 mol/L；快速测试：1秒/样；高稳定性：< ±1 %；工作制：连续运行；安全分类：I类；防电击程度：B型；熔断器：Φ5×20 5A。 应用领域 主要用于对人的血液和其它体液中的各种免疫检测项目进行定量分析，它可以适用与传染病检查、内分泌科检查、细胞学检查、肿瘤科检查等。随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，同时RIA的污染问题会越来越被重视，因此，时间分辨荧光分析法具有越来越大的应用空间。 产品特性产品参数 产品特点： 1) 采用进口光源、光学镜片及光电倍增管，保证检测结果的稳定性及可靠性； 2) 测试速度快，1秒／样本； 3) 标本灵活，适合任意份标本量； 4) 全中文软件，操作界面简便； 5) 是国内首家研发出成功，填补国内空白，并获得国家科技进步二等奖。 技术参数： 1) 测定原理：时间分辨 2) 激发光源：进口氙灯 3) 灵敏度: 10 -17 mol／孔（Eu 3+） 4) 线性范围：10 -13 mol／孔～10 -17 mol／孔 5) 高稳定性：＜5 % 6) 电源：AC 198～242V 50～60Hz 7) 外型尺寸：710mm×520mm×320mm
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织得采集、固定与保存: 采取组织后, 方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4?Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜 方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ) PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4?C保存于7０%乙醇中。 ２、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54?C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37?C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。 石蜡包埋: 保存于４?Ｃ70％乙醇中得组织样品 ↓ 80％乙醇1５ｍin ↓ 95%乙醇15 miｎ ↓ 1０0%乙醇15mｉｎ? 2 ↓ 1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin ↓ 二甲苯透明5-１0 min ↓ 1／２二甲苯１/2石蜡３0 min
↓ 石蜡(1) 1。5hｒ ↓ 石蜡(2) 1.5－２.5hr ↓ 石蜡(3) 包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2)20ｍin ↓ 100％乙醇20ｍin ↓ 95％乙醇10 min ↓ 8０％乙醇10miｎ ↓ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2 ↓ 0.4%Tritonx RＴ10 mｉn ↓ 切片在PＢS中浸泡 5 min＊3 ３％H２O2 RT １０ｍin
切片在PBS中浸泡５ｍｉn*3 0、25％胰酶RT １0min 切片在PBS中浸泡 5 min*３ Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn 倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗 一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ 取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３ 二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h 切片在PBS中浸泡５min*3 DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2) 如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。 切片浸入PBS终止显色,ＨE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15mｉn,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。 若颜色太深,可用0、１-０、5％盐酸乙醇分色1～2秒钟(或更久)
免疫组化和免疫荧光的区别[参照材料]
请问你曾经被IHC、ICC和IF所困扰过吗？ 作者：北京义翘神州 在实验中，有没有一种感觉，就是对免疫组化(IHC)，免疫细胞(ICC)，以及免疫荧光(IF)傻傻分不清，那么今天我们就来讨论一下这三者的区别，先贴图上来以便有个大致的区分。 从图中我们可以看出，免疫检测技术可以根据报告标签的不同，分为免疫化学和免疫荧光两类，而根据样品类型不同，可以分为组织和细胞检测技术。因此，才会延伸出三个相近的概念。 为了更好的区分这三个概念，我们还可以根据他们的英文词根来分析一下，他们的英文名分别是免疫组织化学Immunohistochemistry (IHC)，免疫细胞化学Immunocytochemistry (ICC)，免疫荧光Immunofluorescence (IF)。 词根分析： Immuno-指的是免疫技术（例如，抗体和抗原的结合） Histo-指的是组织（细胞以及它周围的细胞外基质） Cyto-指的是细胞（不包含细胞外的基质） Chemistry-在这里指的是化学检测方法（例如，颜色的变化）
Fluorescence-对被激发的荧光团的检测 通过对词根的解释，相信你在心中不再迷茫了吧。 这三个应用技术都属于免疫技术，都是将抗原与抗体的结合可视化，即通过一定的方法可以直接看到实验结果。而常用的方法就是化学显色和荧光显色。如果报告标签是酶促的，就是免疫化学，如果是荧光的，就是免疫荧光。 其实我们纠结免疫荧光的一个原因还在于免疫荧光的英文名字Immunofluorescence (IF)，但若是写成免疫组织荧光(IHF)或是免疫细胞荧光(ICF)，那我们是不是就豁然开朗了。虽然这两个词汇在英文文献中应用的还不是很广泛，但绝对不是我自己杜撰的哦，已经有些学者在使用了，规范化应该也只是时间的问题。 可能文字描述还是有些晦涩难懂，那我们就直接上图吧。先不看下面答案，仅从几张图片，你能明白哪张图代表哪种应用吗？ A免疫组织化学：兔EGFR单克隆抗体（10001-R043-50）—人胎盘
免疫荧光方法
（2）实验方法 （1）用PBS浸洗准备好的细胞涂片3次，每次3min。 （2）0.1%的TritonX-100（用PBS配制）处理涂片5-10min。 （3）PBS洗净载玻片上的TritonX-100，加0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液(用PBS 配制)孵育固定好的细胞30min。 （4）弃去BSA，滴加0.1%BSA稀释的一抗(1:200)，即软骨多糖诱导48hH22细胞免疫的小鼠血清，免疫湿盒中4℃过夜。同时用正常小鼠血清作对照。 （5）用PBS浸洗细胞涂片3次，每次3min，以确保一抗清洗彻底。 （6）避光条件下滴加BSA稀释的荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:200)，然后室温、暗室中孵育1.5-2h。 （7）PBS洗净荧光二抗，用荧光显微镜观察。 为了防止由于一抗未洗净带来的假阳性现象，实验中同时设置一组阴性对照，涂片染色操作步骤同上，把一抗换成PBS。 3.4.1.1免疫荧光染色法检测抗原、抗体结合情况将H22鼠肝癌细胞制成细胞涂片，分别以空白组小鼠血清、模型组小鼠血清和免疫组小鼠
血清为一抗，经荧光二抗染色后得到免疫荧光检测结果，并计算各组细胞的阳性表达率，结果如图3-1所示。 (a) (b) (c) (d)*P<0.01vs模型 组,#P<0.01 vs空白组图3-1免疫荧光染色法检测抗体生成 Fig.3-1 Theimmunofluorescent staining for antibody test图3-1中(a)、(b)、 (c)一抗分别为空白组小鼠血清、模型组小鼠血清、免疫成功小鼠血清， (d)为免疫荧光阳性表达率。从图3-1中可以看出，一抗为空白小鼠血清的荧光极弱，一抗为模型组小鼠血清的荧光仍然不强，而一抗为治
细胞免疫荧光步骤
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1 －2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿） 里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数 依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上 去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没 有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法 合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则 是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔 细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
免疫荧光检测
免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案） 荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。 抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。 抗核抗体实验原理 以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。 试剂与器材 1．抗原片现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下： (1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。
(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。干燥后，用无水乙醇固定。 (3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。-30℃保存备用。 2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。 3．L PBS 4．缓冲甘油取甘油9份加PBS 1份。 5.待测血清、阳性和阴性对照血清临床标本筛选获得。 6．器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等 操作方法 1．准备：检查加样板，生物载片恢复室温，标记。 2．稀释：PBS-Tween缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。 3．加样：加样板放于泡沫塑料板上，加25μl稀释后血清，至加样板的每一反应区，避免气泡。加完所有标本后开始温育。 4．温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30分钟。 5．冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。 6．加样：滴加20μl荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应区，完全加完方可继续温育。荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。
常用免疫学检验技术的基本原理
常用免疫学检验技术的基本原理 免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T 细胞的克隆扩增，并分泌特异性的免疫球蛋白（抗体）。由于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体）。免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。 最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散，通过观察抗原－抗体相遇时产生的沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达到诊断的目的。这种扩散可以是蛋白的自然扩散，例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散实验。单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体的凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内，让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散，当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。 利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性，可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散，例如免疫电泳试验和双向免疫电泳。免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成分依次分散开。然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原的混合抗体，让各抗原成分与相应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。然后利用标准的抗原－抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体）的鉴别。上述的方法都是利用肉眼观察抗原－抗体反应产生的沉淀，因此灵敏度有很大的局限。比浊法引入沉淀检测产生的免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原－抗体反应产生的浊度，根据标准曲线来计算抗原（或抗体）的含量。该方法不但大大提高了检测的灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量的检测。
(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类 完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合 体外抗原抗体反应又称血清学反应
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一
免疫荧光双标法
免疫荧光双标记在心肌石蜡切片中的应用 陈绪军肖明第吕志前卢成宝薛松袁忠祥徐根兴 作者单位：200080 上海市第一人民医院心血管外科 细胞性心肌塑型术（cellular cardiomyoplasty）用于缺血性心肌病的治疗受到人们越来越多的关注［1］，在证实移植的人干细胞在缺血/损伤的环境中分化为人心肌细胞方面，免疫荧光技术的运用逐渐增多，但多用的是新鲜冰冻切片，在石蜡心肌切片中应用较少，而且多是单一抗原的荧光标记［2］。有研究表明，酪胺信号放大( tyramide signal amplifications, TSA)技术可以提高反应的灵敏性［3］。为此，我们以人心肌石蜡切片标本为例，运用TSA－免疫荧光法与常规间接免疫荧光法分别对人心肌连接蛋白(connexin-43，Cx-43)蛋白及肌凝蛋白（myosin）进行标记，旨在为心肌石蜡切片建立一个免疫荧光双标记的方法。 一、材料与方法 1. 主要试剂：兔抗人肌凝蛋白（myosin）多克隆IgG抗体购自美国Chemicon 公司，标记异硫氰酸酯荧光素（FITC）的驴抗兔多克隆IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶（HRP）的驴抗小鼠多克隆IgG抗体均购自美国Jackson Immunity 公司, 小鼠抗人Cx-43单克隆抗体、碘化丙啶(PI)与牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma 公司，酪胺 (tyramide)-coumrian 结合物试剂盒购自美国PerkinElmer公司。 2．标本的取材、固定、切片及抗原修复: 人心肌取自一例6岁先天性心脏病小孩右房耳，中性福尔马林固定，4°C过夜固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5 μm石蜡切片。石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精浸泡后行抗原修复：浸入0.01 mol/L的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，95℃，浸泡30 min, 室温冷却10 min。 3．Cx-43的免疫荧光标记：采用TSA-免疫荧光法［4］，按试剂盒说明书进行。磷酸盐缓冲液（PBS）室温洗涤2次，每次5 min。置入3% 过氧化氢/甲醇溶液中，室温，孵育10 min。再室温PBS洗涤3次，每次5 min。 3%的BSA室温孵育30 min。加入小鼠抗人Cx-43单克隆IgG抗体，4℃孵育过夜。TnT缓冲液（0.1 mol/L Tri-HCI, pH 7.5, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% 吐温-20）室温洗涤3次，每次5 min。加入标记有HRP的驴抗小鼠IgG抗体，室温孵育1 h。TnT液室温洗涤3次，每次5 min。配制酪胺-coumrian 工作液：将酪氨-coumrian 结合物加入放大缓冲液中配成酪胺-coumrian 工作液（1∶50），避光，室温孵育15 min。再次TnT液洗涤3次。 4． Myosin的免疫荧光标记：接上一步。采用间接免疫荧光法［5］。兔抗人肌凝蛋白多克隆IgG抗体（1∶20）， 37°C孵育1 h，PBS洗涤3次。加入标记FITC的驴抗兔多克隆IgG抗体(1∶100)，避光，室温孵育1 h。PBS室温洗涤3次，每次5 min。 5．PI染细胞核：加入碘化丙啶（PI/PBS，1 μg/ml），室温避光孵育3 min。PBS室温洗涤3次后甘油封片。 6．荧光显微镜观察：运用带有3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜镜检：绿通道中观察FITC信号；蓝通道中观察coumrian信号；红通道中观察PI信号。图像的编辑采用Advanced SPOT 软件。 二、结果 在3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜中红、绿、蓝通道中分别可以观察到PI、FITC 及coumrian的信号，再经Advanced SPOT 软件叠加得到图1~4，红色代表PI标记的人心肌细胞核，绿色代表FITC标记的人心肌肌凝蛋白蛋白，蓝色为coumrian标记的人心肌Cx-43蛋白。图1显示为未加myosin抗体而加Cx-43抗体的人心肌石蜡切片; 图2中均加myosin 抗体与Cx-43抗体; 图3中加myosin抗体而未加入Cx-43抗体；图4均未加入 myosin抗体与Cx-43抗体。 三、讨论 1.心肌石蜡切片的免疫荧光双标记：在本研究中，图1与图2相比，人心肌石蜡切片中，不加myosin抗体的心肌纤维不着色，而加了myosin抗体的心肌纤维呈绿色，这表明心肌纤维被成功地标记上抗人myosin抗体，而且特异性高。Cx-43蛋白位于心肌细胞的周围，在本研究中由图1、图2与图3可以观察到，加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白呈
医学检验免疫学检验归纳总结
医学检验免疫学检验归纳 总结 -标准化文件发布号：（9556-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
三大免疫结合反应 直接凝集反应玻片凝集反应 试管凝集反应 间接凝集反应间接血凝试验 胶乳凝集试验 凝集反应 P47 明胶凝集试验 自身细胞凝集试验 抗球蛋白试验直接coombs试验（RBC膜上的不完全抗原） 间接coombs试验（血清中的游离抗原） 液体内沉淀试验絮状沉淀试验抗原稀释法 抗体稀释法 方针滴定法 免疫浊度测定 沉淀反应凝胶内沉淀试验单向扩散试验 双向扩散试验 免疫电泳技术对流免疫电泳 CIEP 火箭免疫电泳RIE 免疫电泳IEP 免疫固定电泳 交叉免疫电泳 三大标记技术 一、放射免疫：放射免疫：
免疫放射： 二、荧光免疫技术P81 荧时间分辨荧光免疫测定（方法）双抗体夹心法 光 免固相抗体竞争法 疫 分固相抗原竞争法 析 类 型 荧光偏振免疫测定测定 荧光酶免疫测定（方法）双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法 三、酶免疫技术 P95 酶免疫技术分类均相酶免疫测定 EMIT 克隆酶测定分析 异相酶免疫测定异相液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 酶联免疫吸附试验ELISA （方法）Ab 双抗体夹心法 双位点一步法 竞争法 Ag 间接法 双抗体夹心法 竞争法 捕获法 其他标记技术 化学发光免疫分析技术 CLIA 直接化学发光免疫分析CLIA P109 类型化学发光酶免疫分析CLEIA 电化学发光免疫分析ECLIA 生物素，亲和素放大技术 固相膜免疫测定试验IFA
免疫层析试验 ICA 膜免疫测定的种类斑点酶免疫吸附试验 DOT-ELISE 酶联免疫斑点试验 ELISPOT 免疫印迹法 IBT/EITB 放射免疫浊度试验 RIPA 免疫细胞 1、分离方法外周血单个核细胞分离 PBMC P161 淋巴细胞分离贴壁粘附法 吸附柱滤过法 磁铁吸引法 Percoll分离液法 T细胞和B 细胞的分离 E花环沉降法 尼龙毛柱分离法 T细胞亚群分离亲和板结合分离法 磁性微球分离法 荧光激法细胞分离仪分离法 2、免疫细胞表面标志的检测方法抗体致敏细胞花环法 P174 免疫细胞化学法 免疫荧光法 FCM 3、功能检测 T 细胞增殖试验方法形态学 P178 3H-TdR掺入法 淋巴细胞 T细胞 MTT比色法 CFSE（活细胞染料） T细胞分泌功能检测 T细胞介导的细胞毒性试验 体内试验 B细胞：B细胞增殖试验、溶血空斑实验、ELISPOT、体内试验 NK细胞：.......... 吞噬细胞...............
全自动荧光免疫分析仪工作原理
全自动荧光免疫分析仪 工作原理 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
一、基本结构 （一）按照反应装置的结构，自动生化分析仪主要分为流动式(FLOW SYSTEM)、分立式(DISCRETE SYSTEM)两大类。 1．流动式指测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应在同一管道流动的过程中完成。这是第一代自动生化分析仪。 2．分立式指各待测样品与试剂混合后的化学反应都是在各自的反应杯中完成。其中有几类分支。 (1)典型分立式自动生化分析仪。此型仪器应用最广。 (2)离心式自动生化分析仪，每个待测样品都是在离心力的作用下，在各自的反应槽内与试剂混合，完成化学反应并测定。由于混合，反应和检测几乎同时完成，它的分析效率较高。 3．袋式自动生化分析仪是以试剂袋来代替反应杯和比色杯，每个待测样品在各自的试剂袋内反应并测定。 4．固相试剂自定生化分析仪(亦称干化学式自动分析仪) 是将试剂固相于胶片或滤纸片等载体上，每个待测样品滴加在相应试纸条上进行反应及测定。操作快捷、便于携带是它的优点。 (二)典型分立式自动生化分析仪基本结构 1．样品(SAMPLE)系统 样品包括校准品、质控品和病人样品。系统一般由样品装载、输送和分配等装置组成。 样品装载和输送装置常见的类型有： (1)样品盘(SAMPLE DISK)，即放置样品的转盘有单圈或内外多圈，单独安置或与试剂转盘或反应转盘相套合，运行中与样品分配臂配合转动。有的采用更换式样品盘，分工作和待命区，其中放置多个弧形样品架(SECTOR)作转载台，仪器在测定中自动放置更换，均对样品盘上放置的样品杯或试管的高度、直径和深度有一定要求，有的需专用样品杯，有的可直接用采血试管。样品盘的装载数，以及校准品、质控品、常规样品和急诊样品的装载数，一般都是固定的。这些应根据工作需要选择。 (2)传动带式或轨道式进样即试管架(RACK)不连续，常为10个一架，靠步进马达驱动传送带，将试管架依次前移，再单架逐管横移至固定位置，由样品分配臂采样。
免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
免疫学检测原理
第二十一章免疫学检测原理 第一部分学习习题 一、填空题 1．抗原抗体反应的最大特点是_________。 2．颗粒性抗原与相应抗体结合后，可以发生_________反应；可溶性抗原与相应抗体结合后，在比例合适的情况下，可以发生_________反应。 3．细胞因子的检测可以分为_________、_________、_________三类。 二、多选题 [A型题] 1．抗原-抗体反应所不具有的特征是： A．分子表面的可逆结合 B．具有高度特异性 C．出现肉眼可见的反应需要适当的比例 D．二者结合后，立即出现可见反应 E. 二者反应受电解质、酸碱度和浓度的影响 2．检测可溶性抗原不能用： A．ELISA B．单向琼脂扩散 C．直接凝集反应 D．反向间接凝集反应 E．协同凝集试验 3.不属于抗原抗体反应的是： A. 酶联免疫吸附试验（ELISA） B．锡克试验
C．抗球蛋白试验 D．放射免疫分析法（RIA） E．E花环试验 4．乳胶妊娠诊断试验属于： A．协同凝集反应 B．反向间接凝集反应 C．直接凝集反应 D．间接凝集反应 E．间接凝集抑制反应 5．下列免疫学测定方法敏感性最高的是： A．沉淀反应 B．凝集反应 C．ELISA D．放射免疫测定 E．补体结合试验 6．抗原抗体反应最适宜的PH值为： A. 5—4.5 B．4.5—5 C．5—6 D．6—8 E．8—9 7．用免疫荧光技术间接法检测组织中的抗原，应将荧光素标记： A. 抗原 B相应抗 C．抗免疫球蛋白抗体 D．抗原-抗体复合物 E．抗C3抗体 8．用ELISA双抗体夹心法检测抗原A时，固相载体的包被物是： A. 酶标抗A抗体 B．未标记的抗A抗体 C．酶标抗原A D．未标记的抗球蛋白抗体 E．酶标抗球蛋白抗体 9．用免疫荧光技术直接法检测病原微生物时，荧光素应标记在： A. 微生物上 B．抗人Ig抗体上 C．抗原-抗体复合物上 D.抗微生物抗体上 E．抗C3抗体上 10．诊断DTH的皮肤试验，在前臂内注射少量可溶性抗原后，观察时间为：