不同的限制性内切酶所能形成的粘性末端不同
限制性内切酶
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。
它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。
另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。
限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。
实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。
在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。
该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。
因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。
从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。
但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。
虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。
经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。
突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。
二、限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类限制性内切酶首先由M.
（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型：
① 5’端凸出（如EcoR I切点） 5’3’5’3’GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
② 3’端凸出（如Pst I切点）
5’3’CTGCAG GACGTC -3’ -5’
A 用于核酸操作的工具酶
Enzymes
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶
第一节 限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶
（Restriction endonuclease） 是一类能够识别双链DNA分子中的某 种特定核苷酸序列（4—8bp），并由 此处切割DNA双链的核酸内切酶。
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau 3A 5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’ 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的 新位点一般不能再被原来的酶识别。 GATCT3’ 5’ -G BamH I Bgl Ⅱ A-5’ 3’-CCTAG 5’-GGATCT-3’ Bgl Ⅱ 3’-CCTAGA-5’ Sau 3A
？
BamH I
（7）限制酶的酶活性
限制性内切酶的识别和酶切活性一般在 一定的温度、离子强度、pH等条件下才 表现最佳切割能力和位点的专一性。
所以一般使用专一的反应缓冲液。 ① 星号（*）活性 如果改变反应条件就会影响酶的专一性 和切割效率，称为星号（*）活性。
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇
基因工程原理
基因工程原理内容提要1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。
基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”。
该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。
2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。
3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。
根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类。
Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。
第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。
4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。
基因工程中使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶连接酶和T4-DNA连接酶。
基因工程中使用的主要是T4DNA 连接酶，它是从T4噬菌体感染的中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。
5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。
6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。
粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。
平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。
同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。
限制性核酸内切酶
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变 的菌株。
3. 温度
齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具平头末端（不易重新连接）。
粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割， 有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。
粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或 同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。
粘性末端和平齐末端的动画对比
四 限制性内切酶的识别序列
• EcoRⅠ的识别序列 GAATTC
•
CTTAAG
• Hind Ⅲ的识别序列 AAGCTT
•
TTCGAA
• BamHⅠ的识别序列 GCATCC
•
CCTAGG
• 从以上举例的各种限制性酶切酶的识别序列看出， 它们具有共同的规律性，呈旋转对称或二重互补 对称。
• 有的限制性酶切酶可识别两种以上的核酸 序列。
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大 多数是37oC，少数要求40-65oC。
酶
最适 温度oC
酶
最适 温度oC
酶
Apa I 30 Apy I 30 Ban I Bcl I 50 BstE II 60 Mae I Mae II 50 Mae III 55 Sma I Taq I 65
最适 温度 oC
特性
限制和修饰活 性
内切酶的蛋白 结构
I类内切酶 单一多功能的酶 3种不同的亚基
限制性核酸内切酶的命名和类型3
② Dcm甲基化酶(DNA 引入甲基
CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自 身遗传物质和外来遗传物质的目的。
（3）限制与修饰系统相关的三个基因
① hsd R: 编码限制性内切酶 这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双 链DNA切断 ② hsd M: 编码限制性甲基化酶 这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化， 即起修饰 DNA的作用。 ③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达 作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。
3. 功能
自我保护作用
细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制
寄主的限制与修饰现象
phage λ (B) EOP=1
E.O.P 成斑率 efficiency of plating
EOP=10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
EOP=10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的
操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，
连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行 人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些 酶称之为“工具酶”。
第一节
限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统
2、限制性核酸内切酶的命名和类型
3、II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、影响限制性内切酶活性的因素
实际应用中，R常被省略。
Escherichia
Coli
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
若种名头 2个字母相同则其中一个可用种名的第一和
第三个字母。
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
基因工程作业1
基因工程作业1.同尾酶和同裂酶有何区别？同尾酶是指许多不同的限制性内切酶切割DNA长生的末端是相同，且是对称的，即它们可以产生相同的粘性末端，这些酶统称为同尾酶。
同裂酶是识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同，他切割的位点有以下几种①：同序同切酶，这些酶识别位点和切割位点都相同②：同序异切酶，识别的序列是相同的但它们的切割位点不同。
③：同功多位许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。
④：其他，识别的序列有交叉。
2.简述书上各种酶的催化活性与用途，上网查查是否还有其他工具酶，请在作业上用红色标明。
①：限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某一种特定的核苷酸序列，并在此处切割DNA双链的核酶作用：自我保护作用（细菌的修饰和保护系统）、在制备重组载体时经常用到限制性内切酶长生相同的粘性末端。
②：甲基化酶原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶，原核生物中的甲基化酶作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶切割，甲基化酶可以在腺嘌呤或者嘧啶上引入甲基。
在转录修复系统中有依赖甲基化的错配修复。
③：DNA聚合酶主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP的情况下）及其向辅的活性。
用途：合成大量的DNA、进行末端标记、补平末端。
④：连接酶就是将两段核酸连接起来的酶，主要作用是连接双链DNA中的缺口，及切口。
⑤：核酸酶有核酸内切酶和核酸外切酶核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。
分为单链核酸外切酶和双链核酸外切酶主要用途是催化单链DNA/RNA的降解，切掉双链中的单链区。
⑥反转录酶即依赖于RNA的DNA聚合酶，有5'-3'聚合酶活性,但没有有3'-5'的外切酶活性，主要作用：cDNA克隆中第一条链的合成、合成cDNA探针。
⑦琼脂糖酶：琼脂糖酶英文名称：agarase定义：催化琼脂糖的1，3-β-D-半乳糖糖苷键水解的酶。
ｄｎａ的限制性酶切反应
ＤＮＡ的限制性酶切反应实验目的学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
通过对DNA的酶切，学会设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。
Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。
Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。
故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶。
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。
体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。
其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)
p C A M B IA 1 3 0 2
10549 bp
Kan
Eco RV (6218)
大p肠BR杆3菌22复or制i 起始位点
pVS1-REP 农杆菌复制起始位点
二、限制性内切酶
1) 概念 2) 命名原则 3) 类型 4) 基本特性及用途 5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 6)Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项
实验原理
• 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为 限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附 近的特异位点上，并切割双链DNA。
限制性内切酶EcoR Ⅴ 特异性识别位点为：
GATATC CTATAG
产生平末端：
GAT ATC CTA TAG
则pCAMBIA1302经EcoR Ⅴ酶切后产生大小分别为：1600bp、 2624bp和6325bp的三条DNA 片段
属名
种名 株系
Haemophilus influenzae d
流感嗜血杆菌d株
HindⅡ HindⅢ
同一菌株中所含的多个不同的限制性核割特性、催化条件及是否具有修饰酶活 性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。
4) 基本特性及用途
Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切 方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′ 端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复 顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切 酶切割双链DNA产生3种不同的切口。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源 基因的插入。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源 DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
DNA 的限制性内切酶酶切分析
观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。
100bp DNA Marker 未酶切质粒
已酶切质 粒
点样孔
3000bp 1500bp 1000bp
500bp
2.96kp 1.9kp
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离 心到底部!
EcoR I
Bcl-2 (1.9kb)
操作步骤（改动）
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
质粒DNA
5ul
10U/ul EcoRI 2ul
掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h
2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓 冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。
3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽 (先胶布 封口，放好梳子)。 4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer
+5ul酶切产物 或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。 （点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示过5V/cm胶长度）
6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长
思考题：
1. DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请 说明原因。
2. 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前 两个实验，分析可能的原因
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使 反应体积大大增加，造成酶切失败
3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘油) ，每次吸取后 应放在冰盒，用完后立即放在-20℃，新购的大包装酶应先分装
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不同的限制性内切酶所能形成的粘性末端不同，具
有的的切割位点也不同，只用一个酶时，可能会从
某种基因的内部将其切开，从而破坏了其基因结
构。为避免出现这种情况，在获得目的基因时，一
般都采用将含有目的基因的DNA分子分成许多份，
每份用一种限制性内切酶处理，对受体和运载体也
采用同一种酶来进行切割，随后各自按照顺序进
行，最终检测结果，看用哪种酶切割的一组能够成
功。在全部实验中使用了多种酶，但是最终时或以
后的实验中就只需要使用一种酶了。
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5楼 大 中 小 发表于
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原帖由 沙漠狐 于 2008-5-17 16:48
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不同的限制性内切酶所能形成的粘性
末端不同，具有的的切割位点也不同，
只用一个酶时，可能会从某种基因的内
部将其切开，从而破坏了其基因结构。
为避免出现这种情况，在获得目的基因
时，一般都采用将含有目的基因的DNA
分子分成许 ...
非常正确！
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回复： 再问鸟枪法.
用的子弹不是同一种限制酶，可能在实验的过程中一直要用到最后一种限制
酶才能够剪切下完整的目的基因！
我的理解：树上有鸟但不知道其准确的位置，用火铳——鸟枪打过去，说不
定就会有收获。鸟枪法的应用的目的性不强原因就在这里。
我理解具体过程是这样的：
⒈①用A限制酶(鸟枪的子弹)来处理肯定含有目的基因的DNA材料(树)，会
得到许多的片断，这些片断可能是一些完整的基因也可能不是，当然也有可能正
好是所需要的目的基因，然后让这些片断分别与用同一种限制酶处理过的运载体
结合并导入受体细胞，看哪个受体细胞能够表达出目的基因相应的性状；②用B
限制酶(鸟枪的另一枚子弹)来处理相同的DNA材料(树)，会得到许多的与①中不
同的片断，...；③... ①②③...可以顺序进行也可以分组进行，如果是
顺序进行的话，一旦有个受体细胞能够表达出目的基因相应的性状的话，后续步
骤就不必进行了！（操作简便，但繁琐、盲目！）
⒉然后再用相同的限制酶(或A或B或C...)处理那个能够表达出目的基因
相应的性状的细胞，就可以得到目的基因了！
红色的部份是我与你理解不同之处，别的地方我们理解一样。我们的不同主要在于：限制性
内切酶是在基因内切还是在基因间区切开各个基因。如果是在基因间区切，则我们的结果一
样，如果是在基因内切，则你的想法正确。[/tr]
我的理解：被限制酶识别的是
DNA
中的特定的核苷酸序列，这个被识别的序列可能在基因间也有可能在基因内，被不同的限制
酶识别的核苷酸序列是不相同的。其实鸟枪法的真正目的，如其说是要找到目的基因，倒不
如说是要找到识别序列正好在目的基因两端的能够完整切下目的基因的限制性内切酶！