溶血素与补体激活实验报告
补体实验报告
补体结合实验原理：补体无特异性，可与任何抗原抗体复合物结合而被激活，但不能与单独的抗原或抗体结合。
补体结合试验是一种有补体参与，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应体系。
绵羊红细胞与溶血素结合后可激活补体，导致红细胞破坏，出现溶血现象。
参与补体结合反应的五种成分可分为两个系统：(1)检测系统，已知抗原（或抗体）、待测抗体（或抗原）；（2）指示系统，SRBC、溶血素。
待检测系统与补体作用后，加入指示系统，若不出现溶血，表示待测系统中的抗原抗体相对应；两者特异性结合形成抗原抗体复合物结合并消耗了补体，无游离的补体与指示系统结合，故不溶血，为补体结合试验阳性。
反之，若出现溶血，则为补体结合试验阴性。
方法：1.取五支试管，依次做好标记，放在试管架中。
2.按照下表加样。
结果：结果分析：1.羊血用前轻轻摇匀，避免剧烈正当引起溶血。
2.各种试剂的吸管不要混用。
3.补体的性质较不稳定，低温保存，加样时再从冰箱里取出。
4.水浴时避免水滴滴进试管。
5.本实验影响因素很多，对照组的反应情况是否正常是判断实验可信度的参照。
人外周血单个核细胞分离原理：常用来分离人外周血单个核细胞的分离液是由聚蔗糖和泛影葡胺按一定比例混合制成。
它分子量大又无化学活性，20摄氏度时比重约为1.077kg/L，淋巴细胞和单核细胞比重略小于分层液，为1.070kg/L左右。
而粒细胞和红细胞比重大，为1.092 kg/L左右。
通过离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，淋巴细胞和单核细胞位于分离液的上层，而粒细胞和红细胞沉于离心管的管底，从而将淋巴细胞和单核细胞等单个核细胞分离出来。
方法：1.抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液2.混匀后取3ml稀释液，沿试管壁缓慢加入到2ml分离液中。
2000rpm,离心20min。
3.小心吸取淋巴细胞层，加入2ml Hank’s液，2000rpm,离心10min。
4.弃上清，加入2ml Hank’s液。
补体含量测定实验报告
1. 学习补体活性测定的原理和方法。
2. 掌握补体活性的定量分析方法。
3. 了解补体含量在临床医学中的应用。
二、实验原理补体（Complement）是一组存在于人体血浆中的蛋白质，具有增强免疫应答、清除病原体等作用。
补体活性测定是评估机体免疫功能的重要指标之一。
本实验采用经典途径补体活性测定方法，通过检测溶血素在补体参与下的溶血活性，间接反映补体含量。
三、实验材料1. 试剂：溶血素、补体标准品、生理盐水、蒸馏水、抗人球蛋白抗体、酶标仪、微量移液器、比色皿等。
2. 仪器：离心机、恒温水浴箱、显微镜、离心管等。
四、实验方法1. 标准曲线的制备（1）将补体标准品稀释成不同浓度（如1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等）。
（2）将各浓度补体标准品与等量溶血素混合，置于37℃水浴箱中孵育30分钟。
（3）加入等量抗人球蛋白抗体，混匀，置于37℃水浴箱中孵育30分钟。
（4）加入生理盐水，终止反应。
（5）在酶标仪上检测各孔的吸光度（OD值）。
（6）以OD值为纵坐标，补体浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 样品检测（1）取一定量待测样品，按上述步骤进行稀释。
（2）重复上述步骤，检测样品的OD值。
（3）根据标准曲线，计算样品中补体的含量。
1. 标准曲线制备：根据实验数据绘制标准曲线，如图1所示。
图1 补体标准曲线2. 样品检测：根据标准曲线计算样品中补体的含量，结果如下表所示。
表1 样品补体含量检测结果样品编号补体含量（U/ml）1 32.52 27.03 24.54 20.05 16.5六、实验讨论1. 本实验采用经典途径补体活性测定方法，通过检测溶血素在补体参与下的溶血活性，间接反映补体含量。
2. 实验结果显示，样品中补体含量在16.5～32.5 U/ml之间，说明样品具有一定的补体活性。
3. 补体含量测定在临床医学中具有重要意义，如评估机体免疫功能、诊断某些疾病等。
七、实验总结1. 本实验成功制备了补体标准曲线，为后续样品检测提供了依据。
溶血实验
红细胞抗体，也称溶血素（3）补体
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3
当红细胞与相应抗体相结合，在电 解质存在时，可使红细胞产生凝集 现象；若同时加入新鲜动物血清， 则血清中的补体可与红细胞及其抗 体（溶血素）形成的免疫复合物结 合，从而激活补体导致红细胞溶解， 产生溶血现象。
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4
【实验材料】
1、抗原：2%绵羊红细胞（简称 SRBC）。
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1
薛 亚 （102015100பைடு நூலகம்） 付正阳 （1020151002） 王 淑 （1020151003） 李 飘 （1020151004）
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2
溶血实验
【实验目的】
了解补体的性质与作用。 分析结果及其意义。
【实验原理】
溶血反应是指补体参与的抗体致红细胞的 溶解反应.
参与反应的成分有：（1）红细胞（2）抗
① 0.5 0.5
0.5 0.5
② 0.5 0.5
--- 1.0
③ 0.5 ---
0.5 1.0
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6
2.将试管摇匀后置37℃水箱内：15— 30分钟，取出观察有无溶血现象。
3.管底无血球沉淀，液体红色透明管为 溶血。
【注意事项】
不要摇荡试管，红细胞离开机体是很容 易破裂的。
加样一定要精确，不要漏加。
2、抗体：溶血素（SRBC抗体）。 3、补体，新鲜豚鼠血清。 4、生理盐水。 5、小试管、刻度吸管、试管架、
37℃水溶箱等。
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5
【实验方法】
1、取小试管3支，编号后按表3-1加入各物 （容量单位均为ml）
表3-1 溶血试验加样表
管号 2%红细胞 溶血素（2单位） 补体（2单位） 生理盐水
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7
实验三 补体溶血实验教学提纲
实验三补体溶血实验
实验三补体溶血实验
一、实验目的：了解溶血反应的原理，掌握溶血反应的基本操作方法
二、实验原理：将绵羊红细胞做抗原注射家兔体内，经一定潜伏期，家兔血清中即出现特异
性抗体，此种抗体称溶血素，它可以与绵羊红细胞结合，此时若加入补体，即可激活补体的
经典途径，则呈现溶血现象。
三、实验材料
1、溶血素（1：1000)、补体（1：30)、绵羊红细胞（1%)、生理盐水
2、试管、吸管、试管架等
四、实验方法
1、按下表将试管4支排成一排，
2、震荡混匀，37℃水浴30分钟。
五、实验结果
实验管因发生溶血而变红色透明，其余管为红细胞悬液。
六、注意事项
1、取样品的吸管不可混用；加样力求准确；
2、SRBC吹匀后再加；
3、补体稳定性差：T、pH、连续吹打等都使活性下降，所以置于冰浴中，用时再取；加入补体后轻轻吹打。
溶血素结合形成抗原-抗体复合物经经典途径活化补体系统使绵羊
补体量
溶血程度与补体含量的关系
（二）CH50测定方法
实验材料 1．仪器：水浴箱、离心机。 2．材料：试管架、小试管、1毫升刻度吸 管、待测血清、2%绵羊红细胞悬液、溶血
素（2个单位）、pH7.4巴比妥缓冲液、
50%溶血标准管、记号笔等。
1．取洁净小试管10支，依次编号，置于试管架上。 2．取1ml刻度吸管4支，按下表加入各成分，摇匀。
0.50
2%SRBC (ml)
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
置37°水浴箱中水浴30min
根据肉眼观察选定所要离心的管号，2500r/min，离心5min
实验结果计算: 将离心后各管与50%溶血标准管比较，判 定50%溶血终点管。
1 × 血清稀释度 50%溶血终点管的血清用量
检血清作不同稀释后，加入反应体系，测定溶血程度，以
50%溶血时的最小血清用量作为判定终点，可测知补体总 溶血活性。
在适当、稳定的反应 系统中，溶血反应与补 体的剂量依赖关系呈现 “S”形曲线 在轻微溶血和接近完 全溶血时，补体量的变
化对溶血程度的影响不 大。但在30％～70%溶血 时，补体量只要出现较 小的变动，溶血程度就 会发生较大的改变
补体活性(U/ml)=
注意事项
1．待检血清必须新鲜； 2．实验器材必须洁净；
3．加液务必准确，吸管不能混用；
4．加绵羊红细胞时应摇匀； 5. 用过的吸管等放到指定位置。
（三）方法评价与临床意义
方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体 积成反比外，还与反应所用的缓冲液、SRBC的数量以及反 应温度有关 血清总补体活性的参考范围为50～100U/ml 血清总补体活性增高见于： 急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等 血清总补体活性降低见于： ①消耗增多:免疫复合物导致的补体活化和消耗增多 ,如SLE.
补体在溶血反应中的作用实验讨论
补体在溶血反应中的作用实验讨论
补体在溶血反应中起着重要的作用。
在溶血反应中，当红细胞与抗原相结合后，抗原与抗体结合的复合物会激活免疫系统中的补体系统。
补体系统的激活会引发一系列的反应，最终导致红细胞溶解。
具体来说，补体系统的激活分为经典途径和替代途径。
在经典途径中，抗体与抗原结合，形成免疫复合物后，一种叫做C1酶的补体蛋白会结合到免疫复合物上，激活后续的补体反应。
在替代途径中，补体蛋白C3通过蛋白质水解产生C3b，C3b结合至免疫复合物或直接与细菌表面结合，并进一步激活补体系统。
激活后的补体系统会形成膜攻击复合物（MAC），这些复合物能够插入到细菌或抗原溶血性红细胞的细胞膜上，破坏细胞膜完整性，导致细胞溶解。
此外，激活的补体还能激发炎症反应和吞噬细菌的过程。
在实验中，可以通过添加补体试剂来观察红细胞的溶解情况。
通过不同浓度的补体试剂与抗原结合形成免疫复合物，然后通过观察特定的溶血指标（如红细胞溶解度、血红蛋白释放量等）来评估补体的作用效果。
同时，还可以利用不同的实验条件探究补体系统的激活途径和对不同免疫复合物的作用差异。
总结来说，补体在溶血反应中的作用是通过激活补体系统，形成膜攻击复合物，破坏细胞膜完整性，导致红细胞的溶解。
补体活性检测、补体参与的溶血试验
补体活性检测、补体参与的溶血试验理解：1.补体的概念和性质2.补体的三条活化途径基本原理掌握：1.血清补体总活性测定的实验原理、实验方法2.补体结合实验的实验原理、实验方法3.各种补体检测方法的临床应用一、补体性质与活化途径（一）二、补体的概念补体（Complement，C）：是一组存在于血液和组织液中，具有级联酶促反应特征、不耐热的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充成分（二）补体系统的组成补体固有成分：如C1(q、r、s)、C2、C3……C9补体调节蛋白：如B因子、D因子、P因子、H因子补体受体：C3R，CR1，CR2等（三）补体的激活途径经典激活途径、旁路活化途径（四）补体的生物学功能1.细胞毒溶菌作用2.调理作用：C3b、iC3b、C4b3.炎症介质作用：C3a、C5a、C567生物学检测：总补体活性检测、单个补体活性检测免疫学检测：单个补体成分检测、补体受体成分检测二、血清补体总活性测定1.补体总活性测定原理反应系统的组成：抗原+Antibody->活化补体↓↓↓绵羊红细胞+溶血素+待检测补体↓溶血反应(1)溶血反应：通过经典途径或旁路途径激活的补体，作用于致敏红细胞，使红细胞表面形成若干孔，水分等进入红细胞，引起红细胞的肿胀破裂而溶血(2)CH50检测原理在溶血反应中，补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系以溶血百分率为纵坐标，相应补体含量为横坐标，溶血程度对补体含量依赖呈特殊的S型曲线以50％溶血作为终点指标，比100％溶血更为敏感，这一方法称为补体50％溶血试验（CH50）(3)CH50（50% complement hemolysis）：补体总活性测定方法，以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，故称补体50％溶血试验（CH50）2.实验材料(1)绵羊红细胞①使用等量或两倍的阿氏保存液混合，便于抗凝和储存②临用前生理盐水洗涤红细胞③使用浓度一般为2~5％(2)配制50％溶血标准管①2％SRBC悬液0.5ml+2.0ml蒸馏水使其溶解②加入2.0ml1.8％NaCl溶液校正为等渗溶液③加入2％SRBC溶液0.5ml，即为50％溶血状态(3)溶血素（抗SRBC Ab）①用SRBC免疫家兔得到兔抗SRBC血清②试验前应预先加热（56℃，30min），灭活补体③滴定溶血素的效价：产生完全溶血的最高稀释度为溶血素的效价(4)缓冲液①磷酸盐缓冲液或巴比妥缓冲液②pH应调至7.2-7.4之间③适量氯化钠保持等渗④并适量加入一些Ca2+和Mg2+(5)补体①作为待检对象：标本必须新鲜②作为主要试剂（单个补体检测）：多采用豚鼠血清，必须新鲜-70℃可保存数月，避免反复冻融存在个体差异, 三只以上血清混合使用3.CH50检测方法判定标准与计算标准：选择溶血程度与50％溶血的标准管相近的两管，以溶血程度最接近标准管的那一管定为终点管计算：CH50(U/ml）＝(1/血清用量）×稀释倍数参考范围：50-100 U/ml4.临床意义CH50主要检测的是经典途径的补体溶血活性，所反映的主要是补体9种成分的综合水平测定值过低或完全无活性，首先考虑补体缺陷，可分别检测血清中C4、C2、C3、C5等单个成份的含量三、单个补体成分的测定1.单个补体成分的检测对象主要包括：C3、C4、 C1q、B因子等2.测定方法：溶血法（检测单个补体的溶血活性）免疫化学法（测定补体含量）3.试验方法致敏SRBC+反应系统补体（缺待检成分）→不溶血致敏SRBC+反应系统补体（缺待检成分）+待检血清→溶血4.溶血法(1)原理：抗原与其特异性抗体（IgG、IgM型）结合后，可激活补体导致细胞溶解(2)组成：①试剂指示系统（致敏SRBC）②试剂补体系统（待检补体缺失）③待检血清（是否含待检补体？）(3)试剂补体系统选用先天或人为导致的缺乏某单一补体成分的动物或人血清作为试剂，如人缺C2血清、豚鼠缺C4血清、小鼠缺C5血清、兔缺C6血清等(4)应用与评价①诊断补体某单个成分缺失或其含量正常但无溶血活性的先天性补体缺陷②定性方法，检测单个补体成分③无需特殊仪器，快速，但灵敏度低，影响因素多四、补体结合试验（complement fixation test，CFT）1.反应系统的组成：抗原+Antibody->活化补体→溶血反应2.概念补体结合试验（complement fixation test，CFT）：将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法3.原理(1)三个系统（包括5个成分）：①反应系统：已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）②补体系统：C1-9及其缓冲液③指示系统：SRBC与相应溶血素（SRBC抗体）常预先混合形成致敏红细胞(2)补体作用无特异性，既可与反应体系中的抗原抗体复合物结合，也能与SRBCs结合(3)两个阶段：第一步：反应系统与补体系统作用第二步：指示系统（SRBCs）与剩余补体反应4.试验方法结果判定：(1)补体对照管 2U全溶，1U为全溶或略带少许RBC，0.5U应不溶(2)若0.5U补体对照管出现明显溶血，表示补体用量过多；如2U不出现溶血，表示补体用量不够(3)受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性5.试验试剂(1)抗原和抗体的效价方法：方阵法进行滴定选择抗原与抗体二者都呈强阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（1单位）在正式试验中，抗原一般采用2－4单位，抗体为4个单位(2)补体效价的滴定①一般用豚鼠补体②每次试验前均应滴定③温育后，能产生完全溶血的补体最少用量确定为1个单位，正式试验中使用2个单位(3)血清标本的处理①采集血液标本后应及时分离血清，及时检验，或将血清保存在-20℃②血清在试验前应先加热56℃ 30min以破坏补体6.应用和评价(1)优点：①补体活化过程有放大效应，灵敏度较高②可用于定性或半定量检测未知抗原或抗体③试验条件要求低易于普及、结果易判断(2)缺点：①影响因素复杂，操作步骤繁琐②抗体必须为IgM或IgG五、补体测定的临床意义1.检测补体的单个成分及补体的活性测定对于机体免疫系统的功能评价，疾病的诊断与治疗等有重要意义(1)免疫性疾病①C1、C2、C3和Hf等缺陷②Ⅲ型超敏反应中C3aC5a等过敏毒素检测(2)遗传性疾病①C3缺陷导致的感染②C1抑制物缺陷与遗传性血管性水肿③I因子、H因子缺陷与肾小球肾炎等2.补体含量继发性降低的疾病(1)补体消耗增多：SLE、自身免疫性溶血性贫血、类风湿性关节炎、移植排斥反应等(2)细菌性感染，激活补体替代途径导致补体水平降低(3)大面积烧伤、大出血和肾病综合征等导致体液大量丧失(4)补体合成不足：急慢性肝炎、肝硬化、肝癌及营养不良等小结1.CH50试验的原理及方法学评价2.补体结合试验的原理及结果解释复习思考题：1.名词概念：Complement、CH50 test、CFT（Complement Fixation Test）2.思考题：请例举其他有补体参与的免疫学检测技术或方法。
溶血反应检测实验报告
溶血反应检测实验报告1. 引言溶血反应是指血液中的红细胞在一定条件下发生溶解的现象。
常见的溶血反应检测方法有三种：渗透性溶血试验、免疫溶血试验和补体结合试验。
本次实验旨在通过补体结合试验检测样本中是否存在溶血反应现象。
2. 实验目的1. 了解补体结合试验的原理和方法；2. 检测样本中是否存在溶血反应现象。
3. 实验原理补体结合试验是通过观察抗原与抗体结合是否引起补体的活化和溶血现象，来检测血清中是否存在相应的抗体。
补体结合试验分为直接试验和间接试验两种。
本实验采用间接补体结合试验，原理如下：1. 补体活化：当抗原与抗体结合时，会激活补体系统，形成抗原-抗体-补体复合物。
2. 补体溶血：激活的补体可以引起红细胞的溶解，产生溶血现象。
3. 补体结合试验：利用已知溶血系数的抗血清与待测抗血清反应，观察是否发生补体溶血现象，进而判断样本中是否存在溶血反应。
4. 实验步骤4.1 实验材料- 待测抗血清- 已知阴性抗血清- 已知阳性抗血清- 红细胞悬液- 0.85%生理盐水- 血清杯- 混匀器- 恒温水浴4.2 实验操作1. 检测前准备：- 将已知阴性抗血清标记为对照组。
- 将已知阳性抗血清标记为实验组。
- 将待测抗血清标记为待测组。
- 预备制备红细胞悬液和0.85%生理盐水。
2. 实验操作：- 取3个血清杯，分别加入待测组、对照组和实验组的抗血清。
- 各个血清杯中加入等量的红细胞悬液。
- 在37C恒温水浴中培养30分钟。
- 混匀后静置5分钟。
- 观察溶血情况。
5. 实验结果通过观察实验组和对照组的溶血情况，得出如下结果：- 实验组：发生明显的溶血现象，红细胞悬液呈现淡红色。
- 对照组：无明显溶血现象，红细胞悬液保持鲜红色。
6. 结果分析实验结果表明，待测抗血清中存在引发溶血反应的抗体。
溶血反应是一种免疫反应，该抗体与红细胞特异抗原结合，激活补体系统，导致红细胞溶解。
这种抗体可能来源于感染、自身免疫疾病等。
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实验报告
4. 补体结合反应实验原理
补体结合反应是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。
参与本反应的五种成分可分为两个系统：
一为待检系统，即为已知抗原（或抗体）和待检抗体（或抗原）；
另一个为指示系统，即绵羊红细胞和其相应的溶血素。
待检抗原、抗体和补体作用后，再加入指示系统。
若待检系统中的抗原和抗体相对应，两者特异性结合后激活补体，补体被消耗。
再加入的指示系统无补体结合，不出现溶血；若待检系统中的抗原与抗体不对应或缺少一方，补体不被激活，当指示系统加入后，绵羊红细胞和溶血素复合物激活补体，产生溶血现象。
5. 空斑形成实验
是一种体外检测IgM、IgG类型抗体产生细胞的实验方法，又称空斑形成细胞（PFC)测定。
可作为评估药物影响抗体产生水平以及临床筛选抗肿瘤新药的重要依据。
经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞混合后，抗体形成细胞产生的抗体与绵羊红细胞结合；在补体参与下，绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。
一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
一、SRBC的制备
（一）无菌抽取绵羊血
1.手术剪减去绵羊颈部毛发备皮，止血带扎住颈部，碘酒消毒，酒精棉球再擦拭。
2.抽取一定量的绵羊血，注入无菌玻璃瓶，轻轻摇晃获得抗凝绵羊血，摇晃时不能用力过猛，防止SRBC破裂。
（二）绵羊红细胞的制备
1.在无菌实验室中，用移液枪吸取5ml抗凝绵羊血于试管中，共4支试管。
2.配平后对称放入离心机中2000rpm离心10分钟。
3.4支试管，胶头滴管吸去上清液，加入适量的灭菌生理盐水后轻轻摇晃混匀。
4.再次配平后，2000rpm离心10分钟，2-3次。
5.吸去上清液，获得绵羊红细胞。
（三）绵羊红细胞悬液制备
1.20%绵羊红细胞悬液制备
在无菌实验室中，用移液枪吸取2ml绵羊红细胞于锥形瓶中，用移液管再加入8ml灭菌生理盐水，混合均匀。
2.2%绵羊红细胞悬液制备
在无菌实验室中，用移液枪吸取1ml绵羊红细胞于锥形瓶中，量筒量取49ml无菌生理盐水加入锥形瓶，混合均匀。
二、溶血素的制备
（一）免疫接种程序
（二）免疫途径
在大白兔背部三个点酒精消毒后，皮下接种绵羊全血。
（三）试血
1.动物免疫18天后缘静脉采血2毫升，离心取血清。
2.清稀释成不同倍数补体溶血实验。
（四）心脏取血
胸骨左缘第3、4肋间心脏跳动最明显处。
手术剪去毛，消毒后注射器取20ml血。
（五）补体灭活与溶血素保存
1.将心脏血分别注入2支离心管中，各10ml。
2.配平，2000rpm离心10分钟，保留上清液，即血清。
3.将血清置于56℃恒温水浴锅30分钟，电动移液枪加入等体积甘油，记号笔标明：溶血素、日期、效价（1：6400）。
置于-20℃冰箱保存。
三、补体溶血实验
四、补体结合试验结果分析
补体结合实验阳性说明待测的Ag（或Ab)与已知的Ab（或Ag)是相对应的。
反应系统中形成的Ag-Ab复合物先结合补体，激活的补体被消耗，指示系统中已再无补体参与激活。
五、空斑形成实验
（一）免疫小鼠
将5%SRBC（0.4ml）注射于小鼠腹腔。
（二）脾细胞悬液的制备
1.免疫5天后，捉取小鼠，固定好。
2.小鼠腹部消毒后，用镊子提起皮肤，眼科剪剪开暴露腹白线，再剪开肌层暴露腹腔。
3.用滴管吸取Hank;s液于平皿，用镊子和眼科刀协助取出小鼠脾脏于平皿。
4.吸取Hank’s液于装有脾脏的平皿，镊子夹取200目细胞滤网于离心管口。
用眼科剪在脾脏两端剪开小口，再用研磨棒磨碎脾脏（在脾脏两端剪小口便于研磨出小鼠脾细胞，以减轻研磨对小鼠脾细胞的损伤）。
5.用滴管吸取肝脏研磨液，逐滴滴过200目细胞滤网于离心管，得到脾细胞悬液。
6.配平，1000rpm 4℃离心5分钟。
离心后洗2次，用Hank's液重悬脾细胞，计数调细胞浓度至2×107/ml。
（三）底层琼脂板的制备
1.再酒精灯周围，将加热的1.4%琼脂凝胶倒入平皿中约3ml，待凝胶凝固后倒扣，放入37℃恒温培养箱。
（四）顶层琼脂板的制备
1.在45℃恒温水浴锅中，在1ml的0.7%琼脂凝胶中依次加入0.5ml 5%SRBC悬液、0.5ml 107/ml脾细胞悬液、0.5ml 1 ：6补体。
2.将配比好的顶层琼脂迅速混匀倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，静置15分钟，再放入37℃恒温培养箱孵育1-1.5h。
若1和5不溶血，2-4溶血，则检验阳性，M是梅毒患者；若1-4溶血，5不溶血，则检验阴性，M不是梅毒患者。
二、注意事项
1.在无菌室中的实验步骤一定要严格操作，避免污染对实验的影响。
2.免疫接种时注意免疫间隔，以便产生更多抗体。
3.注意更换移液管枪头，以免造成污染，影响实验结果。