蓝莓组织培养技术大全

蓝莓组培技术介绍

一、愈伤组织的培养

（一）几个概念

1.外植体（explant）：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。

2.分化（differentiation）：细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。

3.脱分化（dedifferentiation）:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。

4.再分化（redifferentiation）:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。

5.愈伤组织（callus）:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。

6.胚状体（embroid）:-对应于胚（embryo），在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。胚状体原始细胞特征：原生质浓厚，细胞核较大，处于细胞质中央。

7.人工种子(artificial seed):指将植物离体培养产生的体细胞胚包埋在含有营养成分和保护功能的物质中,在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。

（二）愈伤组织类型及特征

1.结构致密型：表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，易于再生芽

2.结构松散型：多为白色，可以用于悬浮系建立。

3.胚性愈伤组织：具有产生胚状体能力。

（三）愈伤组织的形成：大致经过起绐期、分裂期和形成期，但三个时期没严格界限。

1.起始期指细胞准备进行分裂的时期，当外植体已分化的活细胞在外源植物生长物质的作用下，通过脱分化起动而进入分裂和形成愈伤组织。

2.分裂期表现为外层细胞出现分裂，细胞分裂进入最旺盛时期，细胞体积最小，细胞核和核仁较大，RNA含量最高。

3.形成层的特征是细胞大小趋于稳定,细胞分裂从分裂期的周缘细胞分裂为主转向了内部组织。

（四）愈伤组织中的形态发生：愈伤组织通过再分化形成再生植株的方式主要有：

1.先产生芽后,在茎的基部长根。

2.先长根,再长芽。

3.愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。

（五）胚状体特点

1. 有分化明显的生物两端，根端和芽端。

2.单细胞起源。

3.发育程序同合子胚相似，也经过球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚。

4.和周围细胞之间有隔离。

5. 和培养物质没有维管束联系，所以容易从培养物质上剥离。

6.可以在不附加任何激素的培养基上萌发。

（六）胚状体发生途径

1. 直接胚状体发生。

2.间接胚状体发生（愈伤组织分化出胚状体）。

3.从悬浮培养的细胞中诱导。

4.由花粉产生的单倍体胚状体。

5.由原生质体产生胚状体。

（七）胚状体异常现象

1. 单片子叶；

2.多子叶；

3.杯状胚状体；

4.柱状胚状体。

二、器官培养

器官培养主要指植物根、叶、茎、花及小果实等器官在离体条件下的无菌培养。其特点在于能保持器官所具有的特征结构。

1.根的培养(以番茄离体根培养为例)

(1) 种子用70%酒精消毒;(2)用饱和漂白液消毒10分钟;(3)用无菌水洗三次;(4)将6-10粒种子放入培养皿中的湿滤纸上;(5)培养皿放入暗中培养直至胚根长至30-40mm;(6)切取10mm长的根尖用无菌的接种环接种于培养液中;(7)在25度下培养直到长出侧根。

影响根分化的因素

培养基的成分：⑴基本培养基⑵生长调节物质⑶生长素⑷细胞分裂素

培养条件：⑴光经常抑制根生长⑵温度21－30℃均可诱导生根

2.茎的培养(可分为茎尖培养和茎段培养)

茎段培养是指带有腋(侧)芽或叶柄、长数厘米的茎节段进行离体培养。

培养流程：

3.叶的培养

三、花药和花粉培养

（一）几个概念

单倍体细胞：植物的花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体细胞的一半。

花粉和花药培养：指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉发育成完整植株的技术。

单倍体植物：用离体培养花药的方法使其中的花粉发育在一个完整的植株。（二）影响花粉和花药培养的因素有哪些?

1. 不同基因型对培养反应不同。

2.材料的生理状态。

3.发育阶段。

4.培养基：

⑴基本培养基⑵激素⑶蔗糖⑷其它：铁盐、活性炭。5.预处理：花蕾低温处理2－7天为宜，也可高温、辐射、黑暗处理。6.培养方式：固体培养、液体培养。（三）什么时期花粉易单倍体培养成功?

单核期小孢子。

（四）花药培养中非单倍体出现的原因有哪些?

1. 花药愈伤组织的多倍化－核内有丝分裂。

2.核融合--产生多倍体。

3.不正常的非单倍体花粉产生的植株。

4.花药壁、花丝等二倍体体细胞参与愈伤组织的形成。

5.愈伤组织染色体的变化。

（五）花药培养中花粉发育途径有哪些。

⒈1.均等分裂发育途径，2.营养核分裂发育途径，3.生殖核分裂发育途径，4.营养核和生殖核发育途径。

（六）单倍体植株染色体加倍方法是什么?

1. 自然加倍：发生频率低，主要是由核内有丝分裂产生的。也有花粉内营养核和生殖核二者的融合而达到加倍目的。

2. 人工诱导加倍：用0.5%秋水仙素溶液处理植株。

使用方法：植株处理：植株用0.5%秋水仙素处理24～48h洗净后种植。

花序处理：植物倒置使花序浸入0.1%秋水仙素溶液中24～48h。

生长点处理：用0.1～0.4%秋水仙素和羊毛脂（3：2）涂抹。

3. 从愈伤组织再生二倍体植株：用单倍体植株茎段培养使之产生愈伤组织，愈伤组织中可发现核内有丝分裂，从而造成染色体加倍。

（七）如何利用花粉培养直接获得纯合二倍体？

切取花蕾组织→在不同转速下离心→分离出纯花粉→染色体加倍→培养→纯合

二倍体植株。

四、细胞培养

(一）悬浮培养

1.悬浮培养的基本特点

是从愈伤组织的液体培养的基础上发展起来的一种培养技术，主要有两个基本特点：

1）细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模生产

2）可以提供大量的比较均匀的细胞，为深入研究细胞的生长、分化创造了一种很好的实验方法和条件；愈伤组织只能提供细胞间可能已明显分化的细胞。但是，这种理想状态不容易得到。到目前为止，还不能完全做到只有游离的单细胞，通常里面还有小细胞团，这是由于植物细胞具有聚集在一起的特性。

2.悬浮培养的目的

主要用于生产次生代谢产物，所以保持细胞停留在增殖阶段是十分重要的，细胞勿需继续分化

3.悬浮系的制备

将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经过摇床不断振动，使细胞分散。

一般来说，分散比较好的细胞悬浮物是由薄壁细胞组成的。但有时还存在一些木质化的类管胞等成分，这些类管胞成分是引起细胞聚合的重要因素。通常适于愈伤组织生长的液体培养基也适用于同种植物细胞的悬浮培养。有时需要调节激素的浓度。

（二）单细胞培养

1.分离单细胞的方法

1）物理方法：

将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经摇床不断振动，使细胞分散。若向细胞悬浮液中吹入脉冲压缩气体，细胞分散的更好。

2）化学方法：

胡萝卜细胞悬浮培养中加入草酸钙（100μg/L）得到较分散的细胞。因为草酸盐能结合细胞间质中果胶钙的钙离子。

秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白对细胞分散有一定的作用

3）酶法：

果胶酶和纤维素酶有利于细胞分离，但使用浓度不当容易引起细胞降解。2.单细胞的培养方法

1）液体浅层培养：

先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，石蜡膜封口，静置培养。

优点：培养物与空气接触面大，通气性好；细胞代谢产物容易扩散，不会造成有害物质的危害,继代培养方便、便于观察。

缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察

2）微室培养（微滴培养）：40-100μl

优点：可以连续观察细胞的分化和发育；缺点：通气性差。

3）平板培养：

优点：便于定点观察；缺点：通气性较差

4）看护培养；适用于难于培养的植物种类

3.培养细胞的密度及生活率的测定

1）起始密度的测定：起始密度一般为104-108个/ml

用记数板统计细胞数目

2）植板率的测定：

用平板培养的需要统计植板率，即每个平板接种细胞总数中形成细胞团的百分数。

4.植株再生

获得了细胞团以后继续培养形成愈伤组织

将大块的细胞团或愈伤组织转到分化培养基上再生植株。

五、原生质培养和体细胞杂交

（一）原生质体及其特点

原生质体是去掉了细胞壁后剩下的细胞部分。

特点：1.易于摄取外来遗传物质、细胞器、细菌、病毒等

2.在一定条件下可诱导原生质体融合，形成杂种细胞

（二）原生质体培养的步骤

1.原生质体的分离

以芸薹属植物为例：

2.原生质体培养

将纯合后的原生质体以5-6×104/ml的密度用培养基浅层培养

3.愈伤组织的产生及植株再生

当小愈伤组织长到直径1mm时转到固体培养基上增殖培养，然后再转入分化培养基上再生植株。

（三）原生质体融合：又叫体细胞杂交

1．自发融合：

酶解过程中，常有相邻的同缘原生质体互相粘连，最后融合在一起形成同核体

有时也出现多核融合体。

2．诱导融合：

（1）PEG法：把两种原生质体放在一起，加入诱导融合剂如PEG（聚乙烯二醇），在高Ca+、高pH条件下，异源原生质体容易发生融合，形成异核体。

（2）电融合法：利用交变电流

植物快繁的途径和方法

植物快速繁殖就是应用组织培养技术,快速繁殖名优特新品物,使其在较短时间内繁衍较多的植株。快繁是当前植物工程中应用最广泛，又最有效的方法之一。

一、植物快速繁殖的类型与方式

类型方式特点事例

器官型腋芽萌发，以芽增殖芽，扩大繁殖系数繁殖系数高，遗传性稳定，是快繁的主要方式甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹

器官发生型通过脱分化形成愈伤组织，再分化出苗可获得与母株相同的小植株，繁殖系数较低，可用于细胞分化的研究烟草、油菜等

胚状体发生型从愈伤组织或直接从子叶、下胚轴和花药培养中产生首先证明植物细胞的全能性，繁殖系数高甘蔗、胡萝卜、石刁柏等

原球茎型由茎尖或腋芽产生原球茎放入培养基中发育成小植株遗传性较稳定，原球茎可作为繁殖系母体兰花

球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起（球茎芽），一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠

块茎型叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高花叶芋

鳞茎型鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎在试管内形成小鳞茎需较长时间百合、郁金香、贝母等

孢子型用成熟或未成熟的孢子进行培养孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长地钱、狼尾蕨等

根茎型蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组培的最佳外值体根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢子型快肾蕨、裂叶肾蕨、波士顿蕨等

微枝扦插型带芽的小插条在试管内进行无菌扦插为木本植物进行快速繁殖的主要方式葡萄、杨树

二、继代培养：当初代培养的试管苗在瓶内长满到瓶塞，或培养基养分利用完时就要转瓶，这就是继代培养。在此过程中会产生两种现象，即驯化现象和衰退现象。

驯化现象：开始继代培养要加入生长调节物质，其后加入少量或不加入就可以生长的现象。

衰退现象：长期继代培养的材料也会逐渐衰退，丧失形态发生能力，具体表现在生长不良，再生能力和增殖率下降等。

二、培养物的脱毒及脱毒苗的鉴定

一、为什么茎尖培养除去病毒：因为病毒运转速度慢，加上茎尖分生组织没有维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以生长点的病毒数量极少，几乎检测不出来。

二、无病毒苗的获得：（1）材料的培养和灭菌；（2）茎类剥离；（3）茎尖培养；（4）提高脱毒效果：高温、低温、化学处理。

三、其他途径脱毒：（1）愈伤组织脱毒；（2）珠心胚培养脱毒；（4）茎尖微体嫁接脱毒；（5）培育抗病毒栽培种。

四、脱毒苗的鉴定：（1）直接测定法；（2）指示植物法；（3）抗血清鉴定法；（4）酶联免疫吸附法；（5）电子显微镜检查法；（6）免疫吸附电镜法。

三、种质保存

一、种质是指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。植物种质保存是利用天然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。种质保存主要有两种方式：原地保存和异地保存。前者通过建立自然保护区和天然公园来实现，后者通过植物园、种质圃、种子库以及离体保存来实现。

二、种质保存的主要方法：（1）常温保存；（2）常低温和低温保存；（3）超低温保存。

稀酸、稀碱的配制及酒精稀释法

在培养基的配制过程中，常需要用氢氧化钾或氢氧化钠和盐酸来来调整培养基的酸碱度。

1.1摩尔/升KOH液的配制:称取57.1克KOH,加蒸馏水至1000毫升.

2.0.1摩尔/升KOH液的配制:取10毫升1摩尔/升KOH液加蒸馏水90毫升.

3.1摩尔/升NaOH液的配制:称取40克NaOH,加蒸馏水至1000毫升.

4.0.1摩尔/升NaOH液的配制:取10毫升1摩尔/升NaOH液加蒸馏水90毫升.

5.1摩尔/升HCL液的配制:取浓盐酸(比重1.19)82.5毫升加蒸馏水至1000毫升.配制时先将浓盐酸缓缓加入约800毫升的蒸馏水中,然后用蒸馏水补足至1000

毫升.

6.0.1摩尔/升HCL液的配制:取10毫升1摩尔/升HCL液加蒸馏水90毫升.

7.酒精是组培工作中常用的消毒液,广泛用于外植体材料、接种用具及接种人员双手的消毒，也用于培养室的酒精喷雾消毒等。酒精的消毒效果以70%为最好。所以常将市售95%的酒精稀释至70%-75%。

常见培养基中植物激素配方类型

激素配方再生方式及用途

1.无植物激素：诱导生根、无性胚、愈伤组织形成

2.单加生长素:：诱导生根、愈伤组织、无性胚、不定芽

3.单加细胞分裂素；诱导不定芽、侧芽增殖、愈伤组织形成

4.高生长素低细胞分裂素：诱导芽、原球茎增殖、愈伤组织形成

5.低生长素高细胞分裂素：诱导丛芽、愈伤组织形成

6.低生长素低细胞分裂素：诱导不定芽、侧芽增殖

7.等量生长素与细胞分裂素：诱导侧芽增殖

8.加生长仰制剂（多效唑、矮壮素等）：壮苗、延缓生长、利于试管苗保存

9.加GA3 ：打破种子、芽休眠，促进伸长生长

培养物的不良表现及改进措施(初始培养阶段)

1.培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯

可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。

2.培养物长期培养几乎无反应

可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。

改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。

3.愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状

可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。

改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。

4.愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢

可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。

改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。

5.侧芽不萌发,皮层过于膨大,皮孔长出愈伤组织

可能原因:枝条过嫩,生长素、细胞分裂素用量过多。

改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。

培养物的不良表现及改进措施(继代培养阶段)

1.苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高

可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。

改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。

2.苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化

可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。

改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。

3.分化率低,畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化

可能原因:生长素用量偏高,温度偏高。

改进措施：减少生长素用量，适当降温。

4.叶粗厚变脆

可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。

改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基。

5.再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来

可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。

改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式。

6.丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽

可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。

改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度，更换封瓶纸的种类。

7.幼苗淡绿，部分失绿

可能原因：无机盐含量不足，PH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。

改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH值，调控温度、光照。

8.幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中

可能原因：瓶内气体状况恶化，PH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当。

改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。

培养物的不良表现及改进措施(生根阶段)

1.培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组织

可能原因：生长素种类、用量不适宜；生根部位勇气不良；生根程序不当；PH 值不适，无机盐浓度及配比不当。

改进措施：改进培养程序，选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度，改用滤纸桥液培养生根等。

2.愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合。

可能原因：生长素种类不适，用量过高，或伴有细胞分裂素用量过高，生根诱导培养程序不对。

改进措施：调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低使用浓度，附加VB2或PG等减少愈伤，改变生根培养程序等。

组培介绍

一、组培的概念和重要性

（一）.植物组织培养的含义

（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

（狭义）组培指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

（二）、植物组织培养的重要意义：

1. 加速无性繁殖;

2. 获取脱毒苗;

3. 扩大变异范围：

(1)克服远缘杂交后代不育性和杂交不亲和性。

(2)通过原生质体融合获得体细胞杂种和胞质杂种。

(3)倍性育种：通过胚乳培养获得三倍体；通过花粉和花药培养进行单倍体育种。

(4)结合诱变育种在试管内进行优良变异的诱导.选择和繁殖。

4.加速亲本材料的纯化。一般选育自交系需4－6代花粉培养获得单倍体植株，染色体加倍后即为纯合二倍体。

5.种质资源的试管保存。

6.为基因工程的全面实施人工控制遗传方向打下基础。

二、植物组织培养的理论依据

（一）植物细胞的全能性

指每个植物细胞都具有形成完整植株的能力，因为每个细胞都具有全套的遗传基因，无论是性细胞还是体细胞在特定条件下可以进行表达。1902年德国植物生理学家Haberlandt提出了“细胞的全能性”原理。但在当时的技术条件下，在实践上并没做到，经过几十年来组织培养技术的不断改进，目前细胞的全能性不但在理论上完全被证实，而且为组织培养在实践上的应用奠定了基础。

（二）植物细胞要表现出全能性，须经过几个步骤：

成熟细胞(外植体)→分生细胞→胚状体→完整植株。

成熟细胞(外植体)→愈伤组织→出根出芽→完整植株。

成熟细胞(外植体)→诱导侧芽生长→出根出芽→完整植株。

脱分化也就是已经分化定型的细胞，经过诱导成为重新恢复了分裂能力（也就是成为分生状态）细胞的过程。

不但植物体细胞可以表现全能性，花粉在培养条件下也可能进行脱分化，通过愈伤组织或胚状体发育成单倍体植株。

三、植物组织培养的理论依据

（一）植物细胞的全能性

指每个植物细胞都具有形成完整植株的能力，因为每个细胞都具有全套的遗传基因，无论是性细胞还是体细胞在特定条件下可以进行表达。1902年德国植

物生理学家Haberlandt提出了“细胞的全能性”原理。但在当时的技术条件下，在实践上并没做到，经过几十年来组织培养技术的不断改进，目前细胞的全能性不但在理论上完全被证实，而且为组织培养在实践上的应用奠定了基础。

（二）植物细胞要表现出全能性，须经过几个步骤：

成熟细胞(外植体)→分生细胞→胚状体→完整植株。

成熟细胞(外植体)→愈伤组织→出根出芽→完整植株。

成熟细胞(外植体)→诱导侧芽生长→出根出芽→完整植株。

脱分化也就是已经分化定型的细胞，经过诱导成为重新恢复了分裂能力（也就是成为分生状态）细胞的过程。

不但植物体细胞可以表现全能性，花粉在培养条件下也可能进行脱分化，通过愈伤组织或胚状体发育成单倍体植株。

四、植物组织培养的应用

1.无性系快速繁殖:应用组织培养和细胞培养技术,快速繁衍珍稀濒危植物,使物种得以保存;以及快速繁殖名优新品种,使其在一定时间内繁衍为一定数量

的植株。

2.花药培养和花粉单倍体育种:离体花药--花粉培养的单倍体育种法,与常

规方法相比,可以在短时间内得到作物的纯系,从而加快育种过程.据不完全统计,我国各地用花药或花粉培育出的植物已有22科52属160个种,取得了较大的成就。

3.药用植物的工厂化生产:当前各地采用组织培养来加速药用植物(如人参、紫草、贝母、三分三、甘草等)的繁殖生长已获得成功，并投入工厂化生产。

4.种质的保存和基因库的建立：组织培养材料的体积小，利于在低温（如低温冰箱）或超低温（如液态氮）中长期保存。

5.突变体的筛选培育：在组培进程中，基因型易发生变异，人们采用紫外线、X射线、r射线、对培养物照射，或者在培养基中加入叠氮化合物等，以诱导和提高突变频率，产生人们需要的突变体，供人们筛选培育。

蓝莓组培

一、实验室设计

1.准备室:(1)进行药品的保存、配置、消毒、分装等。(2)器具的洗涤、干燥、消毒。(3)生理生化指标的测定等。

2.接种室：进行材料的接种，内置超净工作台或接种箱。外设缓冲间-放置拖鞋、工作服、工作帽等。

3.培养室：植物材料的无菌培养，室内主要有培养架和控制温度及光照的设备。

4.细胞学观察实验室：进行培养材料的组织学、细胞学、观察照相等。

二、常用设备和器材

1.高压蒸气灭菌锅：用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。

2.超菌工作台：用于培养物的无菌操作。（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）

3.接种工具：包括双筒实体显微镜、镊子、剪刀、解剖刀、洒精灯等。

4.培养设备：包括空调机、定时器、温度控制器、增湿机或去湿机、培养架、

摇床或旋转床、日光灯、光照培养箱等。

5.化学实验及分析设备：包括天平、酸度计、蒸馏水器、烘箱或玻璃仪器烘干器、电炉、药品柜、冰箱、晾干架等

高压灭菌锅手提式灭菌锅培养箱超净工作台烘干箱电子天秤

三、玻璃器皿的选择和清洗

1.玻璃器皿的选择

*试管- 适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用。

*三角锥瓶- 适用于各种培养（如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养）。*L形管和T形管- 为专用的旋转式液体培养试管。

*培养皿- 适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。

*角形培养瓶和圆形培养瓶- 适用于液体培养用，如单细胞和原生质体的浅层培养。

*果酱瓶- 常用作试管苗大量繁殖用的培养瓶。

2.玻璃器皿的清洗

（1）清洗玻璃器皿用的洗涤剂有肥皂、洗洁精、洗衣粉、和铬酸钾洗涤液。（2）清洗时先将器皿中的残渣除去，用清水洗净，再用热的肥皂水或洗洁精洗净，清水冲洗干净后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。

（3）洗净的玻璃器皿应透明发亮、内外壁水膜均匀，不挂水珠。

四、影响植物组培的因素

1.植物因素：(1)基因型，(2)植物年龄，(3)组织和器官的年龄，(4)植物的生理状态，(5)取材年份及生长条件，(6)取材部位及大小。

2. 培养基因素：无机盐、有机化合物、植物激素、天然提取物、琼脂、PH值、渗透压、活性炭。植物组织培养的成功与否，除了培养材料本身的因素外，很大程度上取决于对培养基的选择。培养基的种类、成份等直接影响培养材料的生长发育。故应根据培养材料的种类和部位，选取适宜的培养基。

3.外植体的选择和灭菌:不同品种、不同器官之间的分化能力有差别，且组织培养是建立在无菌操作基础之上的专门技术，因此在进行植物组织培养时，必须选择合适的外植体进行灭菌操作，以确保组织培养工作的顺利进行。

4.环境因素：(1)光照：包括光强、光质、光周期，(2)温度，(3)湿度，(4)气体。

五、培养基的主要成分及制作程序

（一）、培养基的主要成分：

1.无机盐：(1)大量元素：C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl。(2)微量元素：

Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na。(3)水：培养基95%是水，应使用蒸馏水、双蒸水或使用去离子水,水应放在塑料容器中。

2.有机化合物：(1)糖(碳源和能源)，(2)维生素类：有维生素b1(盐酸硫胺素)、维生素b6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等，(3)氨基酸类(有机氮源)。

3.植物激素（生长调节物质）：

（1）生长素：主要包括IAA（吲哚乙酸）、NAA（萘乙酸）、2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、IBA（吲哚丁酸）；它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生；作用的强弱顺序为：2，4- D>NAA>IBA>IAA。

（2）细胞分裂素：天然：6-BA（6－苄基酰嘌呤）、KT（激动素，糠基酰嘌呤）；

人工：ZT（玉米素）、2-iP（2-异戊烯酰嘌呤）；它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用；作用的强弱顺序为：

TDZ,4PU>ZT>2-iP>6-BA>KT。

（3）赤霉素：GA3。

（4）乙烯及乙烯抑制剂。

4.天然提取物（如椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥等），其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。

5.琼脂（是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物），其主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢。

6.活性炭：加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，如可以防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。

（二）、1962年Marshing和Shong发明了MS培养基

（三）、培养基的制作程序：

六、外植体的选择和灭菌

（一）、外植体的选择:(1)外植体部位;(2)取材季节;(3)器官和生理状态和发育年龄;(4)外植体的大小。

(二)、外植体的灭菌方法

1、常用灭菌药剂的使用和效果：

消毒剂使用浓度/% 清除难易消毒时间/min 灭菌效果

次氯酸钠 2 易 5-30 很好

次氯酸钙 9-10 易 5-30 很好

漂白粉饱和溶液易 5-30 很好

升汞 0.1-1 较难 2-10 最好

酒精 70-75 易 0.2-2 好

过氧化氢 10-12 最易 5-15 好

溴水 1-2 易 2-10 很好

硝酸银 1 较难 5-30 好

抗菌素 4-50mg/L 中 30-60 较好

2.灭菌方法:

(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗---75%酒精浸泡10-20min---无菌水洗2-3次---Naclo或升汞溶液泡10-15min---无菌水洗3-4次

（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min---70%酒精漂洗---2%Naclo液浸10min---无菌水2-3次---取出种子培养

（3）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗---纯酒精漂洗---升汞浸5-10min 或2%Naclo液浸10-15min---无菌水洗3次

（4）花药的消毒：70%酒精浸泡数秒钟---无菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---无菌水洗2-3次。

七、外植体接种和培养

1.外植体的接种

（1）接种室的消毒:用70%酒精喷雾使细菌和真菌孢子随灰尘的沉降而沉降,再用紫外灯照射20min；或用高锰酸钾与甲醛蒸气熏蒸。超净工作台可用新吉尔灭

或酒精擦洗，其它一切器皿、衣物都要经严格的灭菌才能带进接种室。

（2）接种：左手拿试管或三角瓶，右手拿接种针或镊子接种，瓶口要靠近酒精灯火焰、接种动作要快，以免造成污染。

2.培养方法

（1）根据外植体不同可分为：胚胎培养、器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养

（2）根据培养方式不同可分为：固体培养、液体培养、半固体培养、双层培养

3.培养条件：温度、湿度、光照、PH值、氧和其它气体

4.外植体褐变及其防止:(1)培养基中加入抗氧化剂；(2)用抗氧化剂浸泡外植体后再接种；(3)减少光照强度或在黑暗条件下培养；(4)多次更换培养基达到稀释释效应；(5)加入多胺类物质，如精胺、亚精胺通过刺激细胞分裂，加速组织生长，减少褐化。

5.试管植物的玻璃化现象及其预防措施

外植体接种全过程

酒精擦拭手外植体消毒浸泡5min 器械消毒酒精灯灼烧酒精擦拭培养皿

酒精擦拭旋转灼烧修剪外植体取外植体接种塞回瓶塞培养

蓝莓组织培养技术的操作技术要点专家回复：（1）田间取材生长季节选择生长健壮的半木质化的新梢。最好将外植体取材苗木盆栽于日光温室中，每年的

3-5月取材。（2）接种将材料适当分割，在超净工作台上用0.1％升汞灭菌6—10分钟后，用无菌水冲洗5次，接入到培养基中。 (3)诱导培养用改良WPM培养基，温度20-30℃,光照12hr，30天后可长出新枝。 (4)继代培养对已建立的无菌培养物，进行继代培养，每40--50天一代，以达到育苗数量上的要求。温度20--30℃，光照2000-3000LX，12—16hr (5)炼苗将准备移栽的瓶苗，放在强光下，并逐渐打开瓶口，使之适应外界条件。一般需7-15天时间。 (6)移栽将苗从瓶中取出，去掉基部的培养基然后在大棚内插到苗盘上。正常情况下，一个月后即可成活。（7）日光温室促成育苗：于9越-11月，将组培室瓶内幼枝出瓶，剪成5-10cm枝段，用1000-2000ppm IAA 或生根粉速蘸，扦插在基质中，空气湿度90%，温度控制在20-28C。用生物灯补充光照16hr，以防短日照苗木休眠。优点：相对春季5-6月份而言，9-11月份日光温室内温度温和，容易控制，生根率可达90%上。在扦插生根前30天内不施肥，生根后，每周喷施1-5%浓度二铵一次，一直到翌年的三月份，停止施肥。 5月中旬，随着气温升高，温室逐渐放风炼苗，约20-30天，全部打开。此时，幼苗高度约20-30cm,3-5

个分枝。 6月中旬，将苗木移栽到12-15cm 口径营养钵中，露地抚育。营养基质按照与原图：草炭：有机肥=1：1：1，加入硫粉2kg/立方米。到秋季即可培育成大苗，即可定植。（8）幼枝催吊生根如果繁殖的幼枝需要远途运输或暂时不能扦插时，则可采用室内吊挂催根方法。即用盛冰淇淋用的

10cm×10cm×5cm的塑料食品盒（透明）。剪宽 1cm、长30cm的滤纸条，吸足IBA溶液10cm/L后平铺与桌面，然后每隔2～2.5cm摆好的幼枝上，然后卷成小卷儿，立放于塑料盒中，每盒放 8～10卷，共100个幼枝，盒底加入2～3ml 10mg/L 的IBA溶液，盖好盖，保持湿度。用普通地膜作成长筒，两头扎住，然后把盒放

入，每筒叠放8～10盒，吊挂于室内光照好的地方，一般1个月左右即可生根。在冬季组培增殖幼枝，无温室条件扦插时，可采用此种方法促进生根。