医学微生物实验 7年病毒感染检查qhua
《医学微生物学》教案病毒感染与免疫第24章病毒感染检查方法与防治原则
南华大学《医学微生物学》教课设计讲课题目（章节或主题）讲课时间第18次课教课课型理论课√第23章实验课□病毒的传染与免疫（2）第24章病毒传染的检查方法与防治原则讲课时数2学时习题课□谈论课□实习（践）课□其余□教课目标与要求：1）掌握搅乱素定义、种类、抗病毒机理及特色；病毒中和抗体的看法、作用机理及种类；病毒的分别培育方法，病毒在细胞培育中的增殖指标。
2）熟习标本的收集与送检；病毒传染的特异性预防。
3）认识细胞免疫抗病毒作用特色及机理；抗病毒免疫连续时间；病毒传染的诊断与治疗。
主要知识点、要点与难点：主要知识点1）抗病毒固有免疫。
2）抗病毒适应性免疫。
3）抗病毒免疫连续时间。
4）病毒传染的检查方法。
5）病毒传染的特异性预防。
6）病毒传染的治疗。
要点1）搅乱素定义、种类及抗病毒机理和特色。
2）中和抗体的看法、种类及作用体系。
3）病毒的培育方法。
难点：（1）搅乱素诱生、抗病毒作用机理。
（2）病毒在细胞培育中的增殖指标。
（3）抗病毒药物作用体系。
教课过程设计（包含解说内容、教课方法、时间分配、教课媒体采纳、板书、互动设计等）：解说内容和时间分配1）抗病毒固有免疫（25min）：搅乱素、天生不感觉性、屏障作用、细胞作用。
2）抗病毒适应性免疫（10min）：体液免疫的用、细胞免疫作用。
3）抗病毒免疫连续时间（10min）：与有无病毒血症、病毒血清型其余多少及病毒表面抗原能否易发生变异有关。
4）抗病毒传染的检查方法（25min）：标本的收集与送检、病毒的分别培育与判定、病毒传染的诊断。
5）病毒传染的特异性预防（10min）：人工主动免疫常用生物制品、人工被动免疫生物制品。
6）病毒传染的治疗（（10min））：抗病毒化学制剂、搅乱素和搅乱素诱生剂、中草药防治病毒传染、新抗生素、治疗性疫苗、治疗性抗体、基因治疗剂。
媒体采纳采纳详尽的举例和多媒体、彩色投影图片等多种教课手段，使抽象的理论详尽化和形象化。
板书设计1）抗病毒免疫。
病毒感染实验诊断
病毒感染实验诊疗1.（ 1 ）一般原则是特异敏感、迅速和简易。
第一依据流行病学和临床特色，初步判断可能感染的病毒。
（2）而后依据可疑病毒的生物学特色、机体免疫应答和临床过程，以及病人目前所处的机遇，确立实验诊疗方法。
2.（1）对潜藏期短，发病时还没有抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。
（2）对潜藏期超出十天的感染，可检测特异性的 IgM 抗体来进行早期迅速诊疗，及差别首次和再次感染。
（3 ）对可在体内形成连续感染或潜藏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG 抗体有无 4 倍以上涨高，或直接检测病毒核酸。
（4）对原由不明或有新病毒感染时，应收集标本进行病毒分别，同时应采纳双份血清以确认分其余病毒为病原体。
（5）对同一症状可有多种病毒惹起的状况，应同时检测几种有关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体。
（6）对由多个型别构成的病毒可测定它们的共同抗原。
第一节标本收集与运送一、标本的收集1.采样时间：尽可能在发病的早期，急性期或患者人院的当日进行。
2.标本种类的选择：依据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感得病毒种类，选择相应部位采纳标本。
常有分别病毒标本的选择：3．常有标本的收集方法(1) 血液：以无菌取抗凝血10ml 。
抗凝采纳100n ／ ml 肝素钠。
用于分别CMV 、HSV ，、黄病毒、 EBV、 HIV-1及重生儿肠道病毒。
(2) 脑脊液：以无菌取脑脊液 1 ～ 2ml ，冰浴立刻送检。
在 4 ℃可寄存72h 。
用于分别柯萨奇病毒、 ECHO 病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。
(3) 宫颈或阴道拭子：采纳病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm 逗留 5 秒拿出，冰浴立刻送检。
用于分别HSV 、 CMV 。
(4)粪便标本：取 2 ～4 ｇ粪便加 10ml 运送液立刻送检，用于分别腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。
(5) 含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。
用于分别流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV 等。
医学微生物学 第7章 细菌感染的检查方法与防治原则
• 人工被动免疫 artificial passive immunization
人工免疫
• 人工自动免疫
– 疫苗（vaccine）
死疫苗 减毒活疫苗 亚单位疫苗 重组载体疫苗 基因工程疫苗 核酸疫苗
– 类毒素（toxiod)
第7章
细菌感染的检查方法与 防治原则
检查方法
形态观察
合
疑
细菌分离、鉴定
似 细
样 品
病原菌
抗原成分检查
正 确
菌
采
核酸检查
诊
感
集
断
理 的 治 疗 方
染
血清抗体
案
宿主
细胞免疫
其他指标
细菌感染的特异性预防
• 自然免疫 Natural Immunization
– 自然主动免疫：隐性或显性感染 – 自然被动免疫：通过胎盘或初乳获得母体抗体
人工主动免疫artificialactiveimmunization人工被动免疫artificialpassiveimmunization疫苗vaccine死疫苗减毒活疫苗亚单位疫苗重组载体疫苗基因工程疫苗核酸疫苗人工自动免疫人工被动免疫免疫物质接种次数免疫力出现时间免疫力维持时间用途抗原长数月数年多用于预防抗体或细胞因子用于治疗或应急预防biologicalproducts丙种球蛋白vaccine减毒活疫苗attenuatedlivevaccine灭活疫苗inactivatedvaccine亚单位疫苗subunitvaccine基因工程疫苗geneengineeredvaccine核酸疫苗nucleicacidvaccinetoxoid细菌外毒素经0304甲醛液处理后其毒性消失而仍保留抗原性的生物制品通常是用细菌类毒素给马多次注射后取其免疫血清提取免疫球蛋白精制而成免疫球蛋白immunoglobulin抗菌药物概念1
病毒性感染的血清学诊断
病毒性感染的血清学诊断检查受微生物感染的机体有无特异性抗体，称为血清学诊断。
利用抗原与抗体能发生特异性结合的特点，用已知的病毒抗原检测患者血清中相应抗体，是病毒血清学诊断的基本原理。
对病毒性感染的血清学诊断最常用的办法是中和实验、补体结合实验、血凝抑制实验等，其中中和实验最为常用。
用动物、鸡胚和细胞培养均可举行。
中和实验多采纳细胞培养办法举行测定，其原理是将系列稀释的血清与病毒液混合后，再分离感染细胞，测定病毒的感染性，观看血清对细胞的庇护作用。
假如细胞不浮现病变，则证实血清中有病毒特异抗体存在。
效价凹凸是以能庇护半数细胞不产生CPE的血清最高稀释倍数来表示。
用此实验可检测患者血清中抗体的消长状况，常用于病毒感染的流行病学调查；也可用来鉴定未知病毒或讨论病毒的抗原结构。
下面以单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）为例，介绍细胞培养法中和实验来测定抗中和抗体，包括蚀斑削减法和细胞病变法。
一、蚀斑削减法测定中和抗体【材料】 1．待测血清无菌采集受检者末梢血5m1置离心管中，凝固后2000r/min离心5分钟，吸血清，经56℃灭活30分钟后冰箱冻存。
2. HSV-1型病毒（预测定PFU)。
3. Vero单层细胞培养皿（60mm）或培养瓶14支。
4. PBS、培养基A液、B液和C液等，配制办法同空斑定量法。
5．无菌试管、各种吸管（2ml,lml,5ml)、无菌注射器及离心管（10ml)。
【办法】 1．待测血清稀释取7支小试管，按表8-5倍比稀释血清。
2．病毒稀释将HSV-1型病毒稀释，使其浓度为1000PFU/ml, 3．取各稀释度血清0.5 ml加入试管中，各管中分离再加入0.5 ml病毒液（1000PFU/ml)，混匀后37℃作用1小时。
4．取各管血清与病毒混合物0.2m1，分离加入单层培养Vero细胞培养皿（瓶）中，每稀释度接种2支平皿（瓶），加预温A,B混合培养液4m1，凝固后反转培养3～4天后，再加C液(1％中性红琼脂培养基）2m1，凝固后培养数小时或过夜，测定各平皿（瓶）的空斑数。
微生物学第7章细菌与病毒的微生物学检查
第7章 细菌与病毒的微生物学检查法Laboratory Diagnosis of Bacterial and Viral Infections 商庆龙 Instructor in Microbiology Dept. of HMU Nov. 6, 2009
汇报时间：12月20日
致病力和药敏测定 动物实验 毒力检测 药物敏感试验
形态学检查
细菌染色检查法 暗视野检查
形态和染色性有明显特征的病原菌
革兰染色结果比较 抗酸染色
03
革兰染色阳性菌 革兰染色阴性菌 （葡萄球菌） （大肠埃希菌）
二、病原菌成分检测
抗原的检测 用已知的特异性抗体检测未知的细菌抗原成分 核酸的检测 核酸杂交 PCR
Toxins from E. coli 0157:H7 bacteria and others can cause fatal disease in humans, and they can be food borne
五、病毒抗体的检测
将已知的抗病毒血清先与病毒悬液混合在一起，在一定温度条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞进行培养，观察病毒致细胞病变作用或红细胞吸附现象是否消失。 这是比较可靠的病毒诊断方法
中和试验 neutralization test，NT
中和作用 血凝 血凝抑制
ELISA法
特异性高、敏感性强、操作方便，广泛用于细菌、病毒和其他病原体的临床化验室检测，特别在病毒感染性疾病的诊断中 蛋白印迹技术 Western blot 目前WHO规定该试验作为HIV感染的确认试验
正常细胞
病变细胞
三、病毒在细胞内增殖的鉴定指标
病毒的定量
TCID50
实验室微生物学检查结果：
实验室微生物学检查结果：
在实验室微生物学检查中，我们通过检查样本中的微生物种类、数量和分布情况来对实验室的环境进行评估。
实验室微生物学检查结果对于确保实验室环境的干净和无菌非常重要，这有助于防止污染和交叉感染的发生。
首先，我们利用显微镜检查样本中的微生物。
通过观察，我们能够确定样本中的主要微生物种类，如细菌、真菌和某些原生生物。
这些微生物可能对实验室的环境产生影响，因此我们需要确保实验室的环境能够支持这些微生物的生长。
其次，我们测量了样本中的微生物数量。
通过对样本中的微生物进行计数，我们能够了解到样本中的微生物种类数量，进而确定实验室中是否存在过度污染的情况。
如果样本中的微生物数量超出安全标准，那么我们需要采取相应的措施来降低微生物数量，以确保实验室的环境符合标准。
最后，我们分析了样本中微生物的分布情况。
我们注意到一些微生物在特定区域出现的频率较高，而另一些微生物则分散在样本中的不同区域。
这可能意味着某些区域可能更容易受到污染，因此我们需要特别关注这些区域，并采取相应的措施来防止污染的发生。
根据实验室微生物学检查的结果，我们得出结论：实验室的环境需要定期检查和清洁，以确保实验室的环境干净无菌。
此外，我们还需要对实验室中的工作人员进行定期的培训，以提高其对实验室环境的认识和责任感，进而减少因为操作不当而产生的微生物污染。
总之，实验室微生物学检查结果对于我们来说非常重要。
通过检查样本中的微生物种类、数量和分布情况，我们可以确保实验室的环境干净无菌，从而为实验室的研究工作提供一个安全、可靠的工作环境。
医学微生物学实验课件：实验7
[步骤与方法]
1．于试管架上放置4排小试管，每排7支，在每
血浆凝固酶有二种，一种是分泌至菌体外的， 称为游离型血浆凝固酶；另一种血浆凝固酶结合 于菌体表面并不释放，称为结合型血浆凝固酶或 凝聚因子。游离型血浆凝固酶采用试管法检测， 结合型血浆凝固酶则以玻片法测试。
[步骤与方法] 试管法：
1．取洁净小试管二支，吸取1 : 4稀释的兔血 浆各0.5ml于二试管内。
实验七 主要内容
1. 血浆凝固酶试验（1） 2. 粪便中肠道致病菌的分离与鉴定（1） 3. 肥达氏反应（1）
血浆凝固酶试验
血浆凝固酶是一种能使用枸橼酸钠或肝素抗凝 的人或兔血浆发生凝固的酶类物质。致病性葡萄球 菌多数能产生，非致病株一般不产生，故血浆凝固 酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。
血浆凝固酶试验（4人一组）
双糖铁培养基
生化反应
五糖发酵 H2S试验 吲哚试验
血清学鉴定
已知Ab检测未知Ag （玻片凝集试验）
粪便中肠道致病菌的分离与鉴定（1）
[步骤与方法]
1．用分段划线法将混合菌液接种于伊红美蓝 培养基（Eosin Methyl Blue， EMB平板） 上， 置37℃培养18~24小时。
肥达氏反应（4人一组）
排1支试管上分别标记TO（伤寒杆菌O抗原 ）、
TH（伤寒杆菌H抗原） 、PA（甲型副伤寒杆菌
H抗原 ）、PB（乙型副伤寒杆菌H抗原）字样，
并标记顺序号。
微生物感染的病原学检查法
病毒的数量与感染性测定
蚀斑测定：准确滴定病毒感染性的方法
蚀斑（Plaque）， 每个蚀斑是由一个有感染性病毒颗粒形成，
称为蚀斑形成单位（Plaque forming unit， PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示
50%感染量（ID50）或50%组织细胞感 染量（TCID50）
不能准确地测定感染性病毒颗粒的数量
细胞病变效应（CPE）
病毒的定量
TCID50
病毒感染性和毒力的指标是50%组织细胞感染量（ 50% tissue culture infectious dose）
PFU
空斑形成试验（plaque formation） 每毫升病毒悬液空斑形成单位（pfu/ml） 用于病毒浓度的精确定量
Microplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity
病毒感染的实验室诊断方法
病毒感染的快速诊断
形态学检查
电镜和免疫电镜 普通光学显微镜：包涵体
检查病毒性抗原
免疫荧光 / 固相放射免疫测定 / 酶免疫技术
病原菌的分离培养：菌落
大小 形态 颜色 表面性状 透明度 溶血性
生化反应
糖发酵试验 H2S试验 枸橼盐利用试验
血清学鉴定
利用含已知的特异性抗体的免疫血清，对 细菌（志贺菌属、沙门菌属）进行群和型 的鉴别
常用方法是玻片凝集试验
动物实验
常用动物
小鼠 豚鼠 家兔
核酸的检测
核酸杂交 PCR
病原菌抗原的检测
利用已知的特异性Ab检测Ag的方法 常用的方法有
沉淀反应（precipitation test） 协同凝集试验（coagglutination test） 免疫荧光法（immunoflorecence ,IF） 单克隆抗体技术（McAb technique）
医学微生物学：第二十五章 病毒感染的检测与防治原则
➢人工主动免疫 ➢人工被动免疫
人工主动免疫 Artificial active immunization
病毒感染的预防
➢灭活疫苗 ➢减毒活疫苗 ➢亚单位疫苗 ➢基因工程疫苗 ➢核酸疫苗
Fig Edward Jenner vaccinating (inoculating) James Phipps with cowpox material.
Successful vaccines Smallpox
Smallpox
• Variolation
Smallpox
• Jenner 1796: Cowpox/Swinepox • 1800’s Compulsory childhood vaccination • 1930’s Last natural UK case • 1940’s last natural US case • 1958 WHO program • October 1977: Last case (Somalia) • 1979 WHO announcement
注意事项
1. 减毒疫苗回复突变导致毒性增强； 2. 在免疫系统受损的人中导致疾病； 3. 导致先天缺陷，尤其是在怀孕头3个月接
种活疫苗； 4. 减毒疫苗和其他病毒重组。
Inactivated vaccines (Vaccinia, Salk) Live attenuated organism (Sabin) Subunit vaccines (HBsAg) DNA vaccines (still in effort)
Hep-2 HeLa A549 Vero
人喉癌 人子宫颈癌
人肺癌 非洲绿猴肾
无限
➢ 识别病毒增殖的方法
乙型肝炎病毒的微生物学检验
乙型肝炎病毒的微生物学检验 乙型肝炎病毒(HBV)是乙型肝炎的病原体。乙型肝炎病毒为嗜肝DNA病毒科成员，以血源性传播为主，引起急性肝炎、慢性肝炎，并与肝硬化及肝癌相关。乙型肝炎病毒抗原、抗体的血清学标志与临床关系较为复杂，必须对几项指标同时分析，方能有助于临床判断。
1 标本采集 依据SOP进行血清采集、运送和储存。免疫学检测标本可用血清或血浆，检测标本应于24h内分离血清或血浆，5天内检测标本应于2～8℃保存，5天后检测标本应于－20℃或－70℃保存。乙型肝炎病毒核酸检测多用血清，如采用血浆，其抗凝剂应选用枸橼酸盐或EDTA，因肝素可与DNA结合，从而干扰TaqDNA聚合酶作用，导致PCR呈假阴性。标本应在采集后6h内处理，24h内检测，否则应于－70℃存放。经过处理的标本或者未分离的血液标本，如果能在24h内送达，则可在室温下运送。乙型肝炎病毒具有高度感染性，在标本的采集和运送时应充分防护。
2 微生物学检验 目前主要用血清学方法检测HBsAg、抗－HBs、HBeAg、抗－HBe及抗－HBc(俗称“两对半”)，抗－Pre S1或抗－PreS2的检测不常用。HBcAg仅存在于肝细胞内，血液中难以检出，也不用于常规检查。HBsAg的检测最为重要，可发现无症状携带者，是献血员筛选的必检指标。近年来，PCR已用于乙型肝炎血清乙型肝炎病毒DNA检测。血清学方法以RIA和 ELISA最为敏感，而PCR以PCR－ELISA和PCR荧光法最常用。
3 临床诊断 乙型肝炎病毒抗原、抗体的血清学标志与临床关系较为复杂，必须对几项指标同时分析，方能有助于临床判断。
3.1 HBsAg 乙型肝炎病毒感染的重要指标。阳性见于急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。急性肝炎恢复后，一般在1～4个月内HBsAg消失，若持续6个月以上则认为已向慢性肝炎转化。无症状HBsAg携带者是指肝功能正常者，携带者的肝穿刺病理组织切片常可发现已有病变，但无临床症状。携带者可长期为HBsAg阳性，也可伴有HBeAg阳性及病毒血症，具有很强的传染性，少部分可发展为肝硬化或肝癌。HBsAg是病毒感染后产生最多的病毒抗原，对其检测能很敏感地发现病毒的感染，该指标是献血筛查必检指标，对其检测能很有效地阻断乙型肝炎病毒的输血传播。由于目前的一些检测试剂会对S基因变异株产生的HBsAg漏检，因此，对高度疑似的该类患者应进行乙型肝炎病毒DNA的检测。Pre S1和Pre S2抗原也可用免疫学方法检测，其阳性表明乙型肝炎病毒的复制活跃，与乙型肝炎病毒DNA的阳性有很好的相关性。