海藻糖生物合成及应用研究进展_何名芳_陈卫平

海藻糖生物合成及应用研究进展 曲茂华 张凤英 何名芳 陈卫平* （江西农业大学食品科学与工程学院 南昌 330045）

摘 要：海藻糖是一种非还原性二糖，是生物细胞抵抗不良环境的应激代谢产物，它可广泛用于食品、化妆品、生物医药和农业等领域。本文对最近几年海藻糖在生物细胞中的合成途经及酶调控机制、海藻糖生产合成方法及生产菌种、海藻糖对生物细胞保护作用机理及海藻糖在相关领域中的应用等研究进展进行了综述。 关键词：海藻糖，酶，合成，调控机制，应用

Research progress of trehalose biosynthesis and applications QU Mao-hua ZHANG Fengying HE Mingfang CHEN Weiping * (Institute of food science and engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China) Abstract: Trehalose, a disaccharide with non-reducing as metabolite of cell in hostile environment, was used in domains of food, cosmetic, biological medicine and agricultural. The newest research progress of trehalose including synthesis pathways with enzyme regulatory mechanism, synthesis methods with producing strains, mechanism of protection for cell and applications in relative domains was reviewed in this paper. Key words: trehalose; enzyme; synthesis; regulatory mechanism; application 中图分类号：TS245.9 文献标识码：A 文章编号:2013120023

作者简介：曲茂华（1989-），硕士研究生，研究方向为食品微生物。

*通讯作者

海藻糖是一种非还原性二糖，分子式是C12H22O11•2H2O，广泛分布于自然界中许多生物细胞中。海藻糖是一种生物应激代谢产物，一些在极端环境生长的古生菌、真菌，以及一些生长在不良环境中的动植物细胞中海藻糖含量较高。甚至在可以用于清理核污染的抗辐射型细菌如耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans ）[1]中也发现了海藻糖的存在。海藻糖在生物细胞中的作用是保护细胞抵抗不良环境的影响，其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等生物大分子空间结构和功能活性，维持渗透压和防止细胞内营养成分流失。由于海藻糖具有以上功能，它可用于医学生物制品中起到保护剂的作用[2]；增强农作物抗逆性[3]，通过转基因手段来培育耐盐碱型农作物[4]，培育抗冻果蔬等；同时，海藻糖不具有还原性，不会发生美拉德反应，可以作为稳定的添加剂应用于食品工业。因此，对海藻糖进行研究具有重要意义，本文针对海藻糖生物合成、作用机理、应用方面的最新研究进展进行综述。 1海藻糖合成的相关酶以及调控途径 1.1海藻糖合成途径 目前对海藻糖合成代谢途径的研究文献较丰富。研究发现在生物体内的海藻糖合成途径主要有以下几条：一是 OtsAB途径，通过TPS（Trehalose-6-phosphate synthase，6-磷酸海藻糖合成酶）和TPP（Trehalose-6-phosphate phosphatase，6-磷酸海藻糖磷酸酯酶）酶来形成海藻糖[5]。在酵

网络出版时间：2014-02-20 16:01网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20140220.1601.030.html 母细胞内通过TPS1和TPS2酶来合成海藻糖[6]，如酿酒酵母；而其他一些真菌中的海藻糖合成途径还有一些辅助性的且作用不是很明显的酶的参与，如TPS3和TSL1[7]。二是TreYZ途径，是在Arthrobacter sp.中发现的，通过两步催化反应来合成海藻糖[8]。三是TreS（Trehalose synthase，海藻糖合酶）途径，该途径目前只在细菌中被发现，TreS酶活具有可逆性[9]，在谷氨酸棒状杆菌中，TreS酶在细胞内海藻糖过量情况下会将海藻糖转化为麦芽糖，以调节细胞内海藻糖浓度平衡[10]。除以上几种途径外，还有两条海藻糖合成途径，分别为TreT（Trehalose glycosyltransferase，海藻糖糖基转移酶）途径和TreP（Trehalose phosphorylase，海藻糖磷酸化酶）途径，这两条途径与TreS途径一样，具有可逆的催化活性[11]。 Mladen Tzvetkov等人[12]对谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)进行研究，但研究重点在于弄清其中三条海藻糖合成途径的影响大小。研究表明，OtsAB途径和TreYZ途径是细胞内合成海藻糖的两条主要途径，而TreS途径不是细胞内海藻糖的主要合成途径。通过OtsAB途径合成1mol的海藻糖需要消耗1mol葡萄糖-6-磷酸以及1mol的UDP-葡萄糖，但通过TreYZ途径合成1mol海藻糖需要消耗2molADP-葡萄糖（用于糖原合成），并且细胞往往会优先选择TreYZ途径而不是OtsAB途径来合成海藻糖，而且在C.glutamicum培养基中添加微量的糖类碳源，细胞仅通过TreYZ途径就可以完全满足对海藻糖的需要。 1.2海藻糖合成酶活性位点及调控途径 在分子水平对海藻糖合成酶进行研究的难度相对较高，目前在此方面研究进展较为缓慢，最大突破是TreS酶与MTHase（Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，麦芽寡糖基海藻糖水解酶）三维结构测定。英国与日本科学家分别对TreS途径以及TreYZ途径中的酶类进行详细研究，从分子角度成功阐述了相关代谢途径以及酶三维结构，并阐明其中的调控机制。 英国科学家以具有产海藻糖能力的结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis）[13]作为研究菌株，对细胞内TreS酶进行检测和分析，详细阐述了海藻糖合酶作用机制及其三维结构，发现TreS酶活可以整合到其它产物的合成途径中[14]。TreS属于糖苷水解酶家族（Family GH13）[15]，其结构由两段保守区域组成，一个是催化区域（(β/α)8 barrel-like 折叠，也称TIM barrel折叠），另一个是C-末端 β-夹心结构区域。其中靠近酶活性位点的β3-β4 环状结构是钙离子结合位点，但是其功能尚不明确。β7-β8环状结构主要作用是在底物催化过程中固定底物，使底物在整个催化过程中一直固定于酶活性位点上。在催化麦芽糖时，催化反应一直在酶的活性位点上进行，其间所形成的葡萄糖单体不会释放，直到葡萄糖单体重新合成出海藻糖为止。另外，产物也是通过β7-β8环状结构固定于酶活性位点上，当产物需要释放时，β7-β8环状结构中所含的两个保守区域中的氨基酸发生替换（Ser（丝氨酸）替换了 Thr（苏氨酸）；Asp（天冬氨酸）替换了Ser），使得环状结构发生重构而失去固定作用，将产物释放到溶液中并接纳新的底物。 MTHase是海藻糖合成途径中一种重要的a-淀粉酶[16]。该酶与MTSase（Maltooligosyltrehalose synthase，麦芽寡糖基海藻糖合成酶）协同作用，切割中间产物化合物中的α-1,4糖苷键生成海藻糖，该过程对海藻糖的形成起着至关重要的作用。研究发现[17]，Asp252（天冬氨酸）与Glu283（谷氨酸）位于MTHase的催化位点处，在实验中构建突变株：D252S(Ser替换了 Asp252) 、D252E（Ser替换了Glu283）、E283Q（Gln（谷氨酰胺）替换了Glu283），同野生型菌株比较，它们的酶活性仅为对照组野生菌株酶活性的0.04%，0.03%和 0.6%。对突变株与野生型菌株所产生的MTHase进行结构分析以及底物催化试验，结果表明，使用Ser或Thr替换Asp252后，在反应时在活性位点酶与底物之间会插入一个水分子，这样会使原先的双取代机制变为单一取代机制，对Glu252 进行替换后，反应中会形成稳定的酶-底物复合物。Asp252与底物所发生的双取代反应有直接关系，Glu则控制底物或产物的释放。 2海藻糖生产应用研究 2.1海藻糖生产方法 海藻糖生产目的是为了获得高纯度海藻糖产品以及相关酶产品[18]。由于海藻糖普遍存在于生物细胞中，微生物细胞中含量更为丰富，目前在试验室和生产上制备海藻糖主要有三种方法：一是从生物细胞中提取；二是采用微生物发酵生产；三是采用微生物发酵提取相关海藻糖合成酶，采用酶法合成海藻糖。 发酵法：由于微生物生长旺、繁殖快，易于培养，采用深层发酵海藻糖具有先天的优越性，利用产海藻糖酵母、细菌等为出发菌株，选育出产海藻糖高产菌株，发酵生产海藻糖，再采用有效分离提取的方法提取和精制。 酶合成法：酶合成法是采用微生物发酵产生并提取相关海藻糖合成酶类，以各类碳水化合物为底物来合成海藻糖。酶的最大缺点是其脆弱性，容易失活，实际生产中使用相关合成酶进行海藻糖生产，要考虑保持酶活性和酶类制剂的成本，可使用酶固定化或细胞固定化技术来保护酶类。目前，海藻糖酶的固定化这方面研究比较少。 2.2海藻糖相关菌株筛选与改良 无论采用发酵法或酶法生产海藻糖，获得优良菌株对海藻糖工业化生产具有重要价值，如能采用基因工程等技术获得可在胞外积累的菌株生产海藻糖，对于提高生产效率有较大意义。 海藻糖合成方面可以使用的菌株非常广泛，包括酵母、根霉、细菌以及一些藻类都可以生产海藻糖。 在酵母菌方面，一般使用的菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）以及耐寒性酵母（Guehomyces pullulans）等，它们都可以在细胞内通过TPS1与TPS2酶催化生产海藻糖[19]，直接用抽提法从酵母菌中获取海藻糖，但是这种方法效率偏低。François J M等[20]重点研究探讨了Saccharomyces cerevisiae中与海藻糖合成有关基因调控机制，对酵母细胞内海藻糖提取工艺进行一定程度优化。 除了用酵母外，海藻糖生产菌株主要集中于杆菌属和球菌属等菌株[21]。如谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、恶臭假单孢菌（Pseudomonas putida）、浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）、丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）及耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans ）等菌株，都可以用于生产海藻糖[22]。大肠杆菌在渗透压胁迫环境中也可以积累内源性海藻糖，大肠杆菌虽然可以生产海藻糖，但需要通过基因改良除去细胞中的海藻糖酶才能应用于工业生产，并且需要进一步考察在海藻糖过量情况下海藻糖对大肠杆菌细胞的不利影响，这也是使用大肠杆菌来生产海藻糖的研究重点[23]。Mary Jackson等研究了Mycobacterium tuberculosis中海藻糖合成代谢机制[24]，并对相关基因调控进行总结，得到有效生产海藻糖的改良型突变株。结核杆