液相基础知识
高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按 键合相的表面结构为单分子键合和聚合键 合；按性质分为Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C； 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相、 非极性键合相和离子性键合相三种。
HPLC-基础知识
烃类族组成、石油中微量成分
无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、 化妆品、染料
液晶材料、合成高分子材料
无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、 甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳 烃
氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然 高分子化合物
目录
❖ 色谱分析法简介 ❖ 色谱法的分类 ❖ HPLC的特点及应用领域 ❖ HPLC的分类 ❖ HPLC相关的基本术语 ❖ HPLC的相关理论
❖ HPLC的定性分析 ❖ HPLC的定量分析 ❖ HPLC仪器的组成
输液泵 检测器 色谱柱 进样器 工作站
❖ P230的基本操作 ❖ HPLC方法的建立 ❖ 液相色谱常见问题及其对策 ❖ 液相色谱容易出问题的部件 ❖ 仪器的维修和保养
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构 水为流动相。适用于常压排阻分离
（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响 小，可在较高流速下使用 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广
c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N C18 十八烷基硅烷键合硅胶
化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快 （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击
HPLC基础知识
第一章高效液相色谱仪的特点混合物最有效的分离、分析方法。
俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素，色谱法是一种分离技术。
混合物分离过程：试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。
一相固定不动，称为固定相。
另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。
特点：高压、高效、高速、高灵敏适合高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
与GC 互补性三、液相色谱组成：（一）、输液系统泵、进样阀、色谱柱、检测器、工作站（记录仪）（二）、附件过滤装置、脱气装置、柱温箱、收集装置等等。
（三）、工作程序：液体进入泵-压力传感器-脉动缓冲器-进样阀-色谱柱检测器（四）、泵体组成部分：电机、马达、双柱塞串联泵腔、缓冲器、压力传感器、面贴（五）、检测器组成部分：1、电器部分（变压器、氘灯板、系统电源伴、控制板、显示板、前置板、面贴）2、光学部分（氘灯、灯箱、光学盒、凹面镜、分光镜、小参比、单色器、流通池、前置板）（六）、HPLC的分类1、吸附色谱Adsorption Chromatography用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂做流动相依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
2、分配色谱Partition Chromatography用载带在固相基体上的固定液做固定相，以不同极溶剂作流动相。
依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。
3、离子色谱Ion Chromatography用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定PH值的缓冲液做流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆离子交换能力的差别来实现分离。
4、体积排阻色谱Size Exclusion Chromatography用化学惰性的多孔性凝胶做固定相，按固定相对样品中组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。
又分：a、Gel Filtration Chromatography（GFC）以水为流动相的体积排阻色谱b、Gel Permeation Chromatography（GPC）以有机溶剂为流动相的体积排阻色谱5、亲和色谱以在不同基体上，键合多种不同特性的特性的配位体做固定相用具有不同PH值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子（氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核酸、核苷酸、酶等）与基体上键合的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别而实现对具有生物活性的生物分子的分离。
高效液相色谱基础知识总结
（LC-MS），有效的弥补了色谱法定性分析特征性差的弱 点，成为最重要的分离分析方法之一， LC-MS在选择性、 灵敏度、分子量测定和提供结构信息方面具有明显的优 势，能够同时获得可靠的定性定量结果，因而被广泛应 用于药物的质量控制（杂质、副产物、降解产物等的鉴 定和测定）、药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究 （包括代谢物的结构确定及定量）和临床医学研究（如 蛋白异常的研究）。 LC-MS已成为新药研究必不可少的 手段。20世纪70年代，高效液相色谱法崛起克服了
高效液相色谱基础知识总结
二、基本概念和术语
一、色谱图和峰参数 1、色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器， 所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 2、基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到 平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行 于时间轴。基线反映仪器及操作条件的恒定程度，主要 由流动相中的杂质等因素决定。
键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液 体，通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。
高效液相色谱基础知识总结
采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。若采用 极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非 极性键合相、极性流动相，则称为反相色谱。这种分离 的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子 间作用力的大小。
高效液相色谱基础知识总结
气相色谱法不能直接用于分析难挥发、热不稳定及高分 子化合物等的弱点，大大扩大了色谱法的应用范围，把 色谱法推进到一个新水平。
高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）是一种高效、快速的分离分析 技术，具有灵敏度高、选择性好的特点。HPLC具有的同 时分离和分析的功能对于体内药物分析和体内内源性物 质的分析及成分复杂的中药分析尤其重要。 HPLC的分离 功能还广泛用于药物的纯化和制备，如用制备色谱分离
安捷伦及液相色谱仪的基本知识
安捷伦及液相色谱仪的基本知识集团标准化工作小组 [Q8QX9QT-X8QQB8Q8-NQ8QJ8-M8QMN]安捷伦1100液相色谱仪各项性能指标悬赏分：5|解决时间：2010-10-16 22:13|提问者：最佳答案朋友，直接致电agilent的800-820-3278免费电话就可以得到Agilent的满意答复了系列Agilent 1100泵系统● 电子流控阀(EFC)控制的毛细液相泵系统，精度高、流速范围广柱流速范围：1-20ul/min;10-100ul/min（可选件）-2.5mmin(EFC关闭状态)● 高压制备泵系统，单元或双元高压制备泵流速范围:min● 分析型泵系统流速范围：单元泵：min二元泵：min四元泵：min品种齐全的Agilent 1100系列进样系统● 标准手动进样器（分析型或制备型）● 标准自动进样器样品瓶容量：可达100个(2mlx100)进样量：可选件● 微盘式自动进样器样品瓶容量：2x96(孔板)，2x386(孔板)或100x2ml进样量：(标准件)可选件● 微量标准自动进样器/微盘式自动进样器进样量：（标准）;（可选）● 恒温标准自动进样器/微盘式自动进样器温度范围：4-40℃可设定步进1℃● 220型微孔板式自动进样器－组合化学样品管理系统样品瓶容量：各种规格试管多达12个微孔板（96孔板,384孔板）进样量：;Agilent 1100系列检测器● 可变波长扫描紫外检测器（VWD)波长范围：190600nm● 多波长检测器(MWD)波长范围：190950nm（双灯源）● 二极管阵列检测器(DAD)波长范围：190950nm（双灯源）● 荧光检测器(FID)激发波长：200-700nm;发射波长:280-900nm光谱存储：全光谱● 示差折光检测器(RID)温控：室温+5℃至55℃内置自动吹扫阀和自动溶剂循环阀● 电化学检测器(ECD)● LC/MS四极杆质量检测器(MSD)● LC/MS离子阱质量检测器(Trap MSD)柱温箱和脱气机组件● 柱温箱温度范围：室温下10℃至80℃可选件：柱切换阀● 真空在线脱气机安捷伦1120液相色谱仪技术参数泵：流速精度：≤% RSD流速范围：，以min的增量自动进样器：进样量范围：，以的增量进样精度：<% RSD(5-100ul)，<1% RSD(1-5ul)样品容量：100个2ml样品瓶；或者2个半托盘，每个40个2ml样品瓶或15个6ml 样品瓶柱温箱：温控范围：室温上10℃到60℃温控稳定性：±0.15℃VWD：噪音：±×10 -5AU波长范围：190-600nm主要特点仪器介绍特点介绍可选5种配置系统，工厂测试，开箱即用和各种检测器兼容：示差折光检测器（RID），荧光检测器（FLD），蒸发光散色检测器（ELSD）易于使用的EZChrom Elite Compact软件，提供英中日界面LMD软件在故障发生前就可以实时通报新的最佳性能色谱柱提供可靠重现的结果附加服务：1120 液相色谱仪有五种集成的一体化配置可供选择：1.等度泵手动进样 VWD2.梯度泵手动进样 VWD3.梯度泵手动进样柱温箱 VWD4.梯度泵 ALS 柱温箱 VWD5.等度泵 ALS 柱温箱 VWD＊其中包括了硬件、软件、色谱柱和LMD分析方法此仪器尚未上传分析方法相关资料1.安捷伦1120液相色谱仪详细技术参数与资料！！相关仪器液相色谱仪(1200)2.液相色谱仪LC2100(LC2100)相关耗材1.安捷伦C8、C18液相色谱柱(规格：C8、C18)2.安捷伦氘灯(规格：Agilent 1100)3.顶空进样瓶、自动进样瓶(规格：20ml)4.色谱微量进样器、液体进样器、气体进样器(规格：ul)5.安捷伦液相色谱住(规格：C8,C18)ZORBAX StableBond SB-C18液相色谱柱(规格：Agilent SB-C18)7.真空泵、无油真空抽滤泵(规格：QP-01)8.液相色谱柱温箱(规格：JK-LCagilent1200安捷伦液相色谱仪技术参数方便地利用四种溶剂进行等梯度或梯度分析，适用于方法快速开发和快速配备流动相，以及冲洗 HPLC 系统流量范围宽，最高流速 10 mL/min ，延迟体积 800-1100 L，适用于微径柱、标准柱和半制备应用通过 Instant Pilot 组件或安捷伦化学工作站或 EZChrom 软件，可以容易地进行编程和控制包含微量真空脱气机，脱气效率高，实现了操作无障碍和最高性能，完全不需要通氦气直接从前面板快速更换维护部件通过自我诊断、内置日志和预编程的测试方法，快速判断问题早期维护反馈（EMF）长期不间断地监测仪器使用和用户预设的限度，一旦超出限度，将提供反馈信息在所有安捷伦 1200 系列 HPLC 组件范围内可升级和扩展主要特点agilent1200安捷伦液相色谱仪特点介绍同时安捷伦1200系列快速高分离液相色谱系统同样和常规高效液相色谱仪一样耐用，也保留了常规液相色谱仪的方法和工作原理。
hplc基础知识讲座
2．进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得 多（约5～30cm），所以柱外展宽（又 称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色 谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包 括进样系统、连接管道及检测器中存在 死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。 进样系统是引起往前展宽的主要因素， 因此高效液相色谱法中对进样技术要求 较严。
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料 （＜20µm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆， 然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱 内，经冲洗后，即可备用。
4．检测系统
在液相色谱中，有两种基本类型的检 测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分 离组分的物理或化学特性有响应，属于这 类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器 等。另一类是总体检测器，它对试样和洗 脱液总的物理或化学性质有响应，属于这 类检测器的有示差折光，电导检测器等。 现将常用的检测器介绍如下:
2固定相
由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此， 对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固 定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固 定液β，β′一氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇，非 极性的角鲨烷等。 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生 了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过 化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固 定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速 发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱 法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固 定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学 键合固定相上进行的。详细介绍见后。
3．流动相
在液液色谱中为了避免固定液的流失。对 流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固 定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越 显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极 性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配 色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极 性，称为正相分配色谱 正相分配色谱，它适用于极性化合物 正相分配色谱 的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性 流出顺序是极性小的先流出， 流出顺序是极性小的先流出 大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定 大的后流出 相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极 性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好 相反。
液相色谱质谱基础介绍
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质谱的调谐和校正
调谐：通过把一系列已知质荷比的标准物引入 三级四极杆并产生离子，利用这些已知离子，调整 离子光学组件上的仪器参数（电压值），以期在全质量范围获得最大传输效率，获得理想信号强度。 调谐包括控制skimmer，八极杆，透镜，四极杆和检测器等的参数。
APCI
分析物的极性
极性 25
LC-MS分析条件的选择
2. 正负离子模式的选择
正离子模式（ESI+）： *适合碱性样品分析，可用乙酸（pH=3~4）或甲酸（pH=2~3）对样品加以酸化，降低pH *流动相酸性环境： 容易加合质子
负离子模式（ESI-）： * 适应于酸性样品，含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用 * 流动相碱性环境：易失去质子 * 可用氨水或三乙胺（因产生顽固性背景102峰 [M+H]，慎用！）对样品进行碱化，增加pH
缺点：没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。
2
培训目的
认识和了解液相色谱三重四级杆质谱（1290II-6460） 掌握MussHunter Data Acquisition参数设定，学会数据采集 掌握利用Qualitative Analysis进行数据分析的基本操作
3
• 不过滤离子，所有的带电离子全都通过
B → 扫描（SCAN）
• 指在给定的质荷比范围内，依次采集每个质量数的信号
C → 选择离子监测（SIM）
• 只是采集指定的某个或某几个质荷比的离子信号
液相色谱基础理论.ppt
并非由试样所产生的峰；亦称假峰
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基础理论：术语介绍
基线－Baseline
在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线
基线飘移 － Baseline Drift
基线随时间定向的缓慢变化
基线噪声；N － Baseline Noise
由各种因素所引起的基线波动
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基础理论：术语介绍
峰面积 － Peak Area
峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差；σ － Standard Error
0.607倍峰高处所对应峰宽的一半
拖尾峰 － Tailing Peak
后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰 － Leading Peak
前沿较后沿平缓的不对称峰
调整保留体积，V’R － Adjust retention volume
戴安中国HPLC用户培训 2011年
戴安中国有限公司
液相色谱基础知识部分
液相色谱简介 液相色谱理论基础
2
高效液相色谱简介
3
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
4
经典液相色谱
石油醚 淋洗剂
叶绿素
碳酸钙 颗粒
Review Stop
叶绿素 中的有 色物质
峰底 － Peak Base
峰的起点与终点之间连接的直线
峰高 － Peak Height
峰最大值到峰底的距离
峰宽 － Peak Width
在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height
液相色谱维护基础知识共35页文档
密封圈
柱塞杆
泵头清洗管路
流动相
故障：密封圈磨损导致密封不 良
现象：系统压力波动大或漏液 措施：更换密封圈 注意点：
拆卸泵头前，柱塞杆复位 （P－SET）
2019/10/18
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14
2019/10/18
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过滤器的更换
旧过滤器的取出
2019/10/18
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新过滤器的安装
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排液阀漏液
• 故障：排液阀垫圈损伤或密封不良
2019/10/18
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5）清洗应使用专用针口清洗器
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色谱柱的日常保养
购买新柱后一定要仔细阅读说明书，确认柱的使用条件以及 清洗再生步骤，按照说明书条件测试色谱柱柱效，记录使用 压力
定期检测柱压和柱效 不同流动相之间转换时应注意溶剂的互溶性
确认样品不会在流动相中析出或带有固体不溶物，请使用 0.45um或0.2um的一次性滤膜过滤样品，或者进行前处理。
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混合器
混合器不同体积的连接方法
2019/10/18
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混合器过滤组件
常见故障：堵塞
混合器堵塞往往是由于混合 器过滤组件堵塞引起的。
处理方法：
按图中结构卸下过滤组件， 5%稀硝酸或其他溶剂超生清 洗或更换新的组件
标准或半微量混合器用 部件号：228-18872-93
2019/10/18
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进样口清洗器 手柄组件
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21ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
手动进样器
针头密封垫
操作注意点： 1）进样时，进样针应插到底
2）不使用时将针头留在进样器内
3）进样应使用液相色谱专用平头 弹簧 不锈钢套 进样针
气液相平衡方面的基础知识
气 液 相 平 衡相是指系统的某一部分具有相的物理和化学性质，具有相同的组成，并且与另外的相以一定的边界隔开。
出现在世有产品里的大多数的相相是液态烃和气相。
水也是普遍存在的另一个液态相。
在给定的系统里，当描述变化的变量随着时间和位置的改变而保持恒定时，液态烃、气相和水这些相将会平衡共存。
而决定平衡状态的主要变量是系统的温度，压力和组分。
对于设计表面分离装置和改进组分模型，不同相能够共存的条件是非常值得考虑并且具有实践价值的重要问题。
这些计算的类型是以平衡常数的原理为基础的。
一、 平衡常数一给定组分的平衡常数i K 是指组分的气相的摩尔分数yi 与液相摩尔分数xi 之比。
在数学上，它们的关系是i i i x y K /= (5----1) 在41003.7⨯2/m kg (100磅/2英寸)的压力下，Raoult 和Dalton 的定律为对于理想溶液方法提供了一个预测平衡常数的简化的方法。
Raoult 定律是指多组分系统中单一组分所产生的局部压力i P 等于它的液相摩尔分数i x 与该祖父的气相压力Pvi 的乘积即i P =i x Pvi (5----2) i P ------组分i 的局部压力，磅/2英寸) P v i ------组分i 的气相压力，磅/2英寸)i x ------组分i 的液相摩尔分数Dalton 定律是指某一组分的局部压力等于它的气相摩尔分数与系统的总压力的乘积，即i P =i y P (5----3)P------系统总压力，磅/2英寸在平衡状态下，根据上面的定律可知，被某一组分气相作用产生的局部压力必须与该液相作用产生的局部压力平衡。
因此，将描述两大定律的方程结合得i x Pvi =i y P ,整理以上关系式并代入平衡常数定义式得i y /i x =Pvi /P=i K (5----4)这个方程表明对理想溶液，不管烃类混合物的组分如何，平衡常数仅仅有体现系统压力和温度的作用。