pSV2-dhfr载体
phis2质粒序列 -回复
phis2质粒序列-回复Phis2质粒序列是一种重要的工具，被广泛应用于分子生物学研究中。
它不仅能够用于基因克隆、表达和转化等方面，还能够用于基因检测和基因治疗等研究领域。
本文将以Phis2质粒序列为主题，一步一步回答相关问题。
第一步：了解Phis2质粒序列的概念和特点Phis2质粒序列是一种常用的基因工程工具，它是由DNA序列组成的环状双链分子。
Phis2质粒序列具有多个特点，包括能够自主复制、具有抗生素抗性基因、能够承载外源基因等。
第二步：探究Phis2质粒序列的应用Phis2质粒序列在分子生物学研究中有广泛的应用。
首先，它可以用于基因克隆，即将感兴趣的DNA片段插入到Phis2质粒序列中，以便后续的研究。
其次，Phis2质粒序列还可以用于基因表达，通过将目标基因插入到Phis2质粒序列中，再将其转化到宿主细胞中，从而实现目标基因的高效表达。
此外，Phis2质粒序列还可以用于基因检测和基因治疗等研究领域。
第三步：详细介绍Phis2质粒序列的结构和构建方法Phis2质粒序列通常由多个功能模块组成，主要包括起始子、多克隆位点、抗生素抗性基因、终止子等。
构建Phis2质粒序列的方法包括PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接反应和转化等步骤。
具体而言，首先需要通过PCR扩增得到感兴趣的DNA片段，然后通过限制性内切酶切割将其与Phis2质粒序列中的多克隆位点进行连接。
连接反应可以采用DNA连接酶或Ligase酶进行。
最后，将构建好的Phis2质粒序列转化到宿主细胞中，经过培养和筛选，可以得到目标Phis2质粒序列。
第四步：总结Phis2质粒序列的优势和局限性Phis2质粒序列作为一种重要的分子生物学工具，具有多个优势。
首先，它具有较大的载体容量，能够承载较长的外源基因。
其次，Phis2质粒序列具有自主复制的能力，可以在宿主细胞内独立复制。
此外，Phis2质粒序列还可以通过添加抗生素抗性基因，实现对宿主细胞的筛选。
猪圆环病毒2型ORF2基因片段的原核表达
猪圆环病毒2型ORF2基因片段的原核表达李裕;邓舜洲;傅胜才;黄勇;高华;刘文峰;张文波;陈松昌;万文忠【摘要】猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白由ORF2编码.采用PCR技术扩增得到ORF2基因片段,克隆入pUCm-T载体,构建了重组质粒pUCm-PCV2-ORF2.根据pUCm-PCV2-ORF2测序结果设计引物,用Pfu酶扩增替换稀有密码子三联体.改造后的基因片段连接入表达载体pGEX-4T-1,并转化到BL21 (DE3)宿主菌,成功构建了GST-PCV2-ORF2蛋白大肠杆菌工程菌.经诱导表达后,对以包涵体形式存在的GST-PCV2-ORF2重组蛋白进行纯化、复性.复性后的GST-PCV2-ORF2重组蛋白具有良好的反应原性.【期刊名称】《湖南畜牧兽医》【年(卷),期】2016(000)004【总页数】3页(P39-41)【关键词】PCV2;ORF2;基因;原核表达【作者】李裕;邓舜洲;傅胜才;黄勇;高华;刘文峰;张文波;陈松昌;万文忠【作者单位】湖南省兽药饲料监察所,湖南长沙410006;江西农业大学动物科学技术学院,江西南昌330045;湖南省畜牧兽医研究所,湖南长沙410006;湖南省兽药饲料监察所,湖南长沙410006;沅江市畜牧水产局,湖南沅江413100;江西农业大学动物科学技术学院,江西南昌330045;江西农业大学动物科学技术学院,江西南昌330045;南昌金牧动物保健服务有限公司,江西南昌330013;南昌金牧动物保健服务有限公司,江西南昌330013【正文语种】中文【中图分类】S852.43猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属。
根据致病性、抗原性、基因序列的不同，猪圆环病毒分为猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。
PCV1和PCV2都广泛存在于全世界的猪群中。
PCV1无致病性。
PCV2能损伤猪的免疫系统，表现出多种病症。
这些病症有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PM W S)、皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病复合症(PRDC)、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、渗出性皮炎、坏死性淋巴结炎、仔猪先天性震颤。
新型人白细胞介素213在大肠杆菌中的表达及生物活性分析
・基础研究・文章编号:1007-8738(2003)04-316-04新型人白细胞介素213在大肠杆菌中的表达及生物活性分析王大东1,李基业1,王金惠2,徐东刚2,焦华波1,李 涛1,邓 群1,王嘉玺2,黎沾良1(1解放军第304医院普通外科,北京100037;2军事医学科学院基础医学研究所,北京100850)收稿日期:2002-07-12; 修稿日期:2002-10-20基金项目:军事医学科学院创新基金资助(No.2000304004)作者简介:王大东(19642),男,山东济南人,副主任医师,博士后.Tel.(010)66867354,Email :wangdadong @Expression of a novel human inter 2leukin 213in E.coli and its biological activity assayW A N G Da 2dong 1,L I Ji 2ye 1,W A N G Ji n 2hui 2,X U Dong 2gang 2,J IA O Hua 2bo 1,L I Tao 1,D EN G Q un 1,W A N G Jia 2xi 2,L I Zhan 2liang11Department of G eneral Surgery ,No.304Hos pital of PLA ,Bei 2jing 100037;2Institute of Basic Medical Sciences ,Academy of Military Medical Sciences ,Beijing 100850,ChinaAbstractAIM :T o expre ss a novel G ln982deleted human interleukin 213in E.coli.METH ODS :T otal RNA was isolated from J urkat cells co stimulated with PH A and ConA.A 358bp 2specific DNA frag 2ment encoding hI L 213was amplified by semi 2ne sted RT 2PCR.DNA sequencing showed that the target DNA was a G ln982delet 2ed novel splicing of hI L 213.This hI L 213cDNA and plasmid pBV220were ligated at BamH I and EcoR I site s to constructthe expre ssion vector.A fter transforming E.coli strain DH 5α,the expre ssion of the novel splicing hI L 213gene was induced by shifting culture temperature from 30℃to 42℃.The expre ssion product was then purified by chromatography on Sepharcryl 2200gel column ,and the bioactivity was detected by MTT colorime 2try on the growth of TF 21cell line.RESU LTS :The novel rhI L 213was expre ssed in the form of inclusion bodie s.A fter purification and renaturation ,the specific activity of the novel rhI L 213was 1.6×106I U/mg.CONC L USION :The novel rhI L 213with bio 2logical activity has been obtained ,which lays the foundation for treating cancer and septicemia by the cytokine in future.K eyw ords :novel human interleukin 213;cloning ;prokaryotic ex 2pre ssion摘要目的:在大肠杆菌中表达人白细胞介素213的新型拼接体蛋白。
NS2TP基因启动子报告基因载体的构建及其活性验证
６ ＮＳ２ＴＰ基因启动子报告基因载体的构建及其活性验证 高学松杨彪王琦李炜成军 【摘要】 目的 研究丙型肝炎病毒非结构蛋白２反式调节基因（ＮＳ２ＴＰ）的转录调节机制。方 法 应用ＰＣＲ方法扩增ＮＳ２ＴＰ的启动子，克隆）＇，ｐＧＬ４．１０载体，构建萤虫素酶报告基因载体，转染 ＨｅｐＧ２细胞，检测双萤虫素酶活性，验证其转录活性；通过缺失突变法构建系列截短的ＮＳ２ＴＰ基因 启动子报告基因载体。结果 成功构建了系列截短的ＮＳ２ＴＰ基因启动子报告基因载体，分别命名为 Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３￣ＩＮ４，并确定ＴＮ３为ＮＳ２ＴＰ基因的核心启动子。结论构建ＮＳ２ＴＰ基因启动子的系列截 短报告基因载体，确定了其最小转录活性区域，为进一步研究ＮＳ２ＴＰ基因的转录活性调节机制奠定理 论基础。 【关键词】ＮＳ２ＴＰ基因；报告基因载体；启动子
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｉｅｓ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＨＣＶ ＮＳ２ＴＰ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ＧＡＯ Ｘｕｅ—ｓｏｎｇ＊， ＹＡＮＧ Ｂｉａｏ，ＷＡＮＧ Ｏｉ，Ｌ１ Ｗｅｉ，ＣＨＥＮＧＪｕｎ．＊Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＧｅｎｅｒａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＢｅｉｊｉｎｇＤｉｔａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｃａｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００１５，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＣＨＥＮＧ Ｊｕｎ，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｇｊｄｔ＠ｃｃｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＮＳ２ＴＰ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ＮＳ２ＴＰ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＧＬ４．１０・ Ｂａｓｉｃ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ＮＳ２ＴＰ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｌｙｓａｔｅｓ ｏｆ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＮＳ２ＴＰ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈ ｔｒｔｍｃａｔｅｄ ＮＳ２ＴＰ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｎａｍｅｄ Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３ ａｎｄ Ｎ４，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｎ３ ａｓ ｔｈｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＮＳ２ＴＰ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ｖｅｒｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅｓｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆＮＳ２ＴＰ ｇｅｎｅ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ＮＳ２ＴＰ ｇｅｎｅ；Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ；Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ
猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM株Nsp2基因缺失片段的原核表达及免疫活性分析
黄 双 ， 王 凤 雪 ， 温永 俊 ， 高 维凡
（ １ ． 沈 阳农 业 大 学 ， 辽宁沈 阳 １ １ ０ ８ ６ ６ ；
２ ． 中 国农 业科 学 院 特 产 研 究 所 吉 林 省 特 种 经 济 动 物分 子生 物学 国 家 重 点 实 验 室 ， 吉林长 春 １ ３ ０ １ ２ ２ ）
Ｐ Ｃ Ｒ方 法 扩 增 了 Ｐ Ｒ ＲＳ Ｖ Ｔ Ｊ Ｍ 株 缺 失 片段 ｄ Ｎｓ ｐ ２ ， 利 用原 核 表 达 载 体 ｐ ＧＥ Ｘ 一 ６ ｐ 一 １构 组质 粒 转入 大肠埃 希 茵 Ｂ Ｌ ２ １ （ ＤＥ ３ ） 中表 达 ， 获得 了可溶 性 表 达 的 融合 蛋 白 （ ＧＳ Ｔ — ｄ Ｎｓ ｐ ２ ） 。 经
动物 医学进展 ， ２ ０ １ ４ ， ３ ５ （ ３ ） ： １ ５ － １ ８
Ｐｒ ｏｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎｅ
猪 繁 殖 与 呼 吸综 合 征 病 毒 ＴＪ Ｍ 株 Ｎｓ ｐ ２ 基 因缺 失 片段 的原 核 表 达 及 免 疫 活 性 分 析
猪 繁殖 与呼 吸综合 征病 毒 （ Ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｒ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ａ ｎ ｄ
ｒ ｅ ｓ ｐ ｉ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｓ ｙ ｎ ｄ ｒ ｏ ｍｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ， Ｐ Ｒ ＲＳ Ｖ） 引起 的一 种 高
度接 触性 传染 病 ， 以母 猪 繁 殖 障碍 、 仔猪呼吸困难、 并发 其他 传染 病 为 主 要 特 征 ， 是 目前 危 害 世 界 养 猪 业 的重 大 疫 病 之 一 ｌ ＿ 】 。 ］ 。Ｐ ＲＲ Ｓ分 布 于 全 世 界 所 有
流感病毒神经氨酸酶的表达及其在药物筛选中的应用
２ ０ ０ ９ ， ２ ９ （ ５ ）
杨令芝 等：流感病毒神经氨酸酶的表达及其在药物筛选中的应用
７
（ Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ ） ；Ｃ Ｃ Ｋ? ８ （ Ｄ ｏ ｊ ｉ ｎ ｄ ｏ ， Ｊ ａ ｐ ａ ｎ ） ；黑 色 ９ ６孔 板 （ ｇ ｒ ｅ ｉ ｎ ｅ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｔ ａ ｒ ） 。 １ ． ２ 仪 器 超级酶标仪（ Ｓ ｙ ｎ ｅ ｒ ｇ ｙＨ Ｔ ， ｂ ｌ ｏ ｔ ｅ ｋ ， Ｕ Ｓ Ａ ） ? １ ． ３ 方 法 １ ． ３ ． １ Ｈ ５ Ｎ １流感病毒神经氨酸酶的克隆与表达 重 组质粒的构建： 将 Ａ／ Ｖ ｉ ｅ ｔ Ｎ ａ ｍ／ １ １ ９ ４ ／ ２ ０ ０ ４（ Ｈ ５ Ｎ １ ） 毒株 神经氨酸酶的基因序列经过密码子优化，使其适合哺 乳动物细胞内高水平表达
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ ０ ９ ， ２ ９ （ ５ ） ： ６～ １ ０
流感病毒神经氨酸酶的表达 及其在药物筛选中的应用
， ２ ， ２ 杨令芝１ 李楚芳１ 林佐贤１ 孙彩军１ 陈 凌１ （ １中国科学院广州生物医药与健康研究院 呼吸疾病国家重点实验室 广州 ５ １ ０ ６ ６ ３ ） ２中国科学技术大学生命科学学院 合肥 ２ ３ ０ ０ ２ ７ ） （
［ ４
发的重要靶标。目前临床上使用的神经氨酸酶抑制剂 扎那米韦和奥司他韦在流感的预防和治疗中发挥了重 要作用。但是扎那米韦和奥司他韦在临床上的使用有 一定的局限性， 如扎那米韦的口服利用度低， 体内分布 容积小， 肾脏清除快， 只能作为局部用药； 奥司他韦在 使用过程中， 临床上出现了大量耐药病毒株
流感疫情的爆发是目前的首要任务。 流感病毒神经氨酸酶（ ｎ ｅ ｕ ｒ ａ ｍ ｉ ｎ ｉ ｄ ａ ｓ ｅ ， Ｎ Ａ ） 是流感 病毒表面的一种糖蛋白， 由病毒 Ｒ Ｎ Ａ第六节段编码， 具有糖苷外切酶活性， 它可以裂解细胞表面流感病毒 受体末端的唾液酸残基， 使子代病毒颗粒从感染细胞 膜上释放， 促进流感病毒在呼吸道扩散， 与病毒的宿主 嗜性及毒力有关
腺病毒载体的构建
腺病毒载体的构建第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1腺病毒载体的构建由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达⽔平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定⾼表达。
SOCS2⾼表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因⼦和脂质代谢基因表达发⽣了变化。
为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过⼀种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续⾼表达。
细胞导⼊外源基因是⽬前常⽤的⽅法，但是保证外源基因的⾼效表达需要合适的表达系统。
⽬前常⽤的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。
质粒载体可以导⼊外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把⽬标基因导⼊靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。
逆转录病毒可以把⽬标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。
蔓病毒本⾝对脂肪细胞的感染率⼜⽐较低。
⽽腺病毒滴度⾼，适合外源基因⼤量表达，并且可插⼊较⼤的⽬的⽚段，对细胞类型限制较⼩，可感染⾮分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。
另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作⽐较简单(Luo JY et al. 2007)。
本章克隆SOCS2基因，采⽤pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中⾼效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株脂肪组织取⾃6周龄昆⽩⼩⿏，⼩⿏购⾃第四军医⼤；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌⾁发育实验室赠送；⼈胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中⼼。
4.1.2 主要试剂限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋⽩Marker购⾃Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购⾃NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购⾃Takara公司；穿梭质粒⼩提试剂盒购⾃Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购⾃Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购⾃天根公司；OptiMem优化培养液购⾃Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购⾃Invitrogen公司。
SV40复制位点
很多真核表达载体（例如常用的pcDNA3.1）是可以在特定的真核细胞表达系统（COS等）中复制的。
这类载体带有SV40 Ori，遇到细胞中的大T抗原后可以启动复制，拷贝数可以达到10^5以上。
293T中表达SV40的T抗原，而293细胞中则没有。
293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。
用Ca3(PO4）2转染效率可高达50%。
蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。
瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外（分泌的或膜）蛋白的便捷方式。
1、猴病毒SV40 的复制起始点2、SV40基因组为5kb，双链环状DNA。
3、只有一个复制原点，包括几个必要的元件：4、5、①四个5′-GAGGC-3′序列，是大T抗原结6、合位点。
7、②一个15bp的回文结构，最早解链区域。
8、③一个只有A-T组成的17bp区域，促进解链。
(1)天然质粒只能转化细菌，它上面带有复制起点ori，以及必要的上下游序列，包括rop蛋白的序列。
质粒在细菌染色体外能自主复制，方式有两种，一种不依赖于细菌或质粒合成的蛋白质，质粒拷贝数多，称为松弛型复制；一种依赖于细菌或质粒合成的特定蛋白质，质粒拷贝数较少，称为严谨型复制。
（2）质粒载体是经过改造后的质粒，里面如果带有真核病毒的复制起点及其必要的调控序列，并在真核宿主细胞内存在相应的反式作用因子，那么这种载体也可以在真核细胞内复制。
反之，如果质粒载体上没有真核病毒的复制起点，则不能在真核细胞内复制。
目前许多载体即含有原核复制起点，以便在大肠杆菌内扩增，同时也含有SV40等真核病毒的复制起点，以便于增加目的基因的拷贝数，增强真核表达效果。
比如，带SV40复制起点的质粒载体在COS细胞（COS细胞表达反式作用因子SV40大T抗原，可以激活SV40复制起点的转录）内就可以达到10000/细胞的拷贝水平，特别适合于外源真核基因的瞬时表达。
猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及其免疫原性检测
动物医学进展,2010,31(9):6367Pr ogress in Veterinary Medicine猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及其免疫原性检测梁晓艳1,李玉林2,李兆学3,王继美2,贾丽锋1,周贺娟1,王云龙1,2*(1.郑州大学,河南郑州450002;2.河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450002;3.河南工业大学,河南郑州450002)摘要:以病猪脾脏组织为材料,提取总RNA,通过RT PCR 得到579bp 的猪圆环病毒2型(PCV 2)/ORF2片段,与原核表达载体pET32a 重组,通过菌落PCR 鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定后,证实重组质粒pET 32a/ORF2构建成功,将其转化入表达菌Balgold,通过IPT G 诱导表达,利用Ni NT A 亲和层析纯化目的产物,Western blot 验证其免疫原性,重组蛋白免疫Balb/c 小鼠,检测小鼠体内中和抗体滴度。
获得的重组蛋白包涵体的形式出现,表达量占菌体总蛋白的30%,变性纯化后纯度达90%以上,Western blot 证实重组蛋白能与PCV 2阳性血清发生反应,免疫Balb/c 小鼠45d 后中和抗体滴度达到122。
关键词:猪圆环病毒;ORF2;原核表达;免疫原性中图分类号:S852.659.2;S858.28文献标识码:A文章编号:10075038(2010)09006305猪圆环病毒2型(PCV 2)是危害养猪业的一种重要病原,可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PM WS)[1]。
除此之外,PCV 2还与猪呼吸道综合症(PRDC)、母猪繁殖障碍、猪皮炎和肾病综合征(PD NS),肉芽肿性肠炎、渗出性表皮炎及肝炎等疾病有关[26],因此PCV 2感染给养猪业造成的危害严重。
PCV 2为圆环病毒科圆环病毒属成员,是一种无囊膜、20面体对称、共价闭合、环状单股DNA 病毒。
病毒粒子直径平均为17nm,基因全长1767bp 或1768bp,有11个阅读框(ORF),其中ORF1和ORF2是最主要的阅读框[7]。
猪圆环病毒2型GD株ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达
猪圆环病毒2型GD株ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达宋长绪;蒋智勇;王贵平;高向阳;赵亚华【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2005(027)005【摘要】根据PCV2ORF2基因的序列设计两条引物从PCV2的PK15细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD-ORF2.将PCV2 ORF2基因克隆入pAdeasy腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ORF2,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2,然后用PacⅠ线性化后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒.通过荧光显微镜观察、PCR检测和Western blot检测证明PCV2 ORF2基因在293细胞内获得表达,ORF2多肽具有良好的免疫原性.【总页数】4页(P348-351)【作者】宋长绪;蒋智勇;王贵平;高向阳;赵亚华【作者单位】广东省农业科学院,兽医研究所,广东,广州,510640;广东省农业科学院,兽医研究所,广东,广州,510640;华南农业大学,生命科学院,广东,广州,510642;广东省农业科学院,兽医研究所,广东,广州,510640;华南农业大学,生命科学院,广东,广州,510642;华南农业大学,生命科学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.2;Q78【相关文献】1.两步化学转化法构建猪圆环病毒2型ORF2基因重组腺病毒质粒 [J], 郭全海;陈陆;王川庆;吴德峰;李志娟;王永生;刘扬科2.表达猪圆环病毒2型ORF2和猪IFN-γ基因重组腺病毒的免疫保护作用 [J], 裴党帅;郑念广;唐明森;夏芳;陈瑞爱;罗满林3.猪2型圆环病毒辽宁分离株ORF2基因真核表达载体的构建及鉴定 [J], 关淼4.猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定 [J], 莫永正;罗满林;陈瑞爱5.猪圆环病毒2型ORF2和猪γ干扰素基因重组腺病毒的构建及其免疫原性研究[J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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pSV2-dhfr 载体
出品公司: ATCC
质粒类型: 哺乳动物表达载体
启动子: SV40
表达水平: 高
克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶
载体大小: 4900 bp (查看载体序列)
5' 测序引物及序列:
SV40pro-F: TATTTATGCAGAGGCCGAGG
3' 测序引物及序列: SV40pA-R: GAAATTTGTGATGCTATTGC
载体标签: C-DHFR ( mouse DHFR)
载体抗性: Ampicillin (氨苄青霉素)
筛选标记: MTX (甲氨蝶呤
)
备注: pSV2-DHFR载体含有的是小鼠的DHFR基因，同时该载体是哺乳动物细胞和大肠杆菌穿梭质粒，在DHFR细胞系中，可以通过甲氨
蝶呤对转染的细胞进行筛选。
pSV2-dhfr 质粒图谱