细胞迁移

细胞迁移(cell migration) 也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。若以移动方式与型态来比较，细胞迁移是通过胞体形变进行的定向移动，

细胞迁移

这有别于其他﹔如细胞靠鞭毛与纤毛的运动、或是细胞随血流而发生的位置变化，而且就移动速度来看，相比起后两者，细胞迁移要慢得多。举例而言：成纤维细胞的移动速度为1微米/分，若以精子的平均游动速度56.44微米/秒，即3384微米/分来比较，两者约差距3000倍以上。角膜细胞（Keratocyte）即使比成纤维细胞快十倍，但是要完成从不来梅到汉堡这93公里的路程仍需要17123年。而且细胞用力甚轻。成纤维细胞胞体收缩的力只有2×10-7牛顿，而角膜细胞的则是2×10-8牛顿（一牛顿约为人用手举起一鸡蛋所用的力）。

但此细胞迁移“步缓力微”的运动特性，却是细胞觅食、损伤的痊愈、胚胎发生、免疫、感染和癌症转移等等生理现象所涉及到的。因此细胞迁移是目前细胞生物学研究的一个主要课题，科学家们试图通过对细胞迁移的研究，在阻止癌症转移、异体植皮等医学应用方面取得更大成果。也因为细胞迁移独有的运动特性，成为今生物学热门研究方向。

最新研究发现：Nudel蛋白在细胞迁移过程中通过Cdc42GAP调节Cdc42的活性，从而揭示了一条新的调节Cdc42的信号通路，对于深入了解细胞迁移的调节机制有重要意义。

细胞迁移的过程大致分为4步，①细胞前端伸出片状伪足；②细胞前端伪足和细胞外基质形成新的细胞黏附；③细胞体收缩；④细胞尾端和周围基质黏着解离，细胞向前运动。细胞迁移需要胞外、胞内信号分子调控细胞骨架动力装置所给予的驱动力与肌动蛋白细胞骨架介导的黏附所提供的锚定力之间的协调运作。多项研究表明，黏着斑、黏着斑激酶、整合素及Rho家族蛋白等在调控细胞迁移中发挥着重要作用。很多时候，迁移的发生是由于细胞感受到了来自外界的信号，例如白细胞感受到细菌释放的异常蛋白质。随后，细胞就会打开自身内部的开关，启动迁移过程。

科学家们已经发现了一种名为Cdc42的酶是其中的一个重要开关。当细胞感受信号后，Cdc42就会被鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）激活，处于“开启”状态。被激活的Cdc42分布在细胞运动前缘的区域，引起细胞骨架的极性分布，从而规定了细胞爬行的方向。然而，激活并不是无限的，活性的Cdc42可被GTP酶激活蛋白（GAP）失活，进入“关闭”状态。GEF和GAP如同两只手，一手打开开关，一手关闭开关。但是，这两只手必须协调工作，才能精确地调控细胞迁移。在过去的研究中，科学家们对“打开开关的手”研究甚多，而对“关闭开关的手”如何作用缺乏了解。朱学良研究员的小组发现一种名为Nudel的蛋白质能控制这只“关闭开关的手”，在必要时能将其与开关隔离，从而保证足够多的开关处于开启的状态。

事实上，Nudel通过与GAP结合，阻挡了GAP对Cdc42的作用。但如果Cdc42过量，也能通过与Nudel竞争结合GAP而失活。在实验中，研究人员发现缺失了Nudel的细胞爬行受到了很大干扰，在600分钟的视频中，正常细胞已经运动了很长距离，而缺失细胞则几乎在原地一动没动。这一研究揭示了一条新的调节细胞迁移开关的信号通路，对于深入了解细胞迁移的调节机制有重要意义。该研究也为认识相关疾病的机理提供了一条新线索。

肿瘤细胞侵袭试验 Tumour Invasion Assay 原理和实验步骤

一、原理

Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分 含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖 铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上 能在DMEM培养基中重建形成膜结构 这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

滤膜孔径一般为8um 而且膜孔都被Matrigel覆盖 细胞不能自由穿过 必须分泌水解酶

并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜 这与体内情况较为相似。

铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间 铺有Martrigell面朝向上

室 在下室中加有趋化剂 如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成

纤维细胞培养液 上室加入重悬的瘤细胞 具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运

动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关 选择 25ugMartrigell铺膜 16小时后观

察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面 可用棉签将上表面的细胞拭去 然后用乙醇固定滤膜 PE染色 在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Trans well小室也可进行重建基质膜侵袭分析 这一方法是在 Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上

铺上30ugMartrigel 加入细胞72h后观察结果。值得注意的是 细胞在TransWll腔中培养

72小时后 有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面 而是脱落进人下腔溶液中 因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性 可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药

物。

在上述分析中 如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间 细胞通过变形运动穿过滤膜 用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力

的影响。另外 在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN 可分析药物对肿瘤

细胞的趋化性或趋固性的影响。二、材料

1、Matrigel 基质胶 威格拉斯生物技术 北京 有限公司 10mg/ml 5ml 分装成0. 5ml/只10个EP管中 用时加入0.5ml的DMEM

Matrivgel在冰上维持液态 室温时可迅速凝结成胶。使用前应从-20℃转移至4℃待其自然溶化 如过夜放置 避免反复冻融。使用时需接触 Matrivgel的试管、移液吸头等均应预

冷于4℃ 注意无菌操作

2、24-transwell (Coster)

3、结晶紫染料溶液 结晶紫用甲醇配成0.5%的母液 使用浓度为0.1 用PBS按1 4 稀释后即为染色液

4、33%醋酸 1、溶液配制

1 溶DMEM 500ml

NE---A液 1μg/μl 1mg/ml

母液0.1ml 5mg + ddH2O up to 5 ml 过滤消毒 -20℃保存。NE---A液

1μg/μl 1mg/ml

NE-DMEM -6M

NE---A液 1μg/μl 1mg/ml 20.5μl

DMEM UP TO 100 ml

过滤消毒 4℃保存

2 NE+CGRP-DMEM -6M 100ng

Transwell细胞体外侵袭实验

采用改进后细胞体外侵袭实验分别研究不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱；粉防己碱对HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用；VEGF 对人结肠癌HT229 细胞体外侵袭能力的影响。目的:总结并改进细胞体外侵袭实验的操作经验。结果:改进后侵袭试验定位准确，结果清晰。结论：按照作者建议的方法操作，能够缩短实验时间,有助于提高细胞体外侵袭实验的质量。

细胞体外侵袭实验主要应用于各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响及一些抑制血管生成的新药研究,但在具体实验中获得真实、最佳实验结果的图像,并借以说明问题并非简单。

很多研究人员在此方面花费了很多时间和科研经费,从刺激实验用的细胞到苏木素染色,看似简单的

实验步骤中有很多环节需要研究者注意.

1. 1

Matrigel：Becton Dickinson Compary, - 20 ℃保存；

Tanswell plate：Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直径为8μm；

苏木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。

1. 2 趋化因子的制备取传代第二天长势良好的NIH3T3细胞,无血清培养基轻柔漂洗两次; 加入无血清培养基,37℃,5 %CO2 培养24 h～48h，收集细胞培养上清；4 ℃,12 000rpm 离心,10 min ,取上清；

0.22 μm 滤膜过滤除菌；分装,在- 20 ℃保存。

1. 3

transwell 培养板准备所有操作均需无菌操作。-20℃保存的Matrigel 在冰上保2℃～8℃过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取100μl Matrigel 加入冰预冷的300μl无血清培养基中,充分混均。取上述稀释的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室,覆盖整个聚碳酯膜,37 ℃,30 min ,使Matrigel 聚合成胶。已铺好Matrigel的transwell 培养板置于37℃可保存2 周。

1. 4

Matrigel 侵袭实验(Matrigel Invasion Assay)刺激后的各组细胞用PBS 漂洗3 次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液,5 ×105个细胞/ ml ,每组细胞各分为两部分。胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于95 %。Transwell 培养板上室加入100μl 细胞悬液( 5 ×104 个) 并加入无血清培养基200 ul 。Transwell 培养板下室加入500μl 趋化因子,37℃,5 %CO2 培养24 h。

用湿棉签轻轻擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。小心取出上室,用线拴住,并做好标记,用冰预冷的甲醇固定30 min。苏木素染色1 min。

梯度乙醇脱水(80 % ,95 % ,100 %) ,二甲苯透明。小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下( ×400) 随机取6 个视野[1 ] 计数,取平均数。重复实验两次。

注意事项

编辑

2. 1

NIH3T3 细胞制备的趋化因子与胎牛血清趋化因子是能使细胞产生趋化运动的一类细胞因子[2 ] 。目前利用NIH3T3 细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验的实验室比较多,时间较长且实验步骤繁琐。众所

周知,胎牛血清中有趋化因子,我们在不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用NIH3T3 细胞制备的趋化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的,两组迁移的细胞数很接近。

在实验时间上，用NIH3 T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为1 周,而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为2 d ,实验时间节省了很多。因此认为可以用胎牛血清来代替NIH3T3 细胞制备的趋化因子。

2. 2 细胞的准备所需细胞应处在对数生长期,细胞活力需大于95 %。如果细胞活力小,就会造成细胞穿透能力下降,影响实验结果。

2. 3 擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞先用干棉签将上室内液体吸去,再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去Mat rigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞,如果没有擦净聚碳酯膜上表面的细胞,在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来。尤其是细胞为圆形的时候,就会分辨不出是穿过去的细胞还是没穿过去的细胞,对于长梭形细胞来说,穿过去的细胞为长梭形,没穿过去的细胞多为圆形。

2. 4 苏木素染色上室浸泡在新苏木素中的时间为1 min ,用过多次的苏木素为2 min。在研究粉防己碱对HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用没有将多余苏木素洗去,直接脱水、透明,造成细胞图片背景模糊,细胞不清楚。

在作不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验时我们将其置于盛有自来水的烧杯中,反复漂洗几次,将多余苏木素洗去再行脱水、透明;这样做出的细胞图片背景干净,细胞清楚。

2. 5 脱水和透明时间脱水时间各为1 min ,在二甲苯中的时间不要过长,以2 min～3 min 为宜;尤其是同时操作多个样本时,时间过长就会造成部分聚碳酯膜从上室基底部自动脱落下来,上室间粘连在一起,造成样本混淆,实验失败。建议在最后一步实验时需二人协做,一人辨别并取出样本,一人小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片并及时编号。

2. 6 细胞计数当实验用的细胞为圆形时,实验人员容易将聚碳酯膜上小孔误认为细胞进行计数。我们在作VEGF 对人结肠癌HT229 细胞体外侵袭能力的影响时,发现HT229细胞很小,很容易将聚碳酯膜上小孔误认为细胞进行计数。