高效液相色谱与手性分离
高效液相色谱分析实验
高效液相色谱分析实验高效液相色谱(HPLC)是一种用于分离、检测和定量分析化学样品的分析技术，具有高分辨率、高灵敏度和高选择性。
在实验室中，HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
本文将介绍HPLC的实验原理、步骤及关键技术。
一、实验原理HPLC的原理是将混合物通过高压注射，经过固定相柱进行分离。
在HPLC中，固定相柱是最重要的组成部分之一，它可以根据样品之间的化学性质选择不同的固定相柱，如反相柱、离子交换柱、手性柱等。
在HPLC实验中，样品可以通过两种方式进样，一种是自动进样器，另一种是手动进样。
进样器将样品注入进样站点后，通过高压泵将样品推入柱子中，样品在柱子中分离后，被通过光学检测器检测，进而得到分离的结果。
二、实验步骤1.样品准备：根据实验要求，准备需要进行分析的物质样品，将其溶解或稀释到适当的浓度。
2.选择柱子：根据样品的性质选择适当的固定相柱。
例如，如果样品是极性的，则选择反相柱。
3.设定实验条件：根据样品的特征和实验需求，设置高压泵的流速、检测器、柱温等参数。
4.样品进样：将样品使用自动进样器或手动进样器进行进样。
5.柱子分离：开启高压泵，将样品推入柱子中。
样品将在柱子中根据化学性质进行分离。
6.数据检测和记录：通过光学检测器检测样品的峰值，并记录分离结果。
可以使用计算机软件进行数据分析。
7.清洗和重用：实验完成后，需要对HPLC仪器进行清洗和重置，以便下次使用。
三、关键技术1.换柱：为了保证实验结果的准确性和可靠性，柱子需要定期更换。
柱子的寿命取决于样品的特性和使用情况。
2.校准标准品：在实验中使用标准品校准HPLC仪器，以确保仪器的准确性和灵敏度。
3.优化实验条件：通过改变流速、温度、柱子等实验条件，可以优化分离效果。
4.检测器选择：根据样品的性质选择合适的检测器，例如紫外检测器、荧光检测器等。
5.数据分析：使用HPLC软件对数据进行分析，生成和保存分析报告。
四、实验安全1.注意个人防护：在操作HPLC仪器时，应佩戴安全防护眼镜和手套，避免接触有害物质。
氨基酸手性色谱分离
218Univ. Chem. 2023, 38 (10), 218–224收稿：2023-01-26；录用：2023-02-13；网络发表：2023-02-28*通讯作者，Email:*******************.cn基金资助：国家重点研发计划(2018YFC1602400)•知识介绍• doi: 10.3866/PKU.DXHX202301022 氨基酸手性色谱分离杜瑾，石宜灵，唐安娜*，孔德明南开大学化学学院，分析科学研究中心，天津市生物传感与分子识别重点实验室，化学国家级实验教学示范中心，天津 300071摘要：光学活性和立体构象不同的氨基酸，具有不同的生理活性和作用，因此，实现氨基酸的有效手性分离具有重要意义。
色谱法是常用的氨基酸手性分离方法，具有分离效率高、速度快、灵敏、成本低和绿色环保等特点，在氨基酸手性分离和检测领域应用广泛。
本文综述了色谱法在氨基酸手性分离方面的最新进展，并对其发展趋势进行了展望。
关键词：氨基酸；手性分离；色谱法中图分类号：G64；O6Chiral Separation of Amino Acids by ChromatographyJin Du, Yiling Shi, Anna Tang *, Deming KongResearch Center for Analytical Sciences, Tianjin Key Laboratory of Biosensing and Molecular Recognition,National Demonstration Center for Experimental Chemistry Education, College of Chemistry, Nankai University,Tianjin 300071, China.Abstract: Amino acids with different optical activities and stereo-configurations have different physiological activities and effects. Therefore, it is important to achieve the chiral separation of amino acids effectively. Chromatography is a commonly used method for the chiral separation and detection of amino acids, and is characterized by high separation efficiency, high speed, sensitivity, low cost, and environmental friendliness. In this paper, we review the recent progress of chromatographic methods in the chiral separation and analysis of amino acids and provide an outlook on their development trends.Key Words: Amino acids; Chiral separation; Chromatographic methods手性(Chirality)起源于希腊语，表达了某种化合物和其镜像化合物不能重叠的关系，正如人的左手和右手不能完全重叠(图1)。
《中国药典》2015版通则0512高效液相色谱法
通则0512高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
高效液相色谱测定法标准操作规程
标准操作规程1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。
2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。
3责任：QC人员对本SOP实施负责。
4容高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
4.1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
4.1.1.色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2〜8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。
通则0512高效液相色谱法
高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
高效液相色谱法对白酒中的L-乳酸和D-乳酸的手性分离和测定
高效液相色谱法对白酒中的L-乳酸和D-乳酸的手性分离和测定江锋; 赵振宇; 聂叶; 李清亮; 刘松; 王和玉【期刊名称】《《酿酒科技》》【年(卷),期】2019(000)009【总页数】5页(P93-97)【关键词】L-乳酸; D-乳酸; 高效液相色谱; 手性柱; 白酒【作者】江锋; 赵振宇; 聂叶; 李清亮; 刘松; 王和玉【作者单位】贵州茅台酒股份有限公司贵州仁怀 564501【正文语种】中文【中图分类】TS262.3; TS261.7乳酸（Lactic acid）学名2-羟基丙酸，结构式为CH3CHOHCOOH，相对分子质量为90.08，由于分子内含有一个不对称碳原子，因此具有旋光异构现象[1]，可区分为L-乳酸和D-乳酸，当两者以等比例混合时，即成为内消旋的DL-乳酸。
目前，分离和测定L-乳酸与D-乳酸手性对映体的方法主要包括酶法[2]、气相色谱(GC)[3]、气质联用(GC-MS)[4]、毛细管电泳(CE)[5]、液质联用(LCMS)[6]、手性高效液相色谱法(HPLC)[7]以及柱前衍生将手性对映体改变成非手性物质再用HPLC 测定的方法[8]。
不同的方法都有局限性，如酶法测定步骤多，酶易失活，测定误差大；EDTA 定钙法测量误差大，对乳酸的两种对映体无法精确定量，如果采用普通的有机酸色谱柱，是无法区分乳酸的两种对映体的。
自然界中天然的乳酸是L-乳酸，D-乳酸主要通过合成产生。
D-乳酸的合成方法可以分为化学合成法、酶法和微生物发酵法。
乳酸是白酒中重要的有机酸，其含量的多少对白酒的口味和后味有较大影响，国内暂无白酒中乳酸构型的文献报道。
因此，建立能快速、灵敏和高效拆分检测白酒中两种乳酸对映异构体的方法非常必要。
本研究利用手性色谱柱中青霉胺与二价铜离子配位体，对乳酸的两种对映体的络合能力的不同[9]，将L-乳酸和D-乳酸进行拆分并定量，研究了该法对于乳酸标准品和酒样样品的乳酸检测重现性，还研究了在白酒中添加L-乳酸和D-乳酸标准品后的检测回收率，最后用该法检测了20 种市售白酒中的L-乳酸和D-乳酸含量。
高效液相色谱测定抗坏血酸对映体色谱柱选择
高效液相色谱测定抗坏血酸对映体色谱柱选择高效液相色谱（HPLC）是一种广泛应用于药品分析、生物化学及环境监测等领域的分析技术。
在HPLC技术中，色谱柱的选择是十分重要的环节，直接影响到分析结果的准确性和精确性。
随着人们对药物和生物分子的研究不断深入，对于对映体的研究也越来越受到重视。
本文将围绕着抗坏血酸对映体的色谱柱选择进行探讨，并结合实验数据，从理论和实践两方面介绍高效液相色谱测定抗坏血酸对映体色谱柱的选择。
一、抗坏血酸对映体抗坏血酸是一种重要的水溶性维生素，也是人体必需的维生素，对人体的生理活动有重要影响。
抗坏血酸存在着两种对映体：L-抗坏血酸和D-抗坏血酸。
它们在化学结构上镜像对称，但在生物学活性、代谢途径和生物利用度等方面有着显著的差异。
在实际分析中，需要对抗坏血酸对映体进行分离和测定。
二、色谱柱选择的影响因素在HPLC分析中，色谱柱是影响分离和分析效果的关键因素，不同的色谱柱具有不同的分离能力和保留特性，对于抗坏血酸对映体的分离和测定，色谱柱的选择具有重要意义。
在进行色谱柱选择时，需要考虑以下几个方面因素：1. 色谱柱材质不同的色谱柱材质具有不同的特性，例如疏水性、亲水性、酸碱性等，对于抗坏血酸对映体的分离和保留具有重要影响。
常见的色谱柱材质包括正相色谱柱、反相色谱柱、手性色谱柱等。
2. 色谱柱填料色谱柱填料的孔隙结构、表面性质和粒径大小等都会影响到分离效果和保留特性，因此在色谱柱选择时需要考虑填料的选择。
3. 色谱柱尺寸色谱柱的尺寸对于柱效和分离效果同样具有重要影响，一般而言，较长的色谱柱具有更好的分离效果，但也需要更大的流速和时间。
4. 实验条件实验条件包括流动相的选择、温度、流速等因素，也会对色谱柱选择产生影响，需要根据具体的实验目的进行考虑。
色谱柱的选择是一个综合考虑多方面因素的过程，需要根据具体的实验目的和样品特性进行综合考虑。
针对抗坏血酸对映体的测定，色谱柱的选择是十分关键的。
高效液相色谱法 药典
高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注人的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1. 对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9〜4.6 mm，填充剂粒径为3〜10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm) 填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
(1) 色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提髙色谱柱的温度，但一般不宜超过60°C。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2〜8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
(2) 检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
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对含有多个手性中心的药物使用含多糖类手性固定相的高效液相色谱法进行手性拆分摘要对含有多个手性中心的药物进行手性分离是一项具有挑战性的工作。
这篇文章介绍了用多糖类手性固定相对含有多个手性中心的药物进行分离。
并且，柱转换技术在这种化合物得分离中也被应用。
关键词: 回顾;对映体分离; 手性固定相, LC;多糖; 纳多洛尔; 吲多洛尔; 奈必洛尔;地尔硫卓目录1.介绍2.含两个手性中心的药物的手性分离实例3. 含多个手性中心（多于两个）的药物的手性分离实例4. 结论5. 参考文献1. 介绍手性是一个显著的生物学过程，一个生物活性分子的对映体通常具有不同的生物学特性。
生物学作用中的对映体选择性现象并不局限于药物学，它是所有生物活性试剂（杀虫剂、除草剂、香精香料、食物添加剂等）的一个共同特征。
来源于自然物质的药物通常是光学活性或纯形式的单一异构体。
然而，那些用化学方法合成的药物通常是根据不对称中心的数目由两个，四个或者更多异构体混合而成。
因此，立体选择性在手性药物的生物利用度、分配、与受体的相互作用、异构体活动中的代谢和消除过程中所产生的差异从不期望的毒性到毫无意义增大活性。
在过去的30年中，通过高效液相色谱法（HPLC）进行手性分离已经显得越来越重要。
这可以通过以下两个方面得出：（a）间接进行手性分离的方法，包括在色谱分析法中通过一个非手性柱用一个手性衍生物试剂合成非对映异构体；（b）直接进行手性分离的方法，包括用手性固定相（CSPs）将外消旋药物拆分成相应的对映体。
基于手性固定相（CSPs）的直接分离方法因其可以快速、合适的用于分离外消旋酸盐而深受分析和制备行业的喜爱。
自然形成和合成的手性固定相（CSPs）存在着广泛的多样性，绝大多数是用于商业（超过120种）。
这些手性固定相（CSPs）中的很多在应用方面具有局限性。
因此，多糖类固定相和其它固定相，如：化学键合的蛋白质、环糊精及其衍生物、Π-型和大环抗生素已经被证明是在高效液相色谱法进行手性药物的分离中最有用的固定相。
多糖类手性固定相是由Okamoto和他的课题组于1984年提出的，它可以通过纤维素涂料和直链淀粉衍生物在预处理二氧化硅上来制备。
利用多糖型手性固定相（其结构如表1所示）时，对映体的拆分可以在正相和反相条件下完成，后者可以使用Chiralcel OD-R、Chiracel OJ-R 及最近提出的Chiralpack AD-R型手性柱。
尽管多糖类固定相之间的手性差异机理还没有被圆满鉴定，但我们确信对映体结合产生的差异是由各种引力，如氢键、疏水相互作用、偶极相互作用和电荷传递复合形式（Π-Π），之间的相互作用而造成的。
纤维素和直连淀粉衍生物中的主要手性吸附点被认为是极性酯和氨基甲酸盐基团。
这些衍生物含有的苯基基团上的所引进的取代基也会影响它们的分解能力。
另外，手性识别似乎成为适应在手性空穴或固定相通道中所溶解物质的非对称部分的一项功能。
大量含有一个手性中心的药物已经通过这些固定相进行了拆分。
经研究发现，84%的小分子外消旋体可以通过使用下列色谱柱进行成功拆分：Chiracel OD, Chiralcel OJ, Chiralpak AD and Chiralpak AS。
这些先前提到过的四种固定相对很多含有各种不同化学结构的外消旋体已经表现出了很好的分辨能力。
这个回顾总结了多糖类手性固定相（CSPs）在对一些含有多手性中心的药物进行对映体选择性分离时的效能。
在所有可能的对映体的手性分离中对这些药物的分离已经变得更加困难和具有挑战性。
2.含两个手性中心的药物的手性分离实例下面是用一种多糖类手性固定相（CSPs）成功拆分含有两个手性中心的药物的实例。
纳多洛尔(SQ11725) 是含有两个手性中心的β-肾上腺素阻滞剂。
有趣的是纳多诺尔有三个手性中心，但是其中的两个手性中心（在四氢环2-位和3-位的羟基基团）都位于顺式位置，因此将它们看做一个手性中心。
另一个手性中心是位于侧链的羟基基团。
这导致出现了两个外消旋体既外消旋体A (SQ12181) 和外消旋体B (SQ12182)，四个对映体。
这些对映体的结构如图1所示。
一种简单的等度高效液相色谱法（HPLC）被Aboul-Enein and Abou-Basha提出来拆分纳多洛尔。
将外消旋体A (SQ12181)拆分成其相应的对映体RSR-纳多洛尔(SQ12148)和SRS-纳多洛尔(SQ12150)，并将外消旋体B (SQ12182)拆分成其相应的对映体RRS-纳多洛尔(SQ12149)和SSR-纳多洛尔(SQ12151)，分别如图2和图3所示。
色谱柱Chiralcel OD常被用来从相应的纳多洛尔外消旋体中分离出每一个对映体，然而，将全部四种对映体从大量纳多洛尔(SQ11725)中完全分离出来是不可能的，因为对映体SQ12148 和SQ12149将被同时洗脱出来（如图4所示）。
据McCarthy报道，使用色谱柱Chiralpak AD在正相或反相条件下（用乙醇水溶液和二乙胺做流动相）均可以将纳多洛尔的四种对映体拆分开来。
在这个例子中，我们可以很清晰的看出直链淀粉衍生物的螺旋结构对于纳多洛尔的四个对映体的拆分起到了显著促进作用，与其相反，拥有刚性和线性结构的直链淀粉衍生物伴由于相互作用力而导致其无法分解为四个对映体。
Aboul-Enein and Serignese报道称：通过高效液相色谱法（HPLC）利用色谱柱Chiralcel OD可以将外消旋的吲多洛尔拆分成单独的对映体。
吲多洛尔包含两个位置性的异构体，给出总共四个对映体（如图5所示）。
需要采用梯度洗脱法来分离全部四种对映体，如图6所示。
由于含有两个手性中心的化合物与含有两个独立单手性中心的化合物在大部分条件下本质上是相同的。
含有两个手性中心的化合物，其中一个中心在一个手性固定相（CSP）条件下会很好的被分离，而同一个基团的另一个中心将会更有可能被另一个手性固定相（CSP）所分离。
因此，高效液相色谱法（HPLC）中柱转换技术的应用被大力推荐以完全分离出四种对映体。
柱转换技术的优点在于：(a)消除干扰组分及相关物质，（b）浓缩组分以提高其灵敏度（通过合适的传递柱），（c）确保峰的同质性。
两个手性柱耦合在一起是柱转换技术的一种方法。
然而，这种方法有一些弊端，例如：（a）所有洗脱出的峰的保留时间为两个柱保留时间的平均值，（b）对每个柱来说，流动相并不都是最佳的，（c）背压经常有点高。
表7显示了使用柱转换技术分离一个含有两个手性中心的化合物的分离结果，将其完全拆分为四个对映体。
然而，在使用两个柱中的任何一个来进行拆分时，都不能将其完全分离。
所使用的色谱柱为Chiralpack AD 和Chiralcel OA。
其它有趣的例子是将多糖类手性固定相（CSPs）成功用于分离含有两个手性中心的药物，包括：（i）使用色谱柱Chiralcel OD对α-羟基美托洛尔（一种人尿代谢物β-肾上腺素受体阻滞药物）的四个对映体结构进行拆分。
（ii）在子色谱法和（或）超临界流体色谱法中使用色谱柱Chiralcel OD将苯并硫氮型钙离子拮抗药地尔硫卓的四个对映体进行分离。
有趣的是地尔硫卓的四个对映体可以被涂有纤维素三（4-氯代苯氨基甲酸酯）的色谱柱Chiralcel OF 拆分出来，尽管分离效率较差。
此外，Yaku etal研究了在色谱柱Chiralcel OF条件下拆分地尔硫卓对映体的拆分机理及其热力学。
研究显示顺式地尔硫卓对映体的分离是焓控制的，而在考察的温度范围内用填充柱超临界流体色谱法对反式地尔硫卓对映体进行拆分是熵控制的。
然而，在高效液相色谱法进行拆分时，无论顺式还是反式对映体均为焓控制过程。
3. 含多个手性中心（多于两个）的药物的手性分离实例奈必洛尔，化学式为2 ,2′- [亚氨基二 (亚甲基 ) ]双 [6-氟 - 3,4-二氢 - 2 H - 1 -苯并吡喃 -2 -甲醇 ],它是一个含有四个手性中心的β-受体阻滞剂（24=16 个立体异构体）。
由于存在一个对称面，这些异构体中一些是完全相同的，还有一些是内消旋体。
因此，只存在十个立体异构体。
对于这个药物的拆分是手性拆分中一个比较有挑战性的工作，它在使用色谱柱Chiralpack AD的条件下被成功拆分。
奈洛必尔的十个立体异构体在等度条件下被全部分离，如图8所示。
柱温度对所有可能的立体异构体的拆分有很大影响。
在室温时，全部分析时间接近120分钟。
温度对K‘值得影响如图9所示。
在所研究的温度范围内，一些异构体的K’值减少45%，而其它异构体的保留时间在全部温度范围（25—458℃）内实际上保持不变。
有趣的是，通常在基线分离的RSRR 和RRRR异构体在这些温度下基本上是同时被洗脱出来的。
根据这些数据，我们可以得出结论：对于奈洛必尔异构体的完全分离，我们推荐在458℃的柱温条件下进行，因为（a）这样可以大幅度减少分析时间，（b）在最大K‘值是所洗脱出来的对映体具有较好的质量。
4. 结论多糖类手性固定相即纤维素和直链淀粉衍生物在分离含有两个或者多个手性中心的药物方面已经显示出了较高的效能。
使用不同的纤维素和直链淀粉衍生物做固定相从其它分子中分离出纳多洛尔、吲多洛尔和奈落必尔的立体异构体已经取得成功。
在高效液相色谱法中使用柱转换技术被大力推荐，已经成为完全拆分所有可能的对映体的一个有用方法。