手性色谱分析
手性色谱法
阿替洛尔最佳色谱条件及色谱图
流动相：正己烷-乙醇-二乙胺 –冰醋酸 (80:20:0.1:0.1，v / v / v / v) 流速：0.6mL· min-1 柱温：20℃ 检测波长：230nm
二、手性流动相添加剂法 （一）拆分原理 1.流动相中手性试剂与对映体形成非对映 配合物，在固定相中保留时间和分配不同而 拆分。 2.手性试剂吸附在柱上形成动态的手性固 定相，对映体与之作用不同而拆分。
手性HPLC法
利用手性固定相或含手性添加剂的流 动相分离、分析立体异构体的色谱法。
直接法 手性固定相法(使用手性柱) 手性流动相添加剂法(非手性柱)
间接法—手性衍生化试剂法(非手性柱)
一、手性固定相法
• • • • • • • • • 纤维素手性固定相 淀粉手性固定相 环糊精手性固定相 刷型手性固定相 大环抗生素手性固定相 手性配体交换色谱 蛋白质类 冠醚类 合成手性聚合物类
2.大环抗生素手性固定相（利托菌素、万古霉素、替考拉宁、利 福霉素） 3.蛋白质手性固定相（α—酸性糖蛋白，AGP；人血清白蛋白。 HAS；牛血清白蛋白，BSA：纤维素二糖水解酶） 特点：
(1)操作条件苛刻。（2）适用范围广。（3）主要在反相条件下
分离，流动相为近似生理条件的缓冲溶液和有机溶剂。
有关分离实验
（二）优点
1.使用常规色谱柱;2.手性添加剂选择范围宽；3.可在柱后收集纯
异构体。 （三）缺点 1 .手性添加剂消耗大；2.拆分方法的建立比较困难；3.系统平衡 时间长；4.拆分制备时需分离手性添加剂。 （四）常用的手性添加剂 离子对试剂，配体交换试剂，蛋白质，环糊精及冠醚包合试
剂和手性氢键作用试剂
（二）常用的手性衍生化试剂
1.手性羧酸类（酰氯，黄酰氯，酸酐和氯甲酸酯） 用于衍生手性醇，胺，氨基酸 2.手性胺类( 苯乙胺，二甲氨基萘乙胺和対硝基苯乙胺) 用于羧酸,N-保护氨基酸和醇类药物
氨基酸手性色谱分离
218Univ. Chem. 2023, 38 (10), 218–224收稿：2023-01-26；录用：2023-02-13；网络发表：2023-02-28*通讯作者，Email:*******************.cn基金资助：国家重点研发计划(2018YFC1602400)•知识介绍• doi: 10.3866/PKU.DXHX202301022 氨基酸手性色谱分离杜瑾，石宜灵，唐安娜*，孔德明南开大学化学学院，分析科学研究中心，天津市生物传感与分子识别重点实验室，化学国家级实验教学示范中心，天津 300071摘要：光学活性和立体构象不同的氨基酸，具有不同的生理活性和作用，因此，实现氨基酸的有效手性分离具有重要意义。
色谱法是常用的氨基酸手性分离方法，具有分离效率高、速度快、灵敏、成本低和绿色环保等特点，在氨基酸手性分离和检测领域应用广泛。
本文综述了色谱法在氨基酸手性分离方面的最新进展，并对其发展趋势进行了展望。
关键词：氨基酸；手性分离；色谱法中图分类号：G64；O6Chiral Separation of Amino Acids by ChromatographyJin Du, Yiling Shi, Anna Tang *, Deming KongResearch Center for Analytical Sciences, Tianjin Key Laboratory of Biosensing and Molecular Recognition,National Demonstration Center for Experimental Chemistry Education, College of Chemistry, Nankai University,Tianjin 300071, China.Abstract: Amino acids with different optical activities and stereo-configurations have different physiological activities and effects. Therefore, it is important to achieve the chiral separation of amino acids effectively. Chromatography is a commonly used method for the chiral separation and detection of amino acids, and is characterized by high separation efficiency, high speed, sensitivity, low cost, and environmental friendliness. In this paper, we review the recent progress of chromatographic methods in the chiral separation and analysis of amino acids and provide an outlook on their development trends.Key Words: Amino acids; Chiral separation; Chromatographic methods手性(Chirality)起源于希腊语，表达了某种化合物和其镜像化合物不能重叠的关系，正如人的左手和右手不能完全重叠(图1)。
手性色谱分析Dr.Yuan
AD，AS，OD，OJ
手性聚合物固定相Chiralcel柱类型与应用
手性聚合物固定相Chiralcel柱类型与应用
柱型号
固定相，官能团
Chiralcel OA
纤维素三乙酯
Chiralcel OB
纤维素三苯甲酸酯
Chiralcel OC
纤维素三苯氨基甲酸酯
Chiralcel OD 纤维素（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）
概念
• 许多药物中存在着分子组成与构造完全相同但分 子的立体结构不同的化合物，他们是立体异构体， 不能完全叠合但能互为镜像，（如左手与右手）， 这就是手性(chirality)。
O
N
O
NH
O
O
沙利度胺（反应停）
手性药物
• 药物作用的靶分子都是手性的，因此药物分子与靶分子的 不对称性必须相匹配（手性识别－手与手套）。
Chiralcel OE
纤维素二苄醚
Chiralcel OF 纤维素三（对氯苯基氨基甲酸酯）
Chiralcel OG 纤维素三（对甲苯基氨基甲酸酯）
Chiralcel OJ
纤酯
Chiralcel AD 淀粉三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）
Chiralcel AS 淀粉三（S）-1-苯乙基氨基甲酸酯）
Chiralcel OT(+)
聚三苯甲基乙丁烯酸酯
Chiralcel O(+)
聚吡啶二苯甲基乙丁烯酸酯
拆分化合物类型 脂肪酸族小分子化合物 脂肪酸族和芳香族小分子化合物
环戊烯酮类 生物碱，胺，莨菪碱，β－受体拮抗剂
芳香化合物 β－内酰胺，生物碱，二氢吡啶
冠醚固定相结构
大环抗生素型（Macrocyclic antibiotics）
手性高效液相色谱法
手性高效液相色谱法手性药物对映体在人体内与受体、酶等生物大分子互相作用，展现出复杂的对映体挑选性，进一步表现为不同的药理作用、代谢过程和毒性反应。
对于手性药物，可能其中一个对映体活性高、疗效好，为活性对映体(优对映体)；另外的活性低甚至没有活性的为劣对映体。
因为劣对映体没有药效或药效较低，甚至可能产生严峻的不良反应，基于此，FDA 于1992年领先发布了手性药物指导原则，我国亦于2006年颁布了《手性药物质量控制讨论指导原则》。
为了评价手性药物的生物活性，监测对映体的光学纯度，建立和进展迅速精确的药物对映体分别办法具有重要的意义。
手性高效液相色谱法通常分为挺直法和间接法。
间接法又称手性衍生化试剂法(chiral derivatization reagent, CDR)，是将对映体与手性光学试剂反应，生成一对非对映异构体之后以常规固定相分别，因此是对手性衍生物的非手性分别。
而挺直法则是采纳手性固定相法(chiral stationary phase, CSP)或将手性化合物加入到流淌相中，再用常规固定相分别的手性流淌相法(chiral mobile phase, CMP)。
手性固定相法因其用法简便快捷、重复性好、精确度高、应用范围广而倍受青睐。
一、手性色谱柱的分类目前，已商品化的手性固定相有100多种，按照手性固定相和溶剂的互相作用机制，Irving Wainer首次提出了手性色谱柱的分类体系：第1类：通过氢键、π-π作用、偶极-偶极作用形成复合物；第2类：既有1类中的互相作用，又存在包埋复合物。
此类手性色谱柱中典型的是由纤维素及其衍生物制成的手性色谱柱；第3类：基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。
这类手性色谱柱中最典型的是环糊精型手性柱，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚(苯基甲基甲基丙烯酸酯)形成的手性色谱柱也属于此类；第4类：基于形成非对映体的金属络合物，是由Davankv 开发的手性分别技术，也称为．手性配位交换色谱(CLEC)；第5类：蛋白质型手性色谱柱，手性分别是基于疏水互相作用和极性互相作用得以实现的。
chiralpak ia使用手册
《Chiralpak IA使用手册》一、引言在当今的分析化学领域，手性分析技术日渐成熟，而手性围绕着分离和鉴定的难题也越来越引起人们的关注。
其中，Chiralpak IA作为手性色谱柱的一种，具有良好的手性分离特性，被广泛应用于药物、农药、食品等领域。
在本文中，我们将以Chiralpak IA为例，探讨其使用技巧和应用领域。
二、Chiralpak IA简介Chiralpak IA是一种手性色谱柱，其固定相为纯手性有机多酰胺，具有优异的手性识别能力。
它能够对手性化合物进行有效分离，广泛应用于制药、农药、食品等领域。
三、Chiralpak IA的使用方法1. 样品前处理在使用Chiralpak IA进行手性分析前，首先需要对样品进行合适的前处理。
这包括样品的溶解、稀释以及可能的衍生化处理。
2. 色谱条件的选择在进行手性分析时，选择合适的色谱条件对于得到准确的结果至关重要。
需要根据待分离的手性化合物的特性，选择适当的流动相、进样溶剂和色谱柱温度等条件。
3. 手性分离操作将经过前处理的样品加在色谱柱中，并根据色谱条件进行分离操作。
使用Chiralpak IA色谱柱时，根据手性化合物的物理化学性质，可以实现手性化合物的有效分离。
四、Chiralpak IA的应用领域1. 制药领域在药物研发和生产中，手性分析是非常关键的环节。
Chiralpak IA色谱柱可以对药物中的手性化合物进行有效的分离和鉴定，有助于提高药物的纯度和药效。
2. 农药领域农药中的手性化合物会直接影响到其环境安全性和作用机制。
使用Chiralpak IA色谱柱进行手性分析，可以帮助研究人员更准确地了解农药的手性性质，并指导农药的合成和应用。
3. 食品领域食品中的添加剂和天然产物中也存在着大量的手性化合物。
Chiralpak IA色谱柱在食品领域的应用可以帮助监管部门对食品中的手性物质进行快速准确的分析和鉴定，以确保食品的安全性和质量。
五、个人观点和总结手性分析技术和Chiralpak IA色谱柱的应用对于现代分析化学的发展具有重要意义。
手性化合物色谱分析方法开发(一)
手性化合物色谱分析方法开发(一)1、概述首先，这里所说的手性化合物是指含有一个或多个不对称碳手性中心的对映或者非对映异构体，而不包含氮磷等含有孤电子对的手性中心化合物。
不对称性碳原子，需要具有四个不同的取代基，空间上形成不对称四面体，对映异构体之间形成镜面对称，就像人的左右手一样，不能够完全重合，如下图1所示。
Fig.1Diagram for enantiomers对映异构体具有不同的使偏振光旋转的能力，据此对映异构体可以分为左旋与右旋。
在非手性环境下，对映异构体具有相同的化学性质(化学反应特性)，相同的物理性质(如溶解度、熔点、沸点、熵焓等)以及同样的色谱保留行为等。
但在手性环境中对映异构体之间的某些性质则表现出不同，这也是手性化合物进行拆分的基础。
对映异构体需要对内消旋体与外消旋体进行区分，如下图2所示。
左右两个示意化合物结构的相同点在于均具有两个手性中心，不同点则在于左图的两个手性碳原子之间不存在对称平面或轴，而右图则存在对称平面。
因此在左图中，1S,2R与1R,2S为外消旋体；右图中1S,2R与1R,2S为内消旋体。
Fig.2Name and distinguish between mesomer and racemate对于手性化合物的拆分，规模比较大的时候，可使用其他手性试剂(如酒石酸钠)与待拆分的化合物形成非对映异构体，然后根据非对映异构体之间具有不同的物理化学性质，进行相应的分离单元操作。
而在分析实验室中，一般是采用色谱法进行拆分，其中包括使用手性固定相法以及在流动相中添加手性流动相形成手性拆分环境的方式。
其中手性固定相拆分法包括气相色谱以及液相色谱。
对于气相色谱拆分手性化合物，其拆分选择性主要取决于所使用的手性固定相的种类以及色谱分离的温度。
一般气相用于低沸点的手性化合物的拆分，对于有机酸碱等极性手性化合物的拆分，一般需要先进行柱前衍生化处理，使之形成相应的酯或者酰胺。
用于气相手性拆分的手性固定相均为环糊精衍生物类，包括β以及γ环糊精，α环糊精比较少；其最高耐受温度不会超过220℃，而且分离温度超过120℃的时候，固定相的手性选择性开始降低；超过200℃的时候，固定相的手性选择性几近与无。
手性分析之经验谈
手性分析经验谈关于手性化合物、手性分析、手性填料和手性柱，现在的理论很多，讲的也比较复杂，我看了很多也不是特别明白，做分析三年多，分过的手性化合物最少也有几千种，拿到手里的消旋体几乎没有分不开的，没用到什么理论，主要都是经验，这里还是拣最实用的来讲。
手性分析可以使用普通的色谱柱，需要流动相中添加手性分离试剂，也可以直接用固定相为手性填料的手性色谱柱，前者使用较少，大家更多的是使用商品化的手性色谱柱。
手性分析包括气相和液相两种，这个主要和样品的物理性质有关系，现在的手性化合物绝大多数都不能做气相，所以气相手性色谱柱无论从数量还是质量上来讲都不能与液相手性色谱柱相提并论。
一、手性柱手性分离最重要的是选择一根好的手性柱，说到手性柱就不得不提大赛璐，做手性分析的都知道，大赛璐的手性柱目前市场占有率最高，大家最熟悉的可能是OD- H，很多文献中都有报道。
大赛璐公司最初有四种填料，结构类似，对应的色谱柱分别是OD、AD、OJ和AS，粒径10um，后来填料粒径变为5um，就是卖的最多、使用范围最广的柱子，号称四大金刚，分别是OD-H、AD-H、OJ-H和AS-H，在柱子名称后边加“-H”，意思应该是高效，这些柱子都只能做正相使用，为了在反相色谱中使用开发的柱子在相应的色谱柱名称中添加了一个“R”，上述色谱柱都属于涂覆型填料，不耐溶剂，使用起来受样品溶解性的限制，最近又开发了键合相手性柱，可以使用几乎所有的常见溶剂做流动相，新的溶剂还提供了新的选择性，进而提升了色谱柱的分离能力，主要是IA、I B和IC，其中IA对应AD-H，IB对应OD-H，IC是新开发的填料。
和反相柱的发展趋势一样，大赛璐的手性柱也通过减小粒径来获得更高的柱效，最新的手性柱填料粒径是3um。
另外大赛璐还有其它一些手性色谱柱，但是远不及上述几种。
关于大赛璐手性柱的详细资料官方网站上讲的很详细，大家有兴趣可以去看，这里主要讲我的使用经验。
最近大赛璐公司的销售和技术曾经来过我们公司做讲座，因为我们先后买了他们三四十只手性柱，一直是自己摸索着使用，理论上的东西懂得很少，非常希望专家的能给我们提供指导，提升我们的技术水平，这个讲座的ppt网上流传的很多，对初学者来讲确实非常不错，但是专家的水平让我们实在不敢恭维。
手性色谱法的原理和应用
手性色谱法的原理和应用
1. 手性分析的背景和意义
•手性分析的定义和基本概念
•手性分子的特点和性质
•手性分析在生命科学、药物研发和环境监测中的重要性2. 手性色谱法的基本原理
•手性分离的基本原理
•手性色谱法的基本概念和基本步骤
•手性色谱法的主要工作原理
3. 手性色谱法的应用领域
•药物分析和药代动力学研究
•生物活性物质的分析和研究
•食品和农产品中的手性分析
•环境监测中的手性分析
•化学合成中的手性分离和合成
4. 手性色谱法的仪器设备和方法
•手性色谱柱的选择和使用
•手性色谱法的检测器选择和使用
•手性色谱法的常用操作方法和技巧
5. 手性色谱法的应用案例
•手性色谱法在药物研发中的应用案例
•手性色谱法在食品安全领域中的应用案例
•手性色谱法在环境监测中的应用案例
6. 手性色谱法的发展趋势和展望
•手性色谱法在分析化学中的地位和作用
•手性色谱法的发展趋势和挑战
•手性色谱法在精准医学和环境保护领域的应用前景7. 结论
•手性色谱法是手性分析的重要手段
•手性色谱法在药物研发、环境监测和食品安全等领域具有广泛的应用前景。
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手性异构体在药理学效应上的差异
Pfeiffer规则：
对映异构体之间的生物活性存在着差异；
不同的对映体之间活性的差异是不同的；
当手性药物的有效剂量越低，即药效强度越高时，则对映体之间的药理作用的差别越大。
外消旋体和其两种单一对映体是不同的3种实体！
5
对映体与生物大分子的三点作用
手性分子的a、b、c三个基团与受体分子的活性作用点、、结合，是高活性对映体（优映体）。
烯类手性药物：衍生化成水性铂复合物。
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手性固定相法（CSP）
原理：将手性试剂化学键合到固定相上与药物对映体反应形成暂时的非对映体对复合物，这种固定相称作CSP。
在CSP表面所形成的非对映体对，可根据其稳定常数不同而获得分离。（三点结合模型）
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“三点相互作用”
●对映体和手性固定相之间，至少需要三个同时发生的分子间相互作用力起作用，而其中至少有一个必须是立体化学相互作用。
发展趋势：
劣映体本身或其代谢物产生毒副作用，不再使用外消旋体。外消旋体转换成单一对映体，不仅提高质量，还延长药物寿命。
如：氧氟沙星的左旋异构体活性更强，左旋氧氟沙星临床使用剂量是消旋体的一半。
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手性拆分（Chiral resolution）
对映体除了偏振光的偏转方向不同外，其它理化性质完全相同，因而分离难度大。
手性待测物必须具备反应活性基团，如胺基（-NH2），醇基（-OH），羧基（-COOH），以保证与CDR反应完全；
生成的非对映体光学稳定，柱效要高，能有效检测。
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胺类对映异构体
异硫氰酸酯（ITC）
常用试剂有苯乙基异氰酸酯（PEIC）、2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯（GITC）。
流动相中可加入不超过5%有机溶剂。
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分类
白蛋白柱（HSA、BSA）
糖蛋白柱：α1-酸糖蛋白柱（α1- AGP）
酶类
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α1-酸糖蛋白柱拆分西酞普兰对映异构体
色谱柱为Chiral-AGP柱（150 mm×4.0 mm，5μm）
柱温为25℃；
流动相为50 mmol/L醋酸铵缓冲液（乙酸调pH至4.1），
广泛应用于氨基酸及其衍生物、麻黄碱类、肾上腺素类、肾上腺素拮抗剂、儿茶胺类等药物的分离分析。
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GITC衍生化分离胺类对映异构体
反应原理
在三乙胺存在条件下进行，于乙腈、二氯甲烷或DMF中进行。
19
色谱分离和前处理条件优化
流动相组成和流动相pH对拆分的影响
（1）降低甲醇含量改善分离度，保留时间增加；
（2）未衍生化的羧酸基对pH值比较敏感。
●这种稳定性相差越大，则相互分离的可能性就越大。
Y为S性手性选择剂，X为外消旋体
27
28
蛋白质类手性固定相
将蛋白质固定到硅胶上，利用蛋白质分子结构中的L-氨基酸提供手性作用位点与手性药物对映体产生不同ห้องสมุดไป่ตู้氢键作用、静电作用、疏水作用、离子对作用等达到手性拆分。
常用流动相为磷酸盐缓冲液（pH 4 ~ 7），
1
手性高效液相色谱法
*手性药物分析的概念
*常用手性高效液相色谱法
手性衍生化试剂法
手性固定相法
手性流动相添加法
2
手性的概念：一种镜像反射的对称性
3
手性分子：组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体。
分子结构中含有不对称碳原子是最常见的手性结构。
根据对偏振光的作用不同可分为R、S体，两者的等量混合物称之为消旋体。
（+）伪麻黄碱（-）伪麻黄碱
13
色谱条件：色谱柱：苯基柱150mm×4.6mm，I.D. 5mm；流动相：三乙胺-水（含50mmol·L-1磷酸二氢钾，磷酸调pH至4.0）-甲醇（0.01∶90∶10, v/v/v）；流速1.0 mL·min-1；检测波长：210nm；柱温：室温。
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手性高效液相色谱法（Chiral HPLC)
衍生化时间及GITC用量的优化
（1）反应时间：10 min ~ 30 min
（2）用量：过量两倍
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手性拆分结果
色谱条件：C18色谱柱，流动相：甲醇∶1%三乙基乙二氨四乙酸（TEAA缓冲）（pH = 5.5），检测波长254 nm；1 ml/min。
前处理：药物溶于含三乙胺乙腈水溶液，取50μl该溶液，加入50μl含2 g/L GITC的乙腈溶液，混合均匀后室温下放置10 min ~ 30 min，进样分析。
手性分子的a、b、c三个基团中只有a和b与受体分子的活性作用点和结合，是低活性对映体（劣映体）。
6
在未研究清楚两种单一对映体之间的生物学差异时，以消旋体给药往往会影响药物质量，甚至会严重损害人体健康。
“反应停”(Thalidomide)作为人工合成药，当时投入使用时是两种对映体的混合物。
7
反应停：五十年恩怨
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拉贝洛尔的GITC衍生化
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不同结构的药物衍生化策略
胺基类手性药物：运用异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（IC）类、手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生化为酰胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲和磺酰胺。
羧基类手性药物：运用手性胺类衍生化试剂，将其衍生化为酯和酰胺。
醇类手性药物：运用手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生化成酯。
手性色谱拆分方法：创造（或引入）手性环境，构造非对映异构体，使药物对映体间呈现理化特性的差异，从而实现药物对映体的色谱分离。.
11
组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体；不成镜像的分子，称之为非对映异构体，分子中所含手性碳越多，非对映异构体的数目越多.
非对映异构体
（-）盐酸伪麻黄
（-）麻黄碱（+）麻黄碱
●手性选择剂与对映体中的一种进入一个与立体相关的三点相互作用的稳定状态，而另一对映体则只能两点作用形成不稳定状态。
●这种稳定性相差越大，则相互分离的可能性就越大。
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“三点相互作用”
●对映体和手性固定相之间，至少需要三个同时发生的分子间相互作用力起作用，而其中至少有一个必须是立体化学相互作用。
●手性选择剂与对映体中的一种进入一个与立体相关的三点相互作用的稳定状态，而另一对映体则只能两点作用形成不稳定状态。
手性衍生化试剂法（CDR）（分析物）
手性固定相法（CSP）（固定相）
手性流动相添加法（CMP）（流动相）
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手性试剂衍生化法（CDR）
原理：
光学活性药物与有高光学纯度的手性试剂于分离前衍生化，在药物对映体中引入另外一个手性，形成非对映异构体，再以HPLC分析。
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手性反应注意事项
手性试剂为高光学纯度试剂，光学稳定性好：