基因工程 考试 重点 噬菌体载体
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
基因工程载体(质粒)(三)
从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞
(高频重组细胞)。
F因子是雄性决定因子，F+ 细胞表面可以形成 一种叫做性须（pilus）的结果，它促使F+ 经 性须进入F- 细胞。F- 细胞则变为F+ 细胞。F因 子可以通过接合作用自我转移，也能够带动寄 主染色体一道转移。但F因子的这种整合过程 是可逆的。在一定条件下，Hfr细胞又可重新 变为F+或F-细胞。 基因工程多选用非接合型质粒，主要安全角度 考虑
常用的是抗生素抗性基因的选择标记。主要有： 四环素（Ter），氨苄青霉素（Amp），氯霉 素（Cm），卡那霉素（Km）。新霉素（Neo） 等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成 AmPr，反之则写成AmPs，。带有抗药性质粒 称为R质粒。一个质粒载体通常有二种抗生素 抗性基因
新的质粒还带有下列标记基因，使于筛选重 组体： ①HA ②Luaferase ③GFP ④便于检测的多肽
非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一 种接合型质粒，那么它们通常也是可以 被转移的。这种由共存的接合型质粒引 发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒 的迁移作用（mobiligation）又叫质粒 的诱动。
带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R 质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。 如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合 型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的 接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁 移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1 是一种可以
钝化了一个抗性基因，保留了另一个抗性基因。插入失活型载体，就是将 外源DNA片段插入到会导致选择性基因(Ampr，Tetr等)失活的位点。如
基因工程-载体
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。
4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。
②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。
③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。
5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
基因工程复习提纲
基因工程复习重点一、载体PTXBⅠOri 原核生物复制起点T7 promotor T7启动子是最强的启动子，指导转录起始。
Lac opterator 乳糖操纵基因，可被Lac I编码的阻遏蛋白结合抑制转录。
SD 原核生物翻译起始时核糖体的识别序列位于mRNA上MCS 多克隆位点可插入外源基因，不影响其复制。
内含多个酶切位点、如图。
Intein 内含肽CBD chitin binding domain（几丁质结合位点）可与Tag（亲和标记）结合Stop code 终止密码子Amp氨苄抗性基因可用作抗性筛选的重要标记Lac I 乳糖调控基因编码阻遏蛋白二、质粒提取原理：答：三种溶液：溶液1：50 mmol/l 葡萄糖- --维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解；25 m mol/l Tri· Cl （pH 8.0)---维持pH;10 m mol/l EDTA (pH 8.0)------螯合Ca2+, DNase 失活，保护DNA溶液2：0.2 mol/ NaOH----------核酸变性（pH>12或pH<3) (解链）1% SDS-----------------蛋白变性，裂解细胞。
溶液3：7.5 mol/L NH4AC （pH 7.6) -------沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性（可溶）。
其它溶液：(1)2M NH4AC------------------------------沉淀蛋白，溶解核酸；(2)异丙醇-----------------------------沉淀质粒(3)70％乙醇----------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。
(4) RNase--------------------------------除去细菌RNA过程及作用：(1) 1.5 ml 菌液，12000 rpm * 1 min, 弃上清（repeat) －－收集细菌(2)溶液1 (200 ul), 剧烈混匀－－－－－－－－－－－－－提供缓冲液(3)溶液2 (400 ul)，温柔混匀，冰中5 min;－－－－－－－裂解细胞，蛋白核酸变性(4)溶液3 (300 ul), 温柔混匀，冰中10 min;－－－－－－－质粒复性(5)13000 rpm* 5 min, 取上清；－－－－－－－－－－－－除去细菌蛋白，基因DNA(6)540 ul 异丙醇，室温10 min;－－－－－－－－－－－－沉淀质粒(7)14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－－－－－－－－除去可溶性杂质(8)100 ul 2M NH4AC(9)13000 rpm* 5 min, 取上清；(10)100 ul 异丙醇，室温10 min;(11)14000 rpm * 10 min, 弃上清；(12)70%乙醇500 ul, 14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－除去异丙醇，盐分(13)烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－除去乙醇(14)50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA(15)电泳鉴定三、连接反应答：1、总体积为10 ul ；2、16 ℃连接过夜；（为什么是16 ℃？答：连接反应包括两步一是将碱基50%连接（变性）：Tm=2（A+T）+4（G+C），一般在8℃左右。
基因工程概论考点
五位诺贝尔奖获得者，和工作的意义沃森，克里克：DNA双螺旋结构，半保留复制。
解决了DNA的自我复制和传递的问题。
意义：对生命科学的发展作用可与达尔文学说媲美，与孟德尔定律齐名。
从而使遗传学的研究全面进入分子遗传学阶段Paul Berg小组完成了首次体外重组实验：将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来Stanley Cohen 1986年 Nobel生理或医学奖。
把非洲爪蟾编码核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。
这是第一次成功的基因克隆实验。
Khorana基因的体外分离技术PCR技术的发明K.Mullis基因工程的基本操作程序分离获得目的基因限制性核酸内切酶将切割外源DNA和载体DNA连接酶将外源DNA和载体连接，组成重组DNA分子。
将重组DNA分子转移到受体细胞带有重组体的细胞培养扩增，获得大量的细胞繁殖群体筛选和鉴定转化细胞进一步研究分析，实现功能蛋白的表达基因工程载体能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。
要求载体DNA 上要有合适的限制性核酸内切酶位点容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。
易于克隆操作质粒的一般生物学特性复制性（一般来说，一个质粒只有一个即复制子）质粒的不相容性(incompatibility)同一复制系统的不同质粒不能稳定地和平共处，称之为不相容性，也称之为不亲和性。
确切的说，两个密切相关的质粒通常不能在同一宿主菌的子代细胞中共存。
这可能有两方面解释a、复制竞争性：复制酶或控制质粒复制的阻遏物近似或相同，可以调节对方的复制，在子细胞中质粒分配彼此竞争，将很快导致一些细胞含有一种质粒，而另一种细胞可能只含有另一种质粒。
基因工程原理-复习资料
基因⼯程原理-复习资料0、基因⼯程的技术基础和理论基础1）理论基础：40年代确定遗传信息携带者，即基因的分⼦载体是DNA⽽不是蛋⽩质，明确了物质基础50年代确定DNA的双螺旋模型和半保留复制机理，明确⾃我复制和传递60年代提出中⼼法则和操纵⼦学说，破译遗传密码，阐明信息流向和表达。
2）技术基础：60年代的琼脂糖凝胶和Southern转移杂交技术，⽤于DNA分离和检测60年代初70年代末，发现限制性内切酶和DNA连接酶，实现体外切割70年代中期，实现DNA分⼦的核苷酸序列分析技术80年代实现体外重组DNA并进⼊宿主细胞1、基因⼯程研究的主要内容或步骤①从⽣物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有⽬的基因的DNA⽚段；②在体外，将带有⽬的基因的外源DNA⽚段连接到能够⾃我复制载体分⼦上，形成重组DNA分⼦；③将重组DNA分⼦转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之⼀起增殖；④从⼤量细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分⼦的受体细胞克隆；⑤从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的⽬的基因，供进⼀步分析研究使⽤；⑥将⽬的基因克隆到表达载体上，导⼊寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产⽣出⼈类所需要物质。
2、三位⼀体的基因概念①基因既是携带⽣物体遗传信息的结构单位，⼜是控制⼀个特定性状的功能单位。
②基因是染⾊体上的实体③基因象链珠(bead)⼀样，孤⽴地呈线状地排列在染⾊体上基因是功能、突变、交换“三位⼀体”的最⼩的、不可分割的、基本的遗传单位。
3、⼀位⼀体的基因概念基因是⼀个具有特定功能的、完整的、不可分割的最⼩的遗传单位。
基因内可以较低频率发⽣基因内的重组和交换。
4、顺反⼦假说1个顺反⼦决定1条多肽链。
能产⽣1条多肽链的是1个顺反⼦，Cistron是基因的同义词。
在⼀个顺反⼦内，有若⼲个突变单位：突变⼦(muton)。
在⼀个顺反⼦内，有若⼲个交换单位：交换⼦（recon）。
载体的种类6
一 质粒（plasmid）载体
（一）质粒（plasmid）概述
质粒是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股 DNA（部分质粒为RNA）。 ,存在于细胞质中，质粒编码 非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、 毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可 丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建 的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切 位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。
质粒电泳图
2 大肠杆菌质粒的类型
F因子F进因供编子体码编菌在码向在细受细菌体菌菌表表传面面递产产色生生体性性D菌N菌A毛或毛。质。F粒因F。子因F的子因特的子性决特为定性可编以为码促可 以促的进性供菌体毛菌可在向供受体体与菌受传体菌递间色形体成D交N通A通或连质接粒结。构，F因从子而 决 定编可码使的两性个菌杂交毛细可菌在间供形体成胞与浆受内体连菌接间桥。形成交通连接结构，
（3）λ噬菌体的衍生物 λ噬菌体:λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子， 它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在 细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒， 裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内 λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子 代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。液体 培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的 噬菌体颗粒。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十菌体 裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体 DNA来开展进一步的工作。
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第二章 DNA重组克隆的单元操作练习题噬菌体载体(练习题)一、填空题1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。
2．第一个报道的全测序的单链DNA 噬菌体是φX174，DNA 长5386 个碱基对，共个基因，为一环状DNA 分子，基因组的最大特点是。
3．λ噬菌体的基因组DNA 为kb，有多个基因。
在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按复制，成熟包装(晚期复制)则是按复制。
它有一个复制起点，进行向复制。
λ噬菌体的DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。
其原因主要是在λ噬菌体线性DNA 分子的两端各有一个个碱基组成的天然黏性末端。
这种黏性末端可以自然成环。
成环后的黏性末端部位就叫做位点。
4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为kb，插入的外源片段最大不超过kb。
5．野生型的M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是和。
6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS 位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。
从酶切点看，插入型为个，取代型为个。
8．野生型的丸噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。
9．M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) (2) (3) 。
10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。
11 ．M13 单链噬菌体基因2 和基因4 之间的IG 区有三个最重要的功能，即(1)(2) (3) 。
12．野生型的M13 有10 个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：和。
13．以λ噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA 的长度是不同的，前者为kb，后者为kb。
14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA 片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。
二、判断题1. 取代型载体(replacement vector)是指同一种限制性内切核酸酶在),DNA 中具有两个切点，外源DNA 通过取代这两个切点间的片段被克隆。
2. 现在最常用的pUC 载体是pUCl8,它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制。
另外，这种载体可在辅助质粒的帮助下合成单链DNA。
3. 噬菌粒(phagemid)pUCll8／pUCll9 载体是集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体，既能合成单链DNA,又能合成双链DNA。
4. λ噬菌体DNA 和M13 单链噬菌体DNA 在成熟前的DNA 复制都是用滚环模型。
5. M13 噬菌体每个世代裂解宿主后，可释放100 个子代噬菌体。
6. 以黏粒为载体的重组体虽然在平板上生长的速度不同，但是转化子中插入片段的扩增量是相同的。
三、选择题(单选或多选)1. 限制性内切核酸酶EcoRI 在野生型的丸噬菌体DNA 中有5 个切点、Hind Ⅲ有7 个切点，BamH I 也有5 个切点。
调整这些酶切位点的数量，主要通过( )(a)体内突变(b)完全酶切后连接(c)部分酶切(d)先用甲基化酶修饰后再酶切2. PBluescript Ml3 载体在多克隆位点的两侧引入了T7 和T3 两个噬菌体的启动子，这样增加了该载体的功能，如：(a) 可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析(b) 利用这两个启动子的通用引物进行PCR 扩增(c) 利用通用引物进行序列分析(d) 利用这两个启动子进行定点突变上述四种功能中哪一种是不正确的?( )3. 下面关于细菌人工染色体(BAC)的特征描述，除了( C )外都是正确的。
(a) 通过电激法将大质粒转化大肠杆菌比酵母的转化率提高了10—100 倍(b) BAC 载体在细菌中以环形超螺旋状态存在，使分离操作起来相对容易(c) BAC 载体在大肠杆菌宿主保持高拷贝(d) 克隆到BAC 载体上的外源片段可以直接进行测序以获得末端序列4. 以黏粒为载体转染受体菌后，平板上生长的菌落会大小不一、生长速度不一的现象，其原因是( )(a) 营养成分不足(b) 重组后的质粒复制不稳定(c) 重组后的黏粒整合到宿主染色体上(d) 重组体中插入片段的大小不同5. M13K07 是一种辅助噬菌体DNA,可用它帮助噬菌粒制备单链DNA,这是因为( )(a) M13K07 能够进行滚环复制，得到大量的单链噬菌体DNA(b) M13K07 能够提供成熟包装的蛋白(c) M13K07 提供了成熟包装所需的信号(d) M13K07 的10 个基因都是正常的6. 黏粒(cosmid)是一种人工建造的载体，( )(a) 它具有COS 位点，因而可进行体外包装(b) 它具有质粒DNA 的复制特性(c) 进入受体细胞后，可引起裂解反应(d) 进入受体细胞后，可引起溶源化反应7．Mu 噬菌体也是一种转座元件，这种转座元件( )（a）可引起寄主的突变（b）可用于细胞内的基因工程（c）具有转座酶基因（d）以上说法都正确8．关于M13 的IGIX,下列说法中哪一项不妥当?( )(a) 具有正负链的复制起点(b) 具有噬菌体DNA 被包装的信号(c) 具有150 个碱基的AT 富集区(d) 具有八个回文序列，可形成五个发夹环9. M13 噬菌体基因组编码10 个基因，在它的成熟过程中起调节作用的蛋白是( )（a）gp2 蛋白(b)gp5 蛋白(c)gp7 蛋白(d)gp9 蛋白四、简答题1．在转导过程中，通常需要把受体菌和在供体中生长的噬菌体悬浮液分别铺在选择性培养基上，为什么?2．如何将野生型的九噬菌体改造成为一个理想的载体?3．用Sal I 切割从噬菌体J2 分离的DNA 时，得到8 个片段，分别是：1.3、2.8、3.6、5.3、7.4、7.6、8.1 和11.4kb。
但是，用SaI I 切割从被感染的寄主细胞中分离到的J2 噬菌体DNA 时，只得到7 个片段，分别是:1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9 和11.4kb，根据这些结果，您得到哪些信息?4．在cⅠ基因正常时为什么也会出现浑浊的噬菌斑?不正常则是清亮的噬菌斑?5．λ噬菌体DNA 被包装到噬菌体的头部，需要哪些基本条件?为什么?五、问答题1．为什么野生型的λ噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体?2．什么是蓝白斑筛选法?3．蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?4．什么是c I 筛选法?5．λ噬菌体载体具有哪些优点与不足?6．什么是M13 的IG 序列区?有何特点和功能?7．将野生型的M13 改造成基因工程载体，首先是进行酶切位点的改造，请问M13 中的EcoRⅠ最初是如何引入的？8．以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体？9．M13 系列载体具有哪些优缺点？10．黏粒载体具有哪些特点与不足？11．辅助噬菌体DNA 和相应的噬菌粒是如何协同工作的？噬菌体载体(参考答案)一、填空题1．它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA 的扩增；对某些噬菌体(如λ噬菌体) 的遗传结构和功能研究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽2．10；基因的重叠3．48．5；60；凯恩斯模型；滚环；双；12；COS4．36；145．没有合适的限制性内切核酸酶识别位点；选择标记6．质粒；丸噬菌体；457．1；28．(1)分子量大，(2)酶的多切点，(3)无选择标记9．(1)SS---~RF；(2)RF---~RF；(3)RF-*SS10．复制区；IG 区11．(1)正链复制起点；(2)负链复制起点；(3)包装信号12．基因Ⅱ；基因Ⅴ13．100kb；200kb14．75％一105％二、判断题1．错误。
不一定是同一种酶，如果两种不同的限制性内切核酸酶在载体上各只有一个切点，两切点间的片段被取代后又不影响噬菌体的生活力，也是取代型载体。
2．错误。
pUCl8 没有IG 区，不可能形成单链。
3．错误。
如果没有助手噬菌体的存在，则不能形成单链DNA。
4．正确。
5．错误。
M13 噬菌体不会使宿主裂解，导致噬菌体从细胞释放出来。
6．错误。
由于重组体在乎板上生长的速度不同，转化子中插入片段的扩增量就不相同，三、选择题(单选或多选)1．a；2．d；3．c；4．d；5．d；6．a，b，c；7．d；8．d；9．b四、简答题1．答：这些平板起对照作用。
第一个对照实验可检测和估计自发突变为野生型的频率；第二个对照实验确证噬菌体悬液中无菌情况(即不能有任何活的供体细菌)。
2．答：(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)；(2)削减酶切位点；(3)添加选择标记；(4)引入终止突变3．答：(1)J2 噬菌体是一种双链线性的DNA 分子；(2)基因组全长是47．5kb；(3)进入宿主后成环状；(4)5．3 和3．6kb 的片段分别位于线性DNA 的两端。
4．答：正常时，既有裂解途径也有溶源化途径。
不正常则全部进入裂解途径。
5．答：(1)两个COS 位点；(2)线性DNA；(3)大小在丸噬菌体基因组的75％一105％的范围之内。
五、问答题1．答：(1)噬菌体DNA 没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA 包装的量是有限制的，不能大于基因组的105％，所以要将λ噬菌体改造成载体，必须削减分子量。
(2)野生型的λDNA 对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆。
(3)没有可供选择的标记。
(4)野生型的λ噬菌体具有感染性，因此不够安全。
2．答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。
主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac 基因片段的λ载体转入lac—的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。
外源基因插入lac(或lac 基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal 的能力，转人lac—的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。
3．答：β—半乳糖苷酶的N 末端是非必需的，可以进行修饰，并不影响酶的活性或。
肽的互补性。
如果插入的外源DNA 引起。
肽的可读框的改变，或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，就会形成白色噬菌斑。
如果插入DNA 的碱基数正好是3 的倍数，或者插入的DNA 中不含有终止密码的话，仍然会形成蓝色噬菌斑。
这种插人物的长度可达几百个碱基对。
M13 载体的这种性质可以用来检测和选择产生新的终止密码或改变可读框，即移码突变。
4．答：CⅠ基因的功能是促使噬菌体进入溶源化，但在正常情况下，它的噬菌斑是不清楚的，有点浑浊。