耐药基因检测原理
肺炎支原体的耐药机制和耐药基因检测现状
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓｌ
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ；Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；Ｇｅｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
肺炎支原体是人类呼吸道感染常见病原体之 一，肺炎支原体感染占社区获得性肺炎的２０％［１≈］。 儿童肺炎中ｌＯ％～３０％的病例是肺炎支原体引起 的，在流行高峰年肺炎支原体肺炎可高达３０％～ ５０％Ｃ３３，在某些地区或范围内，甚至可达７０％以 上［４制。肺炎支原体在我国各省区均可造成流行，一 年四季均有病例出现，但以冬季发病为主。值得注 意的是肺炎支原体流行具有周期性。每４～７年在不 同地区出现发病率高峰Ｃ２３。肺炎支原体感染除引起 原发性非典型肺炎外，还可引起上呼吸道感染、支气 管炎、肺脓疡及严重的肺外并发症，如免疫性溶血性 贫血、脑膜脑炎、心肌炎、心包炎、肾炎，严重感染者 甚至可导致死亡。近年来肺炎支原体感染的暴发流 行也证实了这一病原体有能力在社区引起较高的发 病率，并可导致患者死亡Ｕ－９３。 １肺炎支原体耐药的流行病学
大环内酯类抗生素是一种抑菌剂，其抑菌作用 主要是抑制细菌肽的合成和阻止核糖体的组装。核 糖体是细菌蛋白质合成的场所，大环内酯类抗生素 结合于核糖体５０Ｓ亚基的转肽酶中心与肽输出通道 狭窄之间的部分，通过机械性阻塞通道而抑制肽的 延伸，从而阻碍蛋白质的合成［２５－２７３。通过核糖体结 合试验证实，１４元环大环内酯与核糖体的结合位点 位于２３Ｓ ｒＲＮＡ上第２０６３、２０６４、２６０７、２６１１位口８｜。 ＲＮＡ印迹实验提示２０６３、２０６４、２５０５位碱基是红霉 素的结合位点［２ ９。。１５元环、１６元环的大环内酯与 １４元环大环内酯的结合位点大致相同，为２３Ｓ ｒＲＮＡ的２０６２、２０６３、２０６４、２６１６和２６０７ Ｌｌ ３｜。同时， 大环内酯类抗生素抑制核糖体５０Ｓ亚基的组装，导 致有功能的核糖体数量的下降。使细菌蛋白质合成 能力下降，细菌生长受到抑制¨∽川。
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法传统检测方法主要包括药敏试验和漏斗法。
药敏试验通过将不同的抗生素与待检细菌进行共培养，观察细菌的生长情况，可以确定细菌对不同抗生素的敏感性。
漏斗法又称为浓度梯度法，将一系列不同浓度的抗生素加入含有细菌的琼脂平板培养基中，观察细菌生长的情况，通过最小抑菌浓度（MIC）来确定细菌的耐药性。
然而，传统的检测方法有一些不足之处，包括需要较长的检测时间、操作复杂、耗时耗力、存在人为误差等。
因此，近年来，分子检测方法逐渐应用于细菌耐药性的检测。
分子检测方法主要包括PCR技术、基因芯片技术和下一代测序技术。
PCR技术（聚合酶链式反应）是一种快速、高效、敏感的检测技术，通过扩增特定基因片段来判定细菌的耐药性。
该技术可以快速检测出是否存在耐药基因，并可通过测序等方法进一步确定具体基因型。
基因芯片技术则可以同时检测多个耐药相关基因，具有高通量、快速、精确度高的优点。
而下一代测序技术则可以对细菌的基因组进行全面分析，包括基因序列、变异信息等，对于耐药性的研究提供了更多的信息。
传统检测方法和分子检测方法在细菌耐药性检测中都具有一定的适用性，可以根据具体的实验要求和资源情况选择合适的方法。
对于临床应用而言，传统检测方法的优势在于成熟、经济、稳定，但无法提供细菌的详细基因型信息；而分子检测方法则具有高通量、高灵敏度、高特异性的优势，但需要较复杂的实验设备和操作技术。
细菌耐药性的检测方法在临床、食品安全、环境监测等领域具有重要的应用价值。
通过检测细菌的耐药性，可以指导临床合理使用抗生素，减少抗生素滥用，避免耐药细菌的产生和传播；在食品安全领域，可以掌握食品中耐药细菌的情况，保障食品的质量安全；在环境监测领域，可以及时发现环境中的耐药菌，为环境卫生管理提供参考依据。
综上所述，细菌耐药性的检测方法既有传统的药敏试验和漏斗法，也有分子检测的PCR技术、基因芯片技术和下一代测序技术。
各种方法各有优缺点，可以根据具体实验需求和资源条件选择合适的方法。
肿瘤多药耐药基因 (MDR1)核酸检测试剂盒说明书
CatSA-67021MDR1(RNA)2010(第二版)1/2肿瘤多药耐药基因(MDR1)核酸扩增检测试剂盒说明书(PCR-荧光探针法)【名称】通用名：肿瘤多药耐药基因(MDR1)核酸检测试剂盒说明书英文名：Multidrug Resistance Gene (MDR1)Fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR)Diagnostic kit 汉语拼音：zhong liu duo yao nai yao ji yin (MDR1)he suan kuo zeng jian ce shi ji he shuo ming shu【目的】本试剂盒适用于检测肿瘤患者新鲜组织、全血等样本中多药耐药基因(MDR1)mRNA ，用于对化疗药物产生耐药的辅助诊断及其病人药物治疗的疗效监控。
其检测结果仅供临床参考。
【原理】本试剂盒选取一对肿瘤多药耐药基因(MDR1)特异性引物和一条特异性荧光杂交探针，应用Trizol 提取RNA ，经逆转录酶作用将RNA 转录成cDNA ，后者在、耐热DNA 聚合酶（Taq 酶）作用下，配以FQ-Buffer(内含Mg 2+、Tris-HCl 等)四种核苷酸单体（dNTPs ）等成分，通过PCR-荧光探针体外扩增法对肿瘤多药耐药基因(MDR1)进行扩增，从而达到快速准确实时定量检测之目的。
【组成】名称数量规格RNA 提取液B 1管500μl/管逆转录酶系1管40μl/管MDR1-RT MIX 2管140μl/管Taq 酶系1管80μl/管MDR1-PCR MIX 1管960μl/管MDR1阳性质控品1管50μl/管(1×107Copies/ml)阴性质控品1管500μl/管DEPC 水1管2000μl/管备注：10×RCLB 、RNA 提取液A (500500μμl Trizol reagents reagents))等另行配备。
痰标本中肺炎克雷伯菌耐药基因的检测及耐药分析的开题报告
痰标本中肺炎克雷伯菌耐药基因的检测及耐药分析的开题报告1. 研究背景和研究目的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是临床上常见的病原菌，可引起各种感染，尤其是呼吸道感染和泌尿道感染。
近年来，由于抗生素的广泛应用和不当使用，肺炎克雷伯菌的耐药性问题越来越突出。
其中，青霉素、氨基糖苷类、氟喹诺酮及多种β-内酰胺酶都为其主要耐药机制。
本研究的目的是通过检测痰标本中肺炎克雷伯菌的耐药基因，分析其耐药性情况，为临床治疗提供重要参考，从而有效地预防和控制肺炎克雷伯菌的增多及其耐药性。
2. 研究方法2.1 痰标本的采集和处理痰标本将由临床实验室负责采集和处理，按照标准操作流程进行，确保标本的质量和完整性。
处理过程包括细胞分离、离心、重复洗涤等步骤，最终得到纯化的菌液。
2.2 氯仿提取基因组DNA纯化的菌液将进行氯仿提取基因组DNA，提取过程包括裂解菌细胞、酶解蛋白质、氯仿提取、乙醇沉淀、洗涤和溶解等步骤。
最终得到基因组DNA，用以后续PCR扩增及耐药基因检测。
2.3 聚合酶链反应（PCR）扩增PCR扩增过程包括反应体系的制备、PCR反应的温度和时间的控制以及扩增产物的检测等步骤。
扩增产物将通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测所需耐药基因的扩增情况。
2.4 耐药基因测序和分析耐药基因扩增的PCR产物将进行Sanger测序，并通过基因数据库的比对和分析，确定所检测到的耐药基因类型和数量。
同时，将对肺炎克雷伯菌的耐药性进行综合评估，对其耐药性机制进行深入探讨。
3. 预期研究成果和意义研究预期将确定痰标本中常见的肺炎克雷伯菌的耐药基因类型和分布情况，了解其耐药性机制及其与药物使用的相关性，为临床治疗提供基础数据和参考依据，为临床治疗提供更优质的服务。
本研究的意义在于探明肺炎克雷伯菌的耐药性特点及其机制，为临床用药提供指导，并为耐药性的预测和控制提供科学依据，促进临床治疗的规范化和最优化。
HP耐药检测2019.02.20
Part.3 检测方法
不同HP耐药检测方法对比
HP耐药检测方法 细菌培养与药敏试验
HP菌株突变基因检测
检测时间
耗时较长，需要7-10天的时间 检测时间短，2个小时完成检测
检测过程
HP培养难度大，HP生长条件 严苛，在培养过程中，操作 过程中稍不注意，就会导致 菌株死亡
操作简便，只需要完成样本核 酸提取和加样上机即可，仪器 会自动完成检测。
炎性因子（IL-8） 转录因子激活/未激活
基因表达谱的暂时性改变 表观遗传学改变
《幽门螺杆菌胃炎京都全球共识》（2014年）
HP感染者应给予根除治疗，除非有抗衡方面考虑。（陈述17）
推荐等级：强 ；
证据级别：高；
共识水平：100%
"HP根除与胃癌"的相关陈述
证据 质量
【陈述1】目前认为HP 感染是预防胃癌最重要的可控危险因素。
所以及早发现幽门螺杆菌 感染者，及时而有效地用抗菌 素杀灭幽门螺杆菌，对预防和 控制胃癌有重大意义。
环境因素： 高盐饮食 吸烟 诱变剂等
毒性因子（cagA, vacA...）
炎症
白细胞迁移 突变的累积（抑癌基因 失活和癌基因激活）
DNA 损伤
染色体断裂 染色体不稳定性 突变的累积 （抑癌基因失活和癌 基因激活）
江苏默乐生物科技股份有限公司 JIANGSHU MOLE BIOSCIENCE CO.,LTD.
幽门螺杆菌（HP）耐药检测
主要内容:
1.背景介绍 3.检测方法
2.临床意义 4.HP耐药基因检测
Part.1 背景介绍
幽门螺杆菌感染是一个全球性问题
1994年被WHO和IARC列为人类胃癌的Ⅰ类致癌因子。
关于溶解曲线法耐药突变检测与传统敏结婚不一致的分析
关于溶解曲线法耐药突变检测与传统敏结婚不一致的分析随着抗结核药物的广泛使用，耐多药结核病人不断增加。
耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）是指至少同时对利福平（rifampin，RIF）和异烟肼（isoniazid，INH）这两种一线抗结核药物耐药。
传统的药物敏感实验（Drug susceptibility test，DST）时间长，不利于耐多药结核病患者的及时诊治。
因此，发展一种快速检测耐多药结核病的分子生物学检测技术对于耐多药结核病的早期诊断和治疗十分重要。
一、熔解曲线耐药结核检测技术的发展结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒和结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒于2013年1月获颁国家食品药品监督管理局（SFDA）医疗器械注册证书，同时，“中国—比尔盖茨基金会”已将该试剂盒纳入该基金会2013年产品验证目录。
2016年9月，SFDA批准了另外三种试剂盒：“结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药突变检测试剂盒”、“结核分枝杆菌链霉素耐药突变检测试剂盒”和“结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变检测试剂盒”，分别用于检测结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物、链霉素药物和乙胺丁醇药物耐药性，可用于临床上结核病的辅助诊断。
这些产品上市，有利于对耐多药结核病患者及时诊治，从而更好地控制与治疗结核病。
二、熔解曲线耐药结核检测的工作原理结核分枝杆菌异烟肼、利福平、氟喹诺酮、链霉素、乙胺丁醇耐药突变检测试剂盒均采用荧光PCR熔解曲线法进行检测。
荧光PCR熔解曲线法是一种简单快速的PCR检测技术，其主要检测原理为耐药基因的基因突变会导致DNA双链的结合力下降，从而导致相应的DNA熔解温度（Tm值）下降，即野生型基因有特定的Tm值，而突变型基因因为结合能力下降导致Tm值发生变化[1]，Tm值下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关，据此可以区分和检测出突变型和野生型。
三、熔解曲线耐药结核检测产品结构结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒包含：= 1 \* GB3 ①扩增试剂：PCR Mix A、PCR Mix B及TB酶混合液；= 2 \* GB3 ②对照试剂：阳性对照，含四个野生型扩增靶基因的质粒；= 3 \* GB3 ③TB阴性对照：不含靶基因的溶液。
抗菌药物敏感性试验
三、浓度梯度纸条扩散法药敏试验
又称E试验（E test），融合了纸片法操 作简单和稀释法可定量的有点，也适用于慢生 长菌。但成本贵。
药敏纸片换成特制的药敏纸条，培养后读 取细菌停止生长处在纸条上相应的药物浓度指 示值，即为该药物对该试验菌的MIC值。
三、浓度梯度纸条扩散法药敏试验
细菌生长区
E test 塑料
一、β-内酰胺酶的检测
2、超光谱β-内酰胺酶的检测
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）由革兰氏 阴性杆菌产生，质粒编码，活性可被β-内酰 胺酶抑制剂（如克拉维酸）抑制。包括筛查 试验和确认试验。
ESBLs阳性提示该菌可能对青霉素类、头 孢类和单环抗生素耐药。
临床上需常规检测的细菌包括大肠埃希 菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变 形杆菌。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
（一）常用抗菌药物 β-内酰胺类、糖肽类、氨基苷类、大环
内酯类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、甲 氧苄氨嘧啶等。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
• β-内酰胺类抗生素（β-lactams）系指 化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗 生素，包括青霉素与头孢菌素，碳青霉烯 类和单环类，以及β-内酰胺酶抑制剂 （克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦）的复方 制剂等。抗菌机制是抑制细菌的细胞壁合 成。
• 此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适 应证广及临床疗效好的优点。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
青霉素和头孢菌素类的基本结构
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
（二） 抗菌药物的选择原则 1.致病菌的固有耐药特点 革兰氏阴性杆菌对万古霉素均耐药。 革兰氏阳性球菌对氨曲南固有耐药。 2.本地流行株的耐药谱和耐药趋势
不动杆菌耐药机制及其基因检测进展
ｔｏ
ｉｎ—
［９］Ｂｏｎｅ
ａｎｄ
ＲＣ，Ｂａｌｋ ＢＡ，ｃａｒａ ＦＢ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｐｓｉｓ ｆａｉｌｕｒｅ ａｎｄ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｕｓｅ
ｄｉｓｅｒａｅｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ
Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２，２３（９）：４５０一
ｏｒｇａｎ
ｏｆ ｉｎｎｏＶａｔｉＶｅ
ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ
ｓｅｐｓｉｓ［Ｊ］．ｃｈｅｓｔ，】９９２，１０１（３）：１６４４—６６５． ｌｅａｒｎｅｄ［Ｊ］．Ｓｈｏｃｋ，１９９８，９（６）：１—１１．
（收稿臼期：２００９一０５—１２）
口］ 邸］
姚榛祥．重症胰腺炎现代治疗的认识口］．中华肝胆外科
杂志，１９９９，５（２）：７６—７８．
［１０］Ｄｅｉｔｃｈ
干扰。
对ｐ内酰胺类抗菌药物的耐药机制不动杆菌对ｐ＿内酰
胺类抗菌药物的耐药机制包括：产ｐ－内酰胺酶、青霉素结合蛋 白的改变以及外膜蛋白通透性降低。其中产生ｐ内酰胺酶是 最主要的耐药机制。Ｈ ｅｊｎａｒ等［３］检测结果表明，有４９．４％的 菌株产染色体介导的Ａｍｐｃ酶。Ｍａｇｎｅｔ等［４］认为高产染色 体介导的Ａｍｐｃ酶是细菌对Ｐ内酰胺类抗菌药物耐药的主要 因素。不动杆菌产ＴＥＭ一１、ＴＥＭ一２、０ＸＡ－２１、０ｘＡ一３７型内酰 胺酶，对氨苄西林、羧基青霉紊、脲基青霉素耐药。不动杆菌主 要产生诱导性ＡｍｐＣ型，ＡｍｐＤ基因进行性突变或因抗菌药 物选择压力造成的突变均导致ＡｍｐＣ的过度表达，同时外膜
ｍａｎｎｉｉＪ［Ｊ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ
１２０１－１２０３．
Ａｇｅｎｔｓ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，１９９５，３９（５）：
ＰＣＲ扩增
扩增目标ＤＮＡ使用琼脂糖电泳、探针杂交
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耐药基因检测原理
首先，对于需要检测的耐药基因，需要设计引物进行PCR扩增。
引物
是一种特异性序列，为了扩增目标基因而设计的短链DNA分子。
引物的设
计通常基于已知耐药基因的序列，确保在PCR反应中只扩增目标基因。
接下来，样品中的DNA经过提取和纯化步骤，将纯化后的DNA作为模
板加入PCR反应体系。
PCR反应包括DNA模板、DNA聚合酶、引物和核苷
酸等成分。
PCR反应包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA双链解链，并且使引物与目标基因序列互补结合。
在退火步骤中，引
物通过碱基配对与目标基因序列的模板链互补结合。
在延伸步骤中，DNA
聚合酶将核苷酸加入引物的3'端，延伸出新的DNA链。
PCR反应的循环数通常在30-40个，每个循环包括变性、退火和延伸
的步骤。
这样反复扩增可以使目标基因的数量迅速增加，达到能够检测到
的水平。
扩增后的产物可以通过凝胶电泳进行分离和检测。
凝胶电泳是一种常
用的DNA分离方法，可以根据DNA的大小将扩增产物分离成多个条带。
通
过与已知大小的DNA分子量标记物进行比较，可以确定扩增产物的大小。
对于DNA测序检测，扩增的产物需要进行测序反应，包括引物、DNA
聚合酶和核苷酸等成分。
测序反应通常使用二进制的荧光核苷酸标记分子，通过识别核苷酸的特异性荧光信号，将测序反应产物的序列进行记录。
测序后的数据需要进行生物信息学分析，包括比对和注释等步骤。
通
过比对测序数据与已知耐药基因序列数据库，可以确定检测样品中是否存
在耐药基因。
总的来说，耐药基因检测通过PCR扩增和DNA测序等分子生物学技术，可以检测耐药基因的存在与否。
这项技术能够准确地预测细菌对抗生素的
耐药性，帮助医生选择最有效的治疗方案。
随着分子生物学技术的不断发展，耐药基因检测将成为临床诊断和治疗中无法替代的重要工具。