细胞生物学实验讲义
细胞生物学实验
细胞生物学实验细胞实验复习一、细胞内蛋白质及核酸成分的测定1.细胞组织化学法在保持细胞结构的基础上，利用某些化学试剂与细胞内的一些物质发生化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀。
再通过显微镜对细胞内的化学成分进行定位定性的检测方法。
2.三氯醋酸的作用：抽提DNA、RNA，使蛋白质与DNA、RNA 分开3.固定：将细胞杀死，使其仍然保持原来的结构和形态4.甲基绿-哌罗宁染色原理核酸是强性酸，甲基绿-哌罗宁是碱性染料，具有亲和力。
这两种碱性染料有选择地特异染色。
甲基绿把DNA染成绿色，哌罗宁把RNA染成红色。
二、观察细胞的生理活动1.淀粉肉汤：刺激腹腔聚集大量巨噬细胞，台酚蓝起标记巨噬细胞的作用2.渗透现象原理原生质层具有选择透过性，原生质层内外的溶液存在着浓度差，水分子就可以从溶液浓度低的一侧通过原生质层扩散到溶液浓度高的一侧。
溶液渗透压的高低与溶液中溶质分子的物质的量的多少有关，溶液中溶质分子物质的量越多，渗透压越高，反之则越低。
3.质壁分离原理质壁分离是植物细胞失水造成的细胞壁与细胞质的分离。
细胞壁主要由纤维素分子组成，是水和溶质都可以通过的透性膜，而细胞质膜是半透性膜，有选择性和流动性。
由于质膜对水的可透性，水会从低溶质浓度一侧（高水浓度）向高溶质浓度一侧（低水浓度）运动，即渗透作用。
当植物细胞内的溶液浓度低于外界浓度时，细胞会失水，细胞壁形状不变，而细胞质膜皱缩，使得原生质体与细胞壁分离。
4.血涂片方法①取末捎血一滴置于玻片的一端，左手持载玻片，右手以边缘平滑的推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。
然后便推片与载片夹角保持30-45度平稳地向前移动，载片上保留下一薄层血膜。
②使血膜迅速干燥,以免血细胞皱缩.③用蜡笔在血膜两侧划线,以防染液溢出，然后将血膜平放在染色架上。
加瑞氏染液2-3滴，使覆盖整个血膜，固定0.5-1min。
滴加等量或稍多蒸馏水，与染料混匀染色5-10min。
细胞生物学实验指导(12生工)
细胞生物学实验教案实验一：特殊显微镜的使用及显微摄影术一、实验目的：1、掌握暗视野显微镜、相差显微镜的原理、构造及其使用方法。
2、掌握显微摄影装置及其操作技术，独立完成显微摄影全过程。
二、实验原理：暗视野显微镜应用丁达尔现象，装配暗示场聚光器，是入射光从聚光器斜向照明被检样品。
暗视野显微镜利用样品的散射光和放射光进行观察，只能观察物体的存在与运动而不能辨清其细微结构。
暗视场照明是照明光线仅照亮被检样品而不能进入物镜，使视场背景暗黑，样品明亮的照明方法。
相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，通过衍射和干涉现象，将肉眼看不到的相差，变为明暗的振幅差而能看到。
相差显微镜应用于生物学的主要价值，在于对透明的活体进行直接观察，无需采用是细胞致死的固定和染色的方法。
0lympus BH系列的BHS和BHT型显微镜有摄影装置，通过摄影装置，拍摄显微视场中被检样品。
三、实验仪器与试剂1、材料：洋葱鳞茎、人口腔细胞；2、器材：暗视场显微镜、相差显微镜、Olympus显微镜、活体生物样品、擦镜纸、消毒牙签、镊子、滴管、纱布、吸水纸、载玻片、盖玻片3、试剂：生理盐水（0.9%）、2%碘液、香柏油、二甲苯。
四、实验步骤与方法（一）口腔上皮细胞的制备及染色1、把载玻片和盖玻片擦拭干净；2、用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水；3、用消毒牙签在自己漱净的口腔内壁轻轻地刮几下；4、把牙签上的碎屑放在生理盐水中轻涮几下；5、盖上盖玻片；6、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液；7、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。
（二）洋葱鳞茎内表皮装片制作1、把载玻片和盖玻片擦拭干净；2、用滴管在载玻片的中央滴一滴蒸馏水；3、用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮置于蒸馏水中；4、盖上盖玻片；5、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液；6、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。
（三）分别用暗视场显微镜和相差显微镜观察（四）显微摄影的使用将装片置于显微摄影镜下,选一清晰的视野进行拍摄并打印出来。
细胞生物学Introduction of cell biologyPPT课件
Cell organelle (Mitochondria, Chloroplasts, Endomembrane
system, nucleus etc.)
Cytoskeleton System
Cell proliferation and regulation
Cell differentiation and gene expression Cell apoptosis and cellular aging
structure
function
molecular mechanisms of the intricate activities of cells
细胞生物学是： 研究细胞基本 生命活动规律 的科学，它从 不同层次上主 要研究……
The structure of cells
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The course mainly covers:
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Suggestions to Study Cell Biology
Fundamental Concepts and theories Experimental approaches and ideas (As you read this
text, think like a researcher)
Reductionist (knowledge of the parts of the whole can
explain the character of the whole) Don’t accept everything you read as being true. Remain skeptical! English is just a tool! Take notes when you listened especially what I have emphasized
医学细胞生物学讲义
胞细始原到子分单简从
节一第
4
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节二第
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细胞生物学实验- 细胞骨架
常用荧光探针
细胞参量 荧光探针 吸收/发射 nm
特性
蛋白和抗体 FITC 494/518 绿色荧光 的耦联探针
染死细胞,对PH值变化不 敏感
Texas red 595/615 红色 多参量细胞标记 荧光
溶酶体
Neutral red 541/640 红 探针微偏碱性,可标记溶酶
DAPI 358/461 蓝色荧光
Hoechst33342 350/461 蓝色荧光
嵌入核酸双链间,只能标记死细 胞.用于 染色体,细胞观察,分辨 死活细胞和细胞周期研究
嵌入核酸双链间,只能标记死细 胞.用于电泳分析,染色体观察
半通透细胞,结合于DNA的AT碱 基对.用于细胞周期的研究,染色 体和细胞核的观察
7. 取一个洁净的载玻片，按照载玻片的大小在其上放置一 条封口膜，在封口膜上上滴加10 μL 55 nM Alexa-568phalloidin (red)，将经上述处理的盖玻片细胞面向下孵 育于染色液中，于湿盒中室温避光染色30 min。 8. 小心取下盖玻片，将其置于小平皿中（细胞生长的面朝 上），用37℃预温 PEM避光漂洗3次。 9.在载玻片上分别滴加Ho.33342工作液10 μL，将盖玻片 上的细胞倒扣在载玻片上室温暗处孵育10 min。 10. 封片。 11. 荧光显微镜观察微丝（绿色荧光激发，产生红色荧 光）;核（紫外光激发，产生蓝色荧光）。
Hoechst 33342是一种亲脂性物质，能与DNA特异性结合的荧光探针，所以被大 量用于活细胞的观察和定量的研究。荧光激发和发射波长分别为350 nm和461 nm。
• 仪器 荧光显微镜，倒置显微镜
最新基础医学细胞生物学PPT课件-细胞膜及其表面-细胞表面及其特化结构教学讲义PPT课件
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Medical Cell Biology
二、细胞表面的特化结构
细胞表面最明显的特化结 构有：微绒毛、内褶、纤毛和 鞭毛，常还有一些暂时的结构， 如变形足、皱褶等。
微绒毛
皱褶
圆形变形足
糖萼 通道与小泡
尖形变形足
内褶
10
(一)微绒毛
Medical Cell Biology
微绒毛(microvillus)广泛存 在于动物细胞的游离表面。细 长指状突起，直径100nm(内有 微丝)，长约100-200nm。扩大 细胞作用的表面积，有利于细 胞的吸收。每个小肠上皮细胞 有1000-3000根微绒毛。
锚 与中间纤维的锚定连接
定
连 接
与肌动蛋白纤维的锚定 连接
桥粒与半桥粒
desmosome and hemi-
粘合带和粘合斑 adhesion belt and focal adhesion
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Medical Cell Biology
1. 粘合带与粘着斑
粘合带位于紧密连接下方
粘合带
（adhesion belt）
ECM的功能：支持、保护和提供营养外，还控制 细胞的迁移、增殖、分化、细胞识别、粘着、通讯联 络、信号传导、形态建成、代谢、基因的表达与调控 等生理过程和炎症、损伤与修复、免疫应答以及肿瘤 转移等病理过程中具有重要的功能和作用。
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Medical Cell Biology
四、细胞外基质
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Medical Cell Biology
呈带状环绕细胞， 一般位于上皮细 胞顶侧面的紧密 连接下方。在粘 合带处相邻细胞 的间隙约15～ 20nm。
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Medical Cell Biology
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导2009 年11 月目录前言 (1)细胞生物学实验守则 (2)实验一：动物细胞的基本形态观察和细胞计数 (3)实验二：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 (6)实验三：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 (8)实验四：线粒体和液泡系的超活染色与观察 (9)实验五：植物细胞微丝束的光学显微镜观察 (10)实验六：叶绿体的分离与荧光观察 (13)实验七：DNA的显示——Feulgen反应 (15)实验八：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的观察 (18)实验九：小鼠骨髓染色体标本的制备与观察 (20)实验十：染色体C-带技术 (23)实验十一：细胞内化学成分的显示方法——酸性磷酸酶的显示 (25)实验十二：开放性实验——蚕豆（Vicia faba）根尖细胞微核监测技术 (27)细胞生物学实验考试大纲····························································错误！未定义书签。
实验考试试题示例········································································错误！未定义书签。
细胞生物学实验手册：细胞组分的化学反应
实验七细胞组分的化学反应【实验目的】了解核酸、蛋白质、糖及酶的细胞化学反应原理，掌握Brachet反应及碱性蛋白、酸性蛋白、糖原和过氧化物酶的细胞化学染色方法。
【实验用品】一、材料和标本蟾蜍、小白鼠各一只、肝脏石腊切片、培养的Hela细胞。
二、器材和仪器光学显微镜、解剖器材、蜡盘、载玻片、吸水纸、染色缸、盖玻片、水浴箱。
三、试剂PBS缓冲液(pH7.2)、甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液、纯丙酮、l/2丙酮+1/2二甲苯、纯二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％碱性固绿、0.1％酸性固绿、0.5％硫酸铜、联苯胺混合液、1％番红、无水乙醇、过碘酸酒精液、Schiff 氏酒精液、亚硫酸水、Ehrlieh苏木精、95％乙醇、Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，体积比)【实验内容】细胞的组织化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。
它是利用化学试剂与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。
一、Brachet反应一显示细胞内的DNA和RNA(一)原理细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后，其中的DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，呱咯宁染低聚分子的RNA呈红色。
由此对细胞中的DNA和RNA进行定位、定性、和定量分析。
(二)方法l．接种Hela细胞于盖片上并培养24～48小时，使长成单层。
2．取出盖片，用PBS(pH7.2)轻轻冲洗盖片表面去除残渣。
3．放入Carnoy固定液中固定l小时。
4．浸入甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液中30分钟染色。
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细胞内DNA和RNA的显示一、目的要求1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。
2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。
二、实验原理核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。
利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。
这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。
三、器材与试剂1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。
2、材料：鸡血。
3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。
4、试剂的配制（1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。
再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。
（2）2%甲基绿染液：称取2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。
甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40 C温箱中干燥后备用。
（3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。
（4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。
该液应现配现用，不宜久置。
四、内容与方法1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。
2、固定：将晾干的血涂片浸入70%乙醇中固定10分钟，取出后在室温下晾干。
3、染色：滴甲基绿派洛宁混合染液于血膜上，染色15min。
4、冲洗：用蒸馏水冲洗标本片，并用吸水纸吸去玻片上多余的水分，但不要吸得过干。
5、分化：将血涂片在95%酒精中迅速地过一下，进行分色，取出晾干。
6、观察：光镜下可见细胞质呈现红色，细胞核呈绿色。
五、作业与思考1、简述DNA和RNA的染色原理。
2、细胞核中核仁理论上应被染成何种颜色？为什么？鸡血细胞体外融合一、实验目的（1）了解聚乙二醇诱导体外细胞融合的基本原理。
（2）通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。
（3）二、实验原理细胞融合又称体外细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体细胞同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组和在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。
细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。
依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：1.病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒；2.化学因子诱导的细胞融合，如PEG；3.电场诱导的细胞融合；4.激光诱导的细胞融合。
PEG是乙二醇的多聚合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。
PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。
该方法应用相对分子质量为400-6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。
融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
三、实验仪器、材料和试剂（1）仪器、用具：注射器、离心管、离心机、水浴锅、滴管、显微镜烧杯、容量瓶、载玻片、盖玻片、酒精灯等。
（2）材料：鸡血细胞。
（3）试剂：1）0.85%NaCl溶液2）GKN液：8.0gNaCl, 0.4g KCl, 1.77g Na2 HPO4·2H2O, 0.69g NaH2PO4·H2O, 2.0g 葡萄糖，0.01g 酚红，溶于1L蒸馏水中。
3）50%（m/v）PEG溶液：取50g PEG4000 水浴融化后冷却至50~60℃加50m预热至50~60℃的GKN液，混匀，至于37℃备用。
4）Hanks 原液（10×）：80.0g NaCl, 1.2g Na2 HPO4·2H2O, 4.0g KCl , 0.6g KH2PO4 , 2.0g MgSO4·7H2O, 10.0g 葡糖糖，1.4g CaCl2○1称取1.4g CaCl2，溶于30~50mL蒸馏水中。
○2取1L的烧杯及容量瓶各一个，先在烧杯中放入800mL蒸馏水，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。
必须在前一药品完全溶解之后，方可加入下一药品，直到葡糖糖完全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至1L。
5）Hanks液：Hanks 原液100mL蒸馏水896mL0.5%酚红4mL配好的hanks液保存于4度冰箱。
四、方法与步骤1.制作鸡血细胞储备液取来鸡血后，按照100U肝素/5mL全血的比例制成抗凝全血，然后再在其中加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制成红细胞储液，置于4℃冰箱内可供一周使用。
2.细胞悬液的制备取鸡血细胞储备液1mL，加入4mL0.85%NaCl 溶液，混匀后，1200r/min离心5min，弃去上清液，再加入5mL0.85%NaCl溶液按上述条件离心一次。
最后，弃去上清液，加入3mL的GKN溶液制成鸡血细胞悬液。
3.鸡血细胞的收集吸取1mL鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mL Hanks液混匀，1000r/min离心5min。
弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。
4.PEG诱导细胞融合（KEY）吸取1mL 37℃的50%PEG溶液，沿着管壁迅速加入然后立即轻轻摇匀（此步非常容易造成血液凝集，不要拿离水浴锅太长时间）。
37℃水浴两到两分半钟。
5.终止PEG作用缓慢加入5mL Hanks液，轻轻吹打混匀，置于37℃水浴锅中静置5min。
6.制备细胞悬液用吸管轻轻吹打细胞团块分散（KEY），1000r/min离心5min,使细胞完全沉降。
弃去上清液，加800mLHanks，混匀。
7.镜检在载玻片上滴一小滴细胞悬液，盖上盖玻片，先在10倍镜下找到细胞，再在40倍镜下看，如看到有疑似融合的，先调焦做第一次确定，如若确定通过，再用100倍镜确定（另外，视野较暗会比较容易观察）。
Feulgen反应一、实验目的学习Feulgen反应的原理与操作步骤。
二、实验原理Feulgen反应是由Feulgen和Rossenbeck 于1924年创立，是特异性显示DNA的最经典方法。
它主要包括DNA水解和显色两个反应步骤。
DNA在60℃条件下经稀酸（1mol/L HCL）水解，分子中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂反应，形成紫红色的化合物，因此，细胞内含有DNA的部位会呈现紫红色阳性反应。
福尔根反应即可进行DNA定位显示，又可用显微分光光度计惊醒定量分析。
Feulgen反应对组织中的DNA高度专一，组织中除DNA外还有多糖、RNA和其他自由醛基，固定液也可能产生一些醛基。
但是，自由的醛基可能被盐酸酸解消除，绝大多数RNA经1M盐酸在60℃温度下处理会降解为可溶性成分，而多糖在此反应条件下则不会产生裸露的醛醛基。
材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。
三、实验用品1、材料：洋葱根尖2、器材：解剖刀、镊子、水浴锅、载玻片、盖玻片、3、药品与试剂:1mol/L盐酸：取82.5ml密度1.19g/ml浓盐酸加蒸馏水至1000ml。
Schiff试剂：称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角瓶），时时震荡，继续煮5min （勿使之沸腾），使之充分溶解。
然后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/LHCl，冷却至25℃时，加入0.5gNa2S2O5充分震荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处理静止至少24h（有时需2~3d），使其颜色褪至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力震荡1min，然后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。
滤液应为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。
如有白色沉淀，就不能在使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾，使之再转为无色，仍可使用。
亚硫酸水：200ml自来水、10ml 10％偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾溶液、10ml 1mol/L HCl，使用前，三者混匀使用。
四、实验步骤1、将洋葱根尖放在1mol/L HCl中，在60℃水浴锅中保温8~10min。
2、蒸馏水水洗。
3、Schiff 试剂遮光染色30min。
4、用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗涤3次，每次1min。
5、水洗5min。
6、将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片。
7、镜检，细胞中凡是有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。
8、找出根尖正在分裂的细胞，并找出它的前、中、后、末、间等五个时期。
对照组：先将材料放在5%三氯醋酸中90℃水浴15min，其他步骤同实验组。
细胞凝集反应一、实验目的了解细胞膜的结构与功能。
二、实验原理细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状外被。
目前认为：细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。
凝集素(lectin)是一类含糖(少数例外)的并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。
凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。
三、实验用品1、土豆块茎2、显微镜、粗天平、载玻片、滴管2支、离心管2支。
3、PBS缓冲液NaCl 7.2gNa2HPO4 1.48gKH2PO40.43gH2O 1000ml4、2％的红细胞四、实验步骤1、2％的红细胞的制备：取一定量的红细胞，用生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2％红细胞液。
2、称取去皮土豆块茎2g，加10mlPBS缓冲液，浸泡2h，浸提液中含有可溶性淀粉土豆凝集素。
3、用滴管吸取土豆凝集素和2％红细胞液各一滴，置于载玻片上，充分混匀，静置20min 后，于倒置显微镜下观察血球凝集现象。
4、以PBS液加2％血细胞液作对照实验。
五、实验报告：简图表示血细胞凝集原理。
细胞膜的渗透性一、实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。