脯氨酸含量测定

逆境胁迫下植物体脯氨酸含量测定

【实验目的】

1.了解脯氨酸在植物抗逆性决定中的作用。

2.掌握脯氨酸提取和测定的方法。

【实验原理】

1.逆境条件下（干旱、盐碱、热、冷害、冻害）,植物体内脯氨酸含量会显著增加，并且积累指数与植物的抗逆性有关，因此脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

2.测定脯氨酸含量目前一般使用的方法是茚三酮法。

酸性条件下,茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物,产物在520nm 波长下具有最大吸收峰。用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色,再用甲苯萃取，则色素全部转移至甲苯中,颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

【实验材料】

1.材料：

小麦幼苗：

（1）对照

（2）100mM、200mM NaCl处理48h

（3）5%、15% PEG-6000处理48h

2.试剂：3%磺基水杨酸；冰醋酸；甲苯；2.5% 酸性茚三酮溶液；脯氨酸母液50 g/ml

3.器材：天平，烧杯，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管，胶头滴管，水浴锅

4.酸性茚三酮溶液：称取1.25g 茚三酮溶于30mL 冰乙酸和20mL 6M 磷酸溶液中，搅拌加热（低于70℃）溶解，冷却后置棕色瓶中，4℃保存可使用2~3 天。

【实验内容】

1.脯氨酸标准曲线的测定

（2）分别吸取1ml系列标准浓度的脯氨酸溶液于6个试管中,加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml 2.5％的酸性茚三酮,于沸水浴中加热30min。

（3）冷却后准确加入4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。

（4）轻轻吸取各管上层甲苯溶液至比色杯中,以甲苯为空白对照,于520nm进行比色。

2.样品的测定

（1）称取不同处理的小麦叶片各0.5 g，于2.5 ml 3%磺基水杨酸试管中，沸水浴中提取10 min。

（2）吸取1ml上清于另一试管中，加入1 ml水、1 ml冰乙酸、2 ml 2.5％的酸性茚三酮，混合液于沸水中显色30 min。

（3）冷却后加入4 ml甲苯，摇荡30S，萃取完全后用吸管轻轻吸取上层红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在520nm比色。

【实验结果】

查标准曲线，得脯氨酸含量c（µg）

脯氨酸含量（µg.g-1）＝c ×(v／a )／w

其中V为提取液总体积ml; a为测定液体积ml；W为样品质量g。

1.标准曲线

浓度(µg/mL) 2 4 6 8 10

OD520

1 0.070 0.140 0.201 0.293 0.331

2 0.087 0.132 0.19

3 0.30

4 0.341

3 0.088 0.151 0.223 0.318 0.34

4 平均0.082 0.141 0.206 0.30

5 0.339

2.样品测定

处理平行质量OD520

对照1 0.2018

0.2043

0.157

0.173 2 0.2068 0.188

100mM NaCl 1 0.2018

0.2026

0.615

0.657 2 0.2033 0.698

200mM NaCl 1 0.2006

0.2020

1.008

0.942 2 0.2034 0.875

5% PEG-6000 1 0.2096

0.2095

0.099

0.167 2 0.2093 0.234

15% PEG-6000 1 0.2028

0.2041

0.586

0.587 2 02053 0.587

将测得样品的OD520值带入标准曲线，得到的几种处理的脯氨酸含量分别为：

处理OD520 脯氨酸浓度

(µg/mL)

质量

(g)

脯氨酸含量

(µg/g)

对照0.173 4.764 0.2043 233.2 100mM NaCl 0.657 19.041 0.2026 940.1 200mM NaCl 0.942 27.448 0.2020 1358.8

5%

PEG-6000

0.167 4.587 0.2095 219.0

【实验讨论】

1.采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。

2.实验中甲苯的作用主要是萃取，以排除其他可能和茚三酮产生显色反应的物质使得测量值偏高。但同时有研究显示，未经甲苯萃取和经甲苯萃取后所得的脯氨酸含量值得趋势是相同的，即应该高的数值两种方法都会高，因此，从污染小，经济，简便的方向考虑，如果不对脯氨酸进行精确的定量，只是用于作为一个植物抗性的生化指标，可以不使用甲苯的萃取。

3.实验中在绘制标准曲线时，所设置的浓度范围不太合适，因为没能把样品的OD520值包含进去。因此标准曲线并不是很可靠。应该将浓度继续增加，尽量使样品测定的OD520值能够包含进入曲线的浓度范围内，所得结果才准确。

4.从实验结果中可以观察到，随着胁迫程度的增加，脯氨酸的含量也会显著增加。因此，可以说明脯氨酸的含量在一定程度上是植物遭受胁迫大小的反映。而通过比较，发现盐胁迫比干旱胁迫对小麦造成的影响更大。

5.实验结果中，经过5%PEG-6000(轻度干旱胁迫）处理的小麦叶片内的脯氨酸含量甚至比对照组的脯氨酸含量还要低(但相差不多）。而其他几种胁迫均有显著的使脯氨酸增加的效果，因此，除了操作过程中的一些误差外，最重要的是轻度干旱可能不会对小麦造成太大的影响，或者其他的代谢机制可以帮助小麦抵抗轻微干旱，脯氨酸增加不明显。

6.脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有极强的亲水性及水合作用。因此干旱时脯氨酸的积累能够有效地防止脱水。

7.脯氨酸是植物在盐胁迫下的主要渗透调节物质之一，它不仅是生物大分子的保护剂和羟基的清除剂，还是植物从胁迫条件恢复正常过程中迅速、有效的氮源、碳源和还原剂。脯氨酸能够防止质膜透性的变化，对质膜的完整性有保护作用，原因可能是脯氨酸与膜磷脂及转运蛋白相互作用，以稳定其结构。高等植物中脯氨酸的合成有两种途径：谷氨酸途径和鸟氨酸途径，两者的主要区别在于初始底物分别为谷氨酸（Glu）和鸟氨酸（Orn）。在渗透胁迫和氮素缺乏情况下，谷氨酸途径是合成脯氨酸的主要来源；而在氮素供应充足的情况下，鸟氨酸途径占主导地位。脯氨酸合成发生在细胞质中，P5CR(吡咯啉-5，-羟酸还原酶)和P5CS （吡咯啉-5，-羟酸氧化酶）是脯氨酸生物合成过程中的两个重要酶，后者是限速酶。

8.除了高盐和干旱胁迫外，脯氨酸在低温胁迫时也起到重要作用。脯氨酸的亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，，有防止细胞脱水的作用。

另外，脯氨酸的积累与植物的代谢表现出一定的正相关性，同时能促进酶核细胞膜的渗透调节。有些植物中，脯氨酸的质量分数的变化会引起代谢酶的变化；当植物细胞受到逆境胁迫时，脯氨酸通过保护生物大分子的功能结构为生理生化反应提供足够的自由水和活性物质，从而保护植物度过逆境。

9.总体来说，脯氨酸的积累对植物体的抗逆性起到了决定性的作用。但脯氨酸与植物抗逆性的关系并不简单，在逆境胁迫下，植物抗逆途径多种多样，不同植物，不同条件下，不一定通过同一途径抵抗外界不良环境。但总之，脯氨酸最终的作用都是通过发挥渗透调节剂的作用来响应逆境胁迫的。