巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略

毕赤酵母表达手册

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

毕赤酵母表达

Pichia酵母表达系统使用心得摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。

本文搜集多位用户对Pichia的使用心得和注意事项，值得一看。

生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。

其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。

+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。

=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++RealTime ready 智力大冲浪！答对5题，即获赠美国傲仕优质保温杯！+ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点--使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点--酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

巴斯德毕赤酵母表达系统

可以进行蛋白质翻译后的修饰等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功【。ｉｅａｚ１Ｊ此后用该系统还表达了其它多种原核和真核蛋白，但
业放大生产；４表达量高。酿酒酵母中表皮生长因子（）
— —
破伤风毒素Ｃ片段表达量达１ｇＬ，ｅａｂａｉｅｓ２／ＪＨｒｒｓｉｉｌｎｓ羟腈裂合酶的表达水平高达２ｇＬ；５在巴斯德毕２／［（）
赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内，又可分泌到胞
系统复杂；斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外，而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。巴从关键词：巴斯德毕赤酵母；外源蛋白；表达中图分类号：Ｑ１文献标识码：Ａ８６
如，原核表达系统表达人组织型基质金属蛋白酶抑用制剂（Ｉ）虽然获得了大量重组蛋白，是由于重ＴＭＰ，但组蛋白形成包含体，以使ＴＭＰ分子内的６对二硫键难Ｉ正确折叠配对，终未能得到有活性的全长分子。李始克勤等用巴斯德毕赤酵母表达系统获得了分泌型前正确折叠的ＴＭＰ１重组蛋白的表达量达４ｍ／￣；３Ｉ．，０ｇＬ２（）
高等真核细胞相比，斯德毕赤酵母易于进行操作和巴培养。巴斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好，一这生理学特性使得它既能高密度发酵生长，有利于工亦

毕赤酵母表达操作手册(精译版)

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。

而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。

细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。

甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。

AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码的目的基因的表达。

AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。

巴斯德 [巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌]

3.2 毕赤酵母的高效转化及检测
验，按电泳条带亮度比较 PEP4 基因剔除前后毕赤酵母 MIP 的表达量，并
用 EcoRI 酶切质粒 pRS306/PEP4 L&R。由电泳结果可见，酶切后呈现
统计试验结果。
单一条带，酶切完全，见图 5。转化后在 SC-ura 平板上得到期望的转化
子。PCR 检测结果说明，置换前片段约为 1.7 kb，置换后片段约为 4.8 kb，
第3页共5页
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pRS306/PEP4L&R 进行转化，涂 SC-ura 平板，挑取单克隆在 YPD 培育基上
3 结果与商议
连CR 检测，根
据 DNA 片段大小判定毕赤酵母 PEP4 基因是否剔除〔置换前片段约为 1.7
激活液泡蛋白酶。在缺乏蛋白质水解酶 A 的状况下，有活性的蛋白质水解
巴斯德毕赤酵母〔Pichia pastoris〕是较理想的外源基因表达系统酶 B 仍能在几个细胞生长周期内继续激活液泡蛋白酶，但蛋白质水解酶 B
[1]。在外源蛋白质的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有确的自我激活能力并不是无限的，一旦其活性降低到某一临界值以下，细胞
3.1 构件质粒 pRS306/PEP4 L&R
kbp，置换后片段约为 4.8 kbp〕，并对 PCR 扩增得到的 DNA 片段测序。
3.1.1PCR 扩增 DNA 片段的鉴定 PCR 扩增 221 bp 毕赤酵母 PEP4 基因
将单菌落摇瓶培育后，依据羧肽酶 Y 平板检测法[10]鉴定 CPY 活性。左臂和 225 bp 右臂 DNA 片段后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，说明其大小与
1.2 培育基

毕赤酵母表达经验总结

毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。

其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。

+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。

=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展
龙晶;杜立新
【期刊名称】《微生物学杂志》
【年(卷),期】2007(27)6
【摘要】毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种高效表达外源基因的表达系统.综述了毕赤酵母表达系统的起源、生物学特性、融合蛋白的表达以及影响蛋白表达量的因素.
【总页数】5页(P72-76)
【作者】龙晶;杜立新
【作者单位】中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所,国家畜禽分子育种中心,北京,100094;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所,国家畜禽分子育种中心,北京,100094
【正文语种】中文
【中图分类】TQ926
【相关文献】
1.巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌外源蛋白质表达的影响 [J], 杨扬;赵健;石军
2.影响外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达和分泌的研究进展 [J], 张丞斌;傅正伟
3.巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优化策略 [J], 樊英;李天保;杨秀生;王建华;滕达
4.巴斯德毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展 [J], 罗竞红;游自立
5.利用巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展 [J], 余祖华;王红宁
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重组巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

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使其失活，因此 =1 值成为影响蛋白表达的一个重要因素。实验中，分别选取不同的 =1 值：;X-， YX-，YX@ 进行了对比研究。毕赤酵母可以在简单培 !"%"# 培养基成份的影响：养基中生长良好和表达有生物活性的重组巴曲酶。但在简单培养基中分泌的重组蛋白易发生降解，使产物的得率降低。实验中，分别选取大豆蛋白胨和山梨醇进行了对比研究。随着发酵时间的延长，宿 !"%"$ 培养时间的影响：主细胞的蛋白水解酶浓度也会随之增加，使分泌的重组蛋白发生降解，使产物的得率降低。实验中，用人标准血浆进行酶活性测定，记录自诱导起 - Z @-% 的实验结果，以选择收获发酵液的最佳时机。将发酵上清液加入 ,B#"NL !"& 重组巴曲酶的纯化：硫酸铵等预处理后，先经过预先用 9-BB#"NL >P< （=1 YX-）和 ,B#"NL 硫酸铵平衡过的疏水层析介质（<GHKAWL?IKGW >%&*M"），用含 , Z -B#"NL 硫酸铵的 >P< 梯度洗脱，收集活性峰；再经过用 9-BB#"NL （ =1 YX- ）平衡过的阳离子交换介质（ <> >P< ，用含 - Z -X;B#"NL 氯化钠的 >P< 梯 <&=%6C#$&GW [[）度洗脱，收集活性峰；再经过用 9-BB#"NL GC)$E12" （=1 +X.）肝素亲和介质（ 1&=6C)* <&=%6C#$& [[），用含 - Z -X;B#"NL 氯化钠的 GC)$E12" 梯度洗脱，收集活性峰；最后再进行一步用含 -X9;B#"NL I62" 的（ =1 +X. ）凝胶过滤层析（ <E9--! 9-BB#"NL GC)$E12" ，添加 ;-O 的甘油， \ ,-] 保存。 <&=%6SCM"） !"’ 巴曲酶的测活方法参照从蛇毒中提取的巴曲酶的测活方法，用加入了柠檬酸纳的人标准血浆可以对发酵上清液中表达出的酶活性进行测定，这即可以对克隆进行筛选，也可以对工程菌的产量高低进行测评。具体测定活性的标准就是，以人凝血酶为标准品， F+] 下，将 9-L 的样品加入到 F-L 含柠檬酸钠的人标准 # # 血浆中，混匀后，观察凝固所需的时间。 !"( 重组巴曲酶蛋白对小鼠出血时间的影响试验鼠为 ,- Z ,;4 的雄性小鼠，分别尾静脉注射重组巴曲酶蛋白（ , I?1 3*)T$N74 ）和 >P< 对照， Y-B)* 后，距尾尖 ,BB 处横切，固定后浸入 F+] 生理盐水中 9X;SB，记录出血时间。