38微生物表面擦拭方法验证报告

微生物棉签擦拭取样方法及检验方法验证报告文件编号：VP-01-06-00-038

起草人_____________ 日期___________

审核人_____________ 日期___________

批准人_____________ 日期__________

1、概述

微生物在适当的温湿度下以残留物中的有机物为营养可大量繁殖，产生各种代谢物，从而大大增加残留物的复杂性和危害程度，对下批产品造成污染。因此必须对药品生产设备的微生物进行严格控制。

制药企业的生产场所、设备、用具等在生产结束后需清洁，根据GMP的要求，清洁后应对清洁效果进行评价，设备表面微生物限度检查应符合要求，擦拭取样优点是能对最难清洁部位直接取样，通过考察有代表性的最难清洁部位的表面微生物限度评价设备的清洁状况。对棉签擦拭取样方法和检验方法的可行性进行验证，确保清洁方法的有效性，降低药品交叉污染和微生物污染的风险。

2018年08月19日至8月31日，根据经批准的微生物棉签擦拭取样方法及检验方法验证方案（编号：VP-01-06-00-037），验证小组对微生物棉签擦拭取样方法及检验方法进行了验证，验证过程包括擦拭取样、菌悬液制备、回收率试验。在验证过程中严格按照验证方案及验证计划进行了验证，其验证方案在验证过程中没有修改，验证结果完整、真实，验证达到预期的效果。

2、验证依据：

《中华人民共和国药典》2015版四部

3、验证目的

通过对清洗消毒后微生物取样方法的回收率试验，评价取样方法的有效性、代表性和科学性，并为证明清洗方法有效性提供基本依据。

4 、范围

本次验证适合微生物棉签擦拭法取样。

5、验证小组成员及职责

表1 验证小组成员及职责

6、验证方案的实施情况

6.1证前的准备

6.1.1主要验证用仪器仪表的确认

6.1.1.1确认方法：

查看手提式压力蒸汽灭菌锅、生化培养箱、霉菌培养箱、电热恒温干燥箱、生物安全柜校验日期，确定是否在有效期内；

6.1.1.2可接受标准：

确认提式压力蒸汽灭菌锅、生化培养箱、霉菌培养箱、电热恒温干燥箱、生物安全柜已经过校验，校验合格。

6.1.1.3设备检定情况确认结果

表2 设备检定确认表

6.1.2试验环境确认

6.1.2.1确认方法：

查看阳性对照室、生物安全柜的环境监测报告，确认悬浮粒子、风速、沉降菌、浮游菌、表面微生物是否符合GMP要求。

6.1.2.2可接受标准：

确认悬浮粒子、风速、沉降菌、浮游菌、表面微生物符合GMP要求。

6.1.2.3试验环境确认结果

表3试验环境的确认

6.1.3验证用菌种及培养基

6.1.4人员培训

验证操作人员应在验证实施前应对其批准的验证方案进行培训，确保验证人员能依照验证方案正确实施。

6.2验证项目和验证方法

6.2.1试验菌株

表面微生物擦拭取样方法及检验方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、

种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

6.2.2 试验菌悬液的制备

6.2.2.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基中，于 30～ 35 ℃培养 18～ 24 ，接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡糖糖琼脂培养基中，于 20～ 25 ℃培养 48～ 72h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1 mL 含菌数 50～ 100 cfu的菌悬液；

6.2.2.2 接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡糖糖琼脂培养基上，20～ 25 ℃培养 5～ 7 d，加入 3～ 5 mL 0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后用管口带有无菌棉花的无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用 0.9％无菌氯化钠溶液制成每 1 mL 含菌数（孢子数）50～100cfu 的菌（孢子）悬液。

6.2.2.3 上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用。

6.3擦拭取样法的验证

6.3.1 供试组制备

6.3.1.1取 50mm×50mm不锈钢材质的无菌擦片，用已校验的 1 mL 移液管吸取检定菌悬液 1 mL，均匀涂布于无菌擦片上，并于层流台下吹干，取无菌棉签 1 支，用无菌的 0.9%氯化钠溶液浸湿，并将其靠在锥形瓶口上挤压至无多余的浸润剂滴落。握住棉签柄，在取样点处选择约为 25 cm2以 30°角与取样表面接触，纵向缓慢并充分擦拭，反转棉签，同法横向擦拭（见图 1），然后将棉签端用无菌剪刀剪断置于 20 mL 的 0.9%无菌氯化钠溶液中，充分振摇 5 min，做好标识，作为供试品溶液。每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片。

6.3.1.2取全部供试品溶液，经薄膜法过滤后，用pH=

7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 50 mL 冲洗滤膜，将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，分别于 30～35 ℃培养 72 h、20～25℃培养120 h，记录各平皿上菌落数。

图 1 擦拭示意图

6.3.2 菌液组制备

吸取菌悬液 1 mL，加入 0.9%无菌氯化钠溶液20 mL 中，全部经薄膜过滤法过滤，用pPH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 50 mL 冲洗滤膜，将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，平行制备2个平皿，分别于 30～35 ℃

培养 72 h、20～25 ℃培养120 h，记录各平皿上菌落数。

6.3.3 阴性对照组制备

取 0.9%无菌氯化钠溶液 20 mL 代替供试品溶液，其它操作同 6.3.1.2。

6.3.4回收率计算

回收率以 3 次实验测试值的平均值计。

6.3.5可接受标准

回收率≥70% ，RSD≦20%。

6.3.6擦拭取样法验证实验结果（见附件1）

6.3.7结论：

6.4 微生物限度检验方法学验证

6.4.1 供试组制备

取 50mm×50mm不锈钢材质的无菌擦片，取无菌棉签 1 支，用无菌的 0.9%氯化钠溶液浸湿，并将其靠在锥形瓶口上挤压至无多余的浸润剂滴落。握住棉签柄，在取样点处选择约为 25 cm2以30°角与取样表面接触，纵向缓慢并充分擦拭，反转棉签，同法横向擦拭（见图 1），然后将棉签端用无菌剪刀剪断置于 20 mL 的 0.9%无菌氯化钠溶液中，充分振摇 5 min，做好标识，作为供试品溶液。平行制备两个不锈钢载片。

取供试液 20 mL，菌悬液 1 mL 经薄膜过滤法过滤，将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，分别于 30～35 ℃培养 72 h、20～25℃培养120 h，记录各平皿上菌落数。

6.4.2菌液组制备

取 pH=7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液 100 mL 加入薄膜过滤器中，过滤。取缓冲液 20 mL，菌悬液 1 mL 经薄膜过滤法过滤，将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，平行制备2个平皿，分别于 30～35 ℃培养 72 h、20～25℃培养120 h，记录各平皿上菌落数。

6.4.3 阴性对照组制备

取 0.9%无菌氯化钠溶液 20 mL，经薄膜过滤法过滤，将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，分别于 30～35 ℃培养 72 h、20～25℃培养120 h，记录各平皿上菌落数。

6.4.4 回收率计算

回收率以 3 次实验测试值的平均值计。

6.4.5可接受标准

回收率应≥70%，RSD≦20% 。

6.4.6微生物限度检验验证实验结果（见附件2）

6.4.7结论：

7.再验证建议：

若该产品的组分或原检验条件发生改变时，需重新确认。

8.验证结果评价及结论：

9.附件清单

附件1《擦拭取样法验证实验结果》

附件2《微生物限度检验验证实验结果》

附件3《验证报告批准书》

附件1

验证报告批准书