_高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量
枸橼酸作为一种常见的药用辅料，广泛应用于药品生物制品的生产中，主要作为pH值调节剂和稳定剂等。枸橼酸在人体内广泛存在，可促进体内钙的排泄，是泌尿系统结石的重要抑制因子，适当剂量对人体无害，但长期摄入则可能导致低钙血症［1］。在生物制品的生产中，特别是血液制品的生产中，常加入适量的枸橼酸作为稳定剂，可利于制剂的生产、贮存和运输。因此，对枸橼酸在制剂成品中的含量的控制尤其重要［2］。
高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中
枸橼酸离子的含量
张伟1，任连杰1，张彤1，韩春霞2
1.北京市药品检验所，北京100035；
2.赛默飞世尔科技（中国）有限公司，北京100007
摘要：目的采用高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量。方法高效阴离子交换色谱法色谱条件：色谱柱：IonPac AS11-HC离子交换柱（4mm×250mm）；流动相：20mmol／L的NaOH溶液，等度洗脱20min，流速：1.0ml／min；抑制器：ASRS4mm阴离子抑制器，抑制电流120mA；检测器：电导检测器，检测池温度30℃，进样量：25μl。对建立的方法进行线性范围、检测限的确定以及准确性、精密性验证，并进行初步应用。结果枸橼酸离子浓度在0.1～2.0μg／ml范围内，对照品色谱峰面积与枸橼酸离子浓度呈良好的线性关系，r=0.9990，按信噪比（S／N）为3确定方法的检测限为0.01μg／ml；准确性试验枸橼酸离子的总平均回收率为97.80％，RSD为
0.69％；1份加样人凝血因子Ⅷ溶液连续测定6次峰面积的RSD为0.08%；高效阴离子交换色谱法、比色法及阳离
子交换色谱法测定3批人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子含量的结果基本一致，均符合《中国药典》三部（2010版）规定。
结论高效阴离子交换色谱法可用于测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量，且该方法操作简便、快速，准确性、精密性高。
关键词：阴离子交换色谱法；凝血因子Ⅷ；枸橼酸；含量测定
中图分类号：O657.7+5文献标识码：A文章编号：1004-5503（2014）01-0125-04
Determination of citrate ion content in human coagulation factorⅧby high performance anion exchange chromatography
ZHANG Wei*，REN Lian-jie，ZHANG Tong，Han Chun-xia
*Beijing Institute for Drug Control，Beijing100035，China
Corresponding author：REN Lian-jie，E-mail：warenlj@https://www.360docs.net/doc/da8227853.html,
Abstract：Objective To determine the citrate ion content in human coagulation factorⅧ（FⅧ）by high performance anion exchange chromatography（HPAEC）.Methods The condition for HPAEC was as follows：chromatographic col－umn：IonPac AS11-HC（4mm×250mm）；mobile phase：20mmol／L sodium hydroxide solution；time for isocratic elu－tion：20min；flow rate：1.0ml／min；inhibitor：ASRS4mm anion inhibitor；inhibition current：120mA；detector：electrical conductivity detector；detector cell temperature：30℃；sample loading：25μl.The developed method was de－termined for linear range and detection limit，verified for accuracy and precision，and applied preliminarily.Results The chromatographic peak area of reference showed good linear relationship to citrate ion content at a range of0.1~
2.0μg／ml（r=0.9990）.Serving the signal-to-noise（S／N）ratio as3，the detection limit of the developed method
was0.01μg／ml.The total mean recovery of citrate ion in accuracy test was97.80%，with a RSD of0.69%.The RSD of6test results of one sample of FⅧwas0.08%.The determination results of three batches of FⅧby HPAEC，col－orimetry and cation exchange chromatography were basically in agreement，which met the requirements in Chinese Phar－macopoeia（VolumeⅢ，2010edition）.Conclusion HPAEC may be used for determination of citrate ion content in FⅧ，which was simple and rapid，with high accuracy and precision.
Key words：Anion exchange chromatography；Coagulation factorⅧ；Citric acid；Content determination
·技术方法·通讯作者：任连杰，E-mail：warenlj@https://www.360docs.net/doc/da8227853.html,
现有的枸橼酸离子的检测方法主要有非水滴定法、高效液相色谱法、离子色谱法以及比色法等［3］。在《中国药典》三部（2010版）附录中，收载了比色法、离子色谱法及高效液相色谱法用于枸橼酸离子的测定。实际应用中发现，比色法测定时，对照品和供试品的吸光度均较低，准确度和重复性均不理想，另外，试验中需要使用大量吡啶，不利于环境和人员保护；离子色谱法采用阳离子交换色谱柱、示差折光检测器进行检测［4］，色谱峰响应值偏低，检测灵敏度不高；高效液相色谱法采用十八烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱，检测波长210nm，该方法运行时间较长，时间和试剂成本较高，另外，紫外检测采用末端吸收波长，测定容易受到干扰。针对人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子含量较低，同时又需对其含量进行限度控制，本实验建立了一种应用阴离子交换原理进行分离，电导检测器进行检测的高效阴离子交换色谱法，对人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子含量进行测定。
1材料与方法
1.1供试品人凝血因子Ⅷ由华兰生物股份有限公司生产，规格200IU／瓶，批号为：201202004、201202005、201202006。
1.2主要试剂及仪器优级纯枸橼酸试剂纯度＞99.8%，批号：20101206，购自国药集团化学试剂有限公司；1.5%磺基水杨酸纯度＞99.8%，批号：20100306，购自北京化学试剂厂；实验所用溶液均用电阻率为18.2MΩ·cm的去离子水配制；IonPac AS11-HC离子交换柱（4mm×250mm）及IonPac AS11保护柱（4mm×50mm）购自美国Thermo公司；ICS-3000型离子色谱仪购自美国Dionex公司；Milli-Q超纯水仪购自美国Millipore公司。
1.3溶液配制
1.3.1供试品溶液取供试品1支，用10.0ml注射用水稀释作为供试品溶液；取供试品溶液1ml，置离心管中，加入4ml1.5%磺基水杨酸溶液，混匀，室温静置2h以上，1459×g离心15min，收集上清。
1.3.2对照品溶液称取10mg枸橼酸，置100ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（0.1mg／ml），量取储备液，加水稀释成0.1、0.5、1.0、1.5和
2.0μg／ml对照品溶液。
1.4检测方法色谱条件：色谱柱：IonPac AS11-HC 离子交换柱（4mm×250mm）及IonPac AS11保护柱（4mm×50mm）；流动相：20mmol／L NaOH溶液，等度洗脱20min，流速：1.0ml／min；抑制器：ASRS4mm阴离子抑制器，抑制电流120mA；检测器：电导检测器，检测池温度30℃，进样量：25μl；色谱数据采集和处理采用Chameleon6.5色谱工作站。精密量取供试品和对照品溶液各25μl，注入色谱仪，以注射用水作为空白对照，记录色谱图。以对照品溶液枸橼酸离子浓度对其相应的峰面积作直线回归，求得直线回归方程，直线回归相关系数应不低于0.999。计算供试品溶液枸橼酸离子含量，再乘以相应的供试品稀释倍数，即为供试品枸橼酸离子含量。
1.5方法的验证
1.5.1线性范围及检测限的确定精密量取0.1、0.5、1.0、1.5和
2.0μg／ml对照溶液，按1.4项方法进行检测。以枸橼酸浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程，并确定线性范围及检测限。
1.5.2准确性及精密性验证精密量取供试品溶液（批号：201202005）0.5ml，分别加入低、中、高浓度（0.2919、0.4865和0.6811μg／ml）枸橼酸对照品溶液，混匀后，按1.4项方法检测，每个浓度重复测定3次，计算回收率，验证方法的准确性。另取1份中浓度加样供试品溶液，按1.4项方法连续测定6次，计算6次主成分峰面积的RSD，验证方法的精密性。
1.6方法的初步应用精密量取供试品溶液（批号：201202005）25μl，按1.4项方法进样，以标准曲线法定量。取3批人凝血因子Ⅷ，按1.4项方法测定样品中枸橼酸离子含量。同时采用比色法、阳离子交换色谱法（示差折光检测器）测定样品中枸橼酸离子含量。
2结果
2.1对照品、供试品溶液及空白对照色谱图对照品、供试品色谱图枸橼酸峰保留时间均约15.3min，其他杂峰对主峰无干扰，见图1。
2.2方法线性范围及检测限标准曲线（图略）回归方程为：Y=0.004+0.15X，r=0.9990。枸橼酸离子浓度在0.1～2.0μg／ml范围内，对照品色谱峰面积与浓度呈良好的线性关系。按信噪比（S／N）为3确定方法的检测限为0.01μg／ml。
2.3方法的准确性和精密性试验结果显示，用建立的方法检测人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的总平均回收率为97.80%，RSD为0.69%，见表1。1份加样供试品溶液连续测定6次，枸橼酸峰面积RSD为0.08%。表明该方法准确性及精密性良好。
图1对照品（A ）、供试品
（B ）溶液及空白对照（C ）色谱图Fig 1.Chromatographic profiles of reference （A ），test sample （B ）and blank control （C ）表1加样回收率试验结果（n =3）
Tab 1.Test result of spike recovery rate （n =3）
底值加入量实测值回收率总平均回收率RSD （μg ／ml ）（μg ／ml ）
（μg ／ml ）（%）（%）
（%）
0.22090.29190.504797.210.22090.29190.508798.580.22090.29190.502796.530.22090.48650.695397.520.22090.48650.698098.0797.80
0.69
0.22090.48650.700798.620.22090.68110.885397.550.22090.68110.887397.850.2209
0.6811
0.8900
98.24
2.4方法的初步应用试验结果显示，
高效阴离子交换色谱法、比色法及阳离子交换色谱法测定3批人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子含量的结果基本一致，均符合《中国药典》三部（2010版）规定，不超过25mmol ／L ，见表2。
表23种方法测定凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量（mmol ／L ）Tab 2.Determination of citrate ion in F Ⅷby three methods （mmol ／L ）
样品批号
201202004
201202005201202006高效阴离子交换色谱法8.007.967.97比色法
11.410.613.5阳离子交换色谱法
10.0
9.91
10.1
3讨论
常见的阴离子分析柱有IonPacAS11、IonPacAS 18及IonPacAS23等，本实验前期对其进行了筛选比较，结果显示IonPacAS11大容量阴离子交换柱对枸橼酸的分离以及排除其他常见共存离子的影响效果最佳，同时色谱峰形及保留时间也较好。
为排除人凝血因子Ⅷ及溶剂中可能存在的共存离子的影响，本实验前期结合待测离子的特点，对常
见的流动相系统以及流动相的浓度、梯度进行了筛选，结果显示，NaOH 溶液对羟基酸的分离具有较高选择性，柱后连接阴离子抑制器，可降低本底电导值，提高对枸橼酸离子的检测灵敏度。同时，对比等度洗脱和梯度洗脱淋洗后发现，等度洗脱即可满足枸橼酸离子与共存离子的分离，色谱出峰时间也较梯度洗脱更快，最终确定流动相洗脱条件为20mmol ／L NaOH 溶液，洗脱时间20min 。本实验前期也对不同色谱柱温度（30、35、40℃）对试验结果的影响进行了筛选，结果显示，色谱柱温度30℃即可达到满意效果。
人凝血因子Ⅷ中主要成分为蛋白质组分，对于无机离子的测定干扰较大，因此，必须通过合适的方法将蛋白去除。常见的蛋白质去除方法有物理方法和化学方法，物理方法主要是超滤离心处理，而化学方法主要是通过酸、碱、盐或有机溶剂来沉淀蛋白，本实验前期对钨酸钠沉淀法、磺基水杨酸沉淀法、三氯醋酸沉淀法等几种常见的化学沉淀法进行了比较，结果表明，与钨酸钠溶液和三氯醋酸溶液比较，足够量的1.5%磺基水杨酸溶液可较好的将人凝血因子Ⅷ中的蛋白质沉淀完全，离心处理后的上清液测定后，干扰因素较少，因此，最终选择1.5%的磺基水杨酸溶液作为蛋白沉淀剂进行样品的预处理［5］。此外，本实验前期还比较了液相色谱法不同检测器的检测灵敏度，紫外检测器（210nm ）检测灵敏度为17.2μg ／ml ，示差检测器为3.82μg ／ml ，电导检测器为0.01μg ／ml ，本实验所用电导检测器检测灵敏度最高。
本实验建立的高效阴离子交换色谱法具有操作简便、快速，准确性、精密性高等优势，适用于对人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子含量的检测。该方法可弥补
检测方法
0.0
3.87.511.315.0时间（min ）
18.80.0
3.8
7.511.315.018.8
0.0
3.87.511.315.018.8
0.600.400.200.001.001.201.400.801.601.
80-0.
200.600.400.200.001.001.201.400.801.601.80
-0.
200.600.400.200.001.001.201.400.801.601.80
-0.
20A B C 15.383
15.390
μS
《中国药典》三部（2010版）中规定方法的不足之处，为其他血液制品中枸橼酸离子的质量控制提供了参考，也为新版《中国药典》附录的起草提供了依据。
参考文献
［1］Wang XM，Mao XH，Wang K.Simultaneous determination of sulfite and citric acid in chinese medicine injection by ion
chromatography［J］.Chin J Heal Lab Technol，2012，22（3）：
470-472.（in Chinese）
王欣美，毛秀红，王柯.离子色谱法同时测定中药注射剂中
亚硫酸盐及枸橼酸含量的研究［J］.中国卫生检验杂志，
2012，22（3）：470-472.
［2］Chinese Pharmacopoeia Commission.Chinese Pharmacopoeia （3th parts）［S］.Beijing：China Med Technol Press，2010：Ap-
pendix52.
国家药典委员会.中国药典（三部）［S］.北京：中国医药科技
出版社，2010：附录52.［3］Yan JL，Wang L.Ion chromatography for simultaneous determi.
nation of oxalate and citric acid residues in urine and plasm
［J］.Chin J Heal Lab Technol，2010，20（3）：478-480.（in
Chinese）
颜金良，王立.离子色谱法同时测定血清和尿中草酸及枸橼
酸含量研究［J］.中国卫生检验杂志，2010，20（3）：478-480.［4］Wang ML，Yang PY，Hou JF.RP-HPLC method for quantita.
tive analysis of citration［J］.Chin J Pharma Anal，2011，31（4）：788-791.（in Chinese）
王敏力，杨鹏云，侯继锋.RP-HPLC法定量测定枸橼酸离子
含量［J］.药物分析杂志，2011，31（4）：788-791.
［5］Zhang T，Wu HY，Zhang W，et al.Content determination of glycine in the blood products by HPLC with post-column deri.
vatization［J］.China Pharmacy，2013，24（25）：2377-2379.
（in Chinese）
张彤，武晗燕，张伟，等.柱后衍生HPLC法测定血液制品
中甘氨酸的含量［J］.中国药房，2013，24（25）：2377-2379.
收稿日期：2013-06-08编辑：王佳凤
由士研传媒主办，国际疫苗研究所、国际疫苗学会、中国生物技术股份有限公司和百华协会支持的亚洲品牌疫苗盛会VacChina2014-第四届疫苗中国发展国际峰会，将于2014年4月8~9日在中国北京隆重召开。
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④成人疫苗的发展及中国疫苗市场的未来趋势；
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二会议参与者
疫苗生产企业、生物技术公司、学术机构、非营利性机构、研发&生产外包机构、研发设备供应商、生产设备供应商、细胞培养公司、疫苗分销商、工程公司、冷链设备及解决方案供应商、咨询公司、风险投资企业、生物产业园区等。
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VacChina2014-第四届疫苗中国发展国际峰会将于2014年4月在京举行
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(完整)高效液相色谱法
仪器分析练习题（二）——高效液相色谱法部分 一、选择题 1. 分离一组高聚物（分子量>2000）时最宜采用的色谱方法是（D ） A. 气固色谱 B. 反相键合相色谱 C. 离子交换色谱 D. 凝胶色谱 2. Si-O-Si-C型的18烷基固定相可用于（ B ） A. 正相色谱 B. 反相色谱 C．离子交换色谱 D. 空间排阻色谱 3. 反相离子对色谱法分离试样组分时，随着对离子浓度的增大，组分的保留时间（A ）。 A. 增大 B. 减小 C. 不变 D. 不能确定 4. 下列试剂中可作为正相色谱流动相的是（C D ）。 A. 水 B. 甲醇 C．乙腈 D. 正已烷 5. 在惰性担体表面健合上基团－SO3ˉ后的离子交换树脂称为（ B ）。 A．强碱性阳离子交换树脂 B. 强酸性阳离子交换树脂 C．强碱性阴离子交换树脂 D. 强酸性阴离子交换树脂 6. 分离一组高沸点的物质时最宜而是采用的色谱方法是（D ）。 A. 气液色谱 B. 气固色谱 C. 毛细管气相色谱 D. 液相色谱 7. 应用正相色谱法分析一组组分时，组分的出峰顺序为（A ）。 A. 极性小的组分先出峰 B. 极性大的组分先出峰 C. 分子量小的先出峰 D. 分子量大的先出峰 8. 火焰光度检测器是（ C ）检测器。 A. 通用型、质量型 B. 通用型、浓度型 C. 选择型、质量型 D. 选择型、浓度型 9. 梯度洗脱适用于下列哪种色谱分析方法是（ C ）。 A. 气液色谱 B. 液液分配色谱 C. 凝胶色谱 D. 反相键合相色谱 10. 下列试剂中最适宜作为反相色谱流动相的是（ A ）。 A. 甲醇水 B. 环已烷 C．四氯化碳 D. 正已烷 11. 在惰性担体表面健合上基团－NR3＋后的离子交换树脂称为（ C ）。 A．强碱性阳离子交换树脂 B. 强酸性阳离子交换树脂 C．强碱性阴离子交换树脂 D. 强酸性阴离子交换树脂 12. 分离一组难挥性、可离解的物质时最宜而是采用的色谱方法是（ C ）。 A. 气液色谱 B. 正相色谱 C. 离子交换色谱 D. 气固色谱 13. 应用反相键合相色谱分离R-CH3、R-COOH及R-COCH3（R为一长碳链）时出峰顺序为（ A ）。 A. R-COOH、R-COCH3 、R-CH3 B. R-CH3 、R-COCH3 、R-COOH、 C. R-COCH3 、R-COOH、R-CH3 D. R-CH3 、R-COOH、R-COCH3
离子交换柱层析原理
离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 1.离子交换层析的基本原理： 离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。 2.离子交换层析介质： 离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。 阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可
离子交换色谱
离子交换色谱 一、实验原理： 离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography 简称为 IEC) 是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂 ; 而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 离子交换层析是用离子交换剂作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。 带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。 二、实验设计 离子交换剂；缓冲液；洗脱剂 具体操作： 1、离子交换介质的选择： 考虑目的分子的大小，目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团；功能集团的强弱，目的分子稳定，选择强交换介质。 对于大多数纯化步骤来说，建议开始的时候使用强离子交换柱，可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。对于一个已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。如果选用阴离子交换剂，使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷，可与阴离子交换剂结合。如果选用阳离子交换剂，缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷，可与阳离子交换剂结合。对于一个未知等电点的蛋白质，可以先选择一个阴离子交换剂，再选择一个中性的pH缓冲液，将蛋白质样品透 析至pH7.0，然后过阳离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pHo 如果目的蛋白再穿过液中，说明目的蛋白在此 pH条件下带正电荷，可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸8.0，然后再过阴离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的 pH。以此类推，直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止，也可用阳离子交换剂作类似的选择，不过要注意，pH 的改变应向减小的方向进行。 功能集团的强弱 一般情况下，在分离等电点pH为6-9的目的分子，尤其是当目的分子不稳定时，需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质。 流动相(缓冲液)的选择： 离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对 pH有一定缓冲作用的溶
离子类高效液相色谱法
离子类高效液相色谱法 1308102-19 彭陈 摘要：离子色谱是高效液相色谱的一种，是分析阴离子和阳离子的一种液相色谱方法。 离子色谱的分离机理主要是离子交换。分离方式有3种：离子交换色谱，离子排斥色谱和离子对色谱。其中离子交换色谱用低容量的离子交换树脂，分离机理主要是离子交换;离子排斥色谱用高容量的树脂，分离机理主要是离子排斥；离子对色谱用不含离子交换基团的多孔树脂，分离机理主要是基于吸附和离子对的形成。 一，离子对色谱 离子对色谱法是将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。 在色谱分离过程中，流动相中待分离的有机离子A+（也可以是带负电子的离子）与固定相或流动相中带相反电荷的对离子B-结合，形成离子对化合物A+B-，然后在两相间进行分配： 若固定相为有机相，流动相为水溶液，就构成反相离子对色谱，此时A= 的分布系数B-为： 当流动相的pH值、离子强度、有机改性剂的类型、浓度及温度保持恒定时，k'与对离子的浓度［B- ］w成正比。因此通过调节对离子的浓度，就可改变被分离样品离子的保留时间Tr。
离子对色谱法，特别是反相离子对色谱法解决了以往难以分离混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子的混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱以及药物等的分离。另外，还可以借助离子对的生成给试样引入紫外吸收或发荧光的基团，以提高检测的灵敏度。 二，离子交换色谱法以及离子色谱法 （1）离子交换色谱法 离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配，固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。 离子交换色谱的固定相是交换剂，根据交换剂性质可分为： 阳离子交换剂和阴离子交换剂。 交换剂由固定的离子基团和可交换的平衡离子组成。当流动相带着组分离子通过离子交换柱时，组分离子与交换剂上可交换的平衡离子进行可逆交换，最后达到交换平衡，阴阳离子的交换平衡可表示为： 阳离子交换：R+Y-+ X-= R+X-+ Y- 阴离子交换：R-Y++ X+= R-X++ Y+ R+、R-—为交换剂上的固定离子基团，如RSO3-或RNH3+； Y+、Y-—为可交换的平衡离子，可以是H+、Na+或OH-、Cl-等 X+、X-—为组分离子。 组分离子对固定离子基团的亲和力强，分配系数大，其保留时间长；反之，分配系数小，其保留时间短；因此：离子交换色谱：是根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的。
离子对色谱法
高效液相色谱法中离子对色谱法、离子交换色谱法及离子色谱法原理的研究及应用 1308102-06余胜 摘要：本文主要讨论正相离子对色谱法、反相离子对色谱法、离子交换色谱发及离子色谱法的原理，以及在应用上的特征与区别。 关键词：正相离子对色谱法；反相离子对色谱法；离子交换色谱法；离子色谱法高效液相色谱法是20世纪70年代发展起来的一项高效、快速的分离技术。液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。在经典的液体柱色谱法的基础上引入气相色谱法的理论，在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。他可分为离子对色谱法、离子交换色谱法及离子色谱法等，其应用非常广泛。且具有高压、高速、高效以及高灵敏度等这几个突出的特点。 1.离子对色谱法 离子对色谱法是将一种(或多种)与溶质分子电荷相反的离子(称为对离子或反离子)加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。用于阴离子的对离子是烷基铵类，如氢氧化四丁基胺等；用于阳离子的对离子是烷基磺酸类，如己烷磺酸钠等。 近年来有，贺霞,史朝晖等[1]通过用反相离子对色谱法测定了复方维生素片中的维生素B1、维生素B2、维生素B 6这3种水溶性维生素含量，他们以己烷磺酸钠作为离子对试剂，采用DiamonsilC18(250mm×4.6mm,5μm)柱，同时测定这三种维生素，具有好的相关性，此种方法可用于这三种物质含量的测定及质量控制研究。 随后有李小兵，王勇军等[2]用离子对色谱法检测阿德福韦酯中降解产物的含量。采用Welch Materials XB-C8 柱(250 mm ×4.6 mm,5μ m) ，以0.05 mol ·L-1的磷酸氢二钾和0．01 mol ·L-1四丁基硫酸氢铵缓冲溶液(磷酸调pH至3.0)乙-腈(65:35)为流动相。成功将阿德福韦酯主峰与临近杂质峰可达到基线分离，且主要降解产物阿德福韦、阿德福韦单特戊酸甲酯及9-(2 -二乙氧基膦酰甲氧基乙基)腺嘌呤分离度度均在2.0以上。故正相离子对色谱法适用于阿德福韦酯的有关物质检查及质量控制。 2.离子交换色谱法 离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质
离子交换层析
实验二离子交换层析纯化兔血清IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85 ～7.5 ），其余均属酸性蛋白。pH7.2 ～7.4 的环境中。酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG 。 【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol/L HCl 和NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)
5.0.02 ％NaN 3 6.PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9.1cm×20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器 【操作步骤】 1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 （下称A-50 ）5g ，悬于500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上层细粒。按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置30min ，装入布氏漏斗（垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。
2 ．装柱 （ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 （2 ）将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。待A-50 凝胶沉降2 ～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min ，同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。 （ 3 ）关闭出水口，待A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3 ．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速 4 滴/min ，使约2 倍床体积的洗脱液流出。并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。 4 ．加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（0.5ml 血清，体积应小于床体积的2% ，蛋白浓度以＜100mg 为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面
阴离子交换柱的使用
阴离子交换柱使用手册 注意 Chrompack IonoSpher A色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（pH>6.5）或酸性溶剂（pH<2.5）会溶解硅胶材料导致柱子损坏。 在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。 1．简介 Chrompack IonoSpher A 柱填充硅胶基质的强阴离子交换材料，含有季胺功能团。特别设计用于使用常规HPLC分析有机和无机阴离子。 2．色谱柱老化 在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。 要老化这类柱子，首先要使用甲醇淋洗，然后使用去离子水。再用你选用的洗脱液进行平衡。 在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。 3．洗脱液 推荐在这类柱上使用的洗脱液要求低电导，或者UV吸收的缓冲液，
例如磷酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5。 绝对不能使用水杨酸缓冲液，因为水杨酸分解产物会改变固定相的性质。另外，硝酸铵（1mM）可以改善峰型，而且不会明显影响保留时间，检测或定量结果。 洗脱液在使用以前要脱气，并用0.45微米滤膜过滤，防止发生检测和泵送问题。 一定要在开始使用系统以前检查有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。 4．流量和压力 注意：最高压力：不锈钢柱：4500psi；玻璃柱：3000psi 增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。 拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。
离子交换与离子交换色谱
仲恺农业工程学院Array论文题目：离子交换与离子交换色谱 论文作者：陈维权万辉 作者学号：201111014228 201111014229 所在院系：化学化工学院 专业班级：应用化学112班 指导老师：刘展眉
离子交换与离子交换色谱 摘要 本文对离子交换与离子交换色谱技术进行了综述。简要介绍了离子交换剂的作用原理；重点系统的论述了有机离子交换技术和无机离子交换技术的研究进展。并展望了有机离子交换技术和无机离子交换技术的发展方向。 关键词 离子交换色谱离子交换剂有机离子交换无机离子交换 Abstract This article by ion-exchange chromatography and ion exchange technologies for review. Brief description of the action principle of ion exchanger; key system deals with organic and inorganic ion-exchange technology of ion-exchange technology advances. And the prospect of organic ion exchange technology and development trend of inorganic ion-exchange technology. Keywords Ion Exchange Color spectrum Ion exchanger Organic ion exchange Inorganic ion exchanger 引言 随着科学技术的发展，现代分析化学的分析对象越来越复杂，待检测组分含量越来越复杂，待检测组分含量越来越低，在地球和宇宙科学、环境科学、生命科学、材料科学以及医学和考古学中，经常要求检测μg∕g,nm∕g,pg∕g甚至更低含量的组分。目前虽然有许多灵敏度和选择性很高的仪器分析方法，但在分析实践中，常常由于存在基体效应以及其他各种干扰而难以得到准确的结果，因此在分离富集仍然是分析方法中不可缺少的重要环节。 回顾化学的发展历史便可以发现：化学的发展离不开分离富集。元素周期表中的各个元素的发现，经典的化学分离和提纯方法都曾经起着重要作用。从二十世纪开始，各种天然放射性元素的逐个发现，人工放射性元素的获得，原子核裂变现象的最终确认，几乎都离不开各种化学分离技术。今年来生命科学的许多重要成就，也都与分离科学有着紧密联系。在大多数分析实验中，对复杂物料的分析或痕量、超痕量分析一般均采用样品制备-分解-分离富集-测定-数据处理的分析流程，也就是说，分离富集是分析流程中必不可少，而且往往是相当困难而又关键的环节。从分析仪器的研制和发展趋势看，分离富集技术与测量技术紧密结合是仪器分析的必然趋势。目前最有成效的是气相色谱仪、高效液相色谱仪、离子色谱仪以及测汞仪等，它们都是集分离-
离子交换层析实验原理及步骤
离子交换层析实验原理及步骤 离子交换层析实验方法 阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。 1. 剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。 下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法 2. 膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。 表1－4 分离的血清与所需DEAE—纤维素量及其他条件的大致关系 血清样品量（ml） DEAE需用量（g） 选层析柱规格（cm） 选脱液量（ml） 1~2 2 1×25 100~150 5 5 2×12 200~300 10 10 2×20 300~400 20 20 2×37
400~800 称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。 3. 平衡 将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。 4. 装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10∶1～20∶1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。 装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。 5. 上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。 样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的—球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。
阴离子交换柱使用说明
IC-PAK阴离子交换柱使用指南 2.3平衡 The Ion Exclusion 色谱柱运输过程采用10％甲醇溶液储存，在用测试溶液和向之前必需平衡活化色谱柱 平衡色谱柱：1.将色谱柱安装到仪器上。 2.用要求的洗脱液以0.5Ml/min的流速平衡10分钟，将大部分甲醇冲出色谱柱。 3.以0.1mLl/min的梯度的缓慢增加流速到1.0mL/min 4采用1.0mL/min流速平衡20分钟，或者当基线平稳后才开始分析。 如果基线不稳，检查LC系统的其他部分。 3.1准备洗脱液 指导原则：1.推荐的洗脱液是稀释的酸的水溶液 注意：当流动相采用高浓度的有机相（超过20％）降低柱子的使用效果。避免胺类，金属类，碱类和腐蚀剂，例如HCL. 2.用0.45um或者更小孔径的滤膜过滤洗脱液以除去微生物。用超纯水（18 megohm resistivity）,例如MILLI-Q的水。 3.使用真空脱气机/超声波去掉可溶于水的气体（影响泵） 4.使用Waters 在线过滤系统保护系统。 3.2样品制备和过滤 如果样品中含有那些可溶解的并且可能污染色谱柱的污染物或微粒，选用以下其中一种步骤： 1.用Waters Sample Clarification包，或者Millex过滤样品，避免色谱柱堵塞反压增 加。 2.用SEP-PAK小柱净化样品，避免污染物降低柱寿命。更多的信息请看WC02. 3.用IC-PAK保护柱，能吸收化学和物理污染物。附录A是保护柱清单。 4.1色谱柱指南 注意：新色谱柱使用前，请按4.2方法测试样品的分离。 指导原则：下面的操作指南能帮助您在Waters色谱柱上得到最好的的效果。 1.不要超过13MPa ( 13atm或2000psi )压力下使用 2.过滤所有的洗脱液。决不能使用混浊，有沉淀的流动相。 3.保护色谱柱，避免振动，机械性外力（导致洗脱液成分改变） 4.当用水做流动相组分时，请用Milli-Q 水系统纯化的水。我们可以选择去离子水或 瓶装色谱级水，某些有机化合物改变柱子的敏感性。 4.2柱效测试 4.3洗脱液制备 10mM辛烷磺酸溶液：1. 2.163g辛烷磺酸钠盐（）溶解在100mL Milli-Q水中。 2. 添加100mL 预先净化的H＋离子形式的阳离子交换树脂
离子色谱法(IC)
离子色谱法（IC） 一、离子色谱（IC）基本原理 离子色谱是高效液相色谱（HPLC）的一种，其分离原理也是通过流动相和固定相之间的相互作用，使流动相中的不同组分在两相中重新分配，使各组分在分离柱中的滞留时间有所区别，从而达到分离的目的。 二、离子色谱仪的结构 离子色谱仪一般由四部分组成，即输送系统、分离系统、检测系统、和数据处理系统。输送系统由淋洗液槽、输液泵、进样阀等组成；分离系统主要是指色谱柱；检测系统（如果是电导检测器）由抑制柱和电导检测器组成。 离子色谱的检测器主要有两种：一种是电化学检测器，一种是光化学检测器。电化学检测器包括电导、直流安培、脉冲安培、和积分安培；光化学检测器包括紫外－可见和荧光。电导检测器是IC的主要检测器，主要分为抑制型和非抑制型（也称为单柱型）两种。抑制器能够显著提高电导检测器的灵敏度和选择性，其发展经历了四个阶段，从最早的树脂填充的抑制器到纤维膜抑制器，平板微膜抑制器和先进的只加水的高抑制容量的电解和微膜结合的自动连续工作的抑制器。 三、离子色谱基本理论 离子色谱主要有三种分离方式：离子交换离子排斥和反相离子对。这三种分离方式的柱填料树脂骨架基本上都是苯乙烯/二乙烯苯的共聚物，但是树脂的离子交换容量各不相同，以下就主要介绍离子交换色谱的分离机理。 在离子色谱中应用最广的柱填料是由苯乙烯-二乙烯基苯共聚物制得的离子交换树脂。这类树脂的基球是用一定比例的苯乙烯和二乙烯基苯在过氧化苯酰等引发剂存在下，通过悬
浮物聚合制成共聚物小珠粒。其中二乙烯基苯是交联剂，使共聚物称为体型高分子。 典型的离子交换剂由三个重要部分组成：不溶性的基质，它可以是有机的，也可以是无机的；固定的离子部位，它或者附着在基质上，或者就是基质的整体部分；与这些固定部位相结合的等量的带相反电荷离子。附着上去的集团常被称作官能团。结合上去的离子被称作对离子，当对离子与溶液中含有相同电荷的离子接触时，能够发生交换。正是后者这一性质，才给这些材料起了“离子交换剂”这个名字。 离子交换法的分离基理是离子交换，用于亲水性阴、阳离子的分离。阳离子分离柱使用薄壳型树脂，树脂基核为苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物，核的表面是磺化层，磺酸基以共价键与树脂基核共聚物相连；阴离子分离柱使用的填料也是苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物，核外是磺化层，它提供了一个与外界阴离子交换层以离子离子键结合的表面，磺化层外是流动均匀的单层季铵化阴离子胶乳微粒，这些胶乳微粒提供了树脂分离阴离子的能力，其分离基理基于流动相和固定相（树脂）阳离子位置之间的离子交换。 淋洗液中阴离子和样品中的阴离子争夺树脂上的交换位置，淋洗液中含有一定量的与树脂的离子电荷相反的平衡离子。在标准的阴离子色谱中，这种平衡离子是CO 32-和HCO 3-；在标准的阴离子色谱中，这种平衡离子是H +。离子交换进行的过程中，由于流动相可以连续地提供与固定相表面电荷相反的平衡离子，这种平衡离子与树脂以离子对的形式处于平衡状态，保持体系的离子电荷平衡。随着样品离子与连续离子（即淋洗离子）的交换，当样品离子与树脂上的离子成对时，样品离子由于库仑力的作用会有一个短暂的停留。不同的样品离子与树脂固定相电荷之间的库仑力（即亲和力）不同，因此，样品离子在分离柱中从上向下移动的速度也不同。样品阴离子A -与树脂的离子交换平衡可以用下式表示： 阴离子交换 A - ＋（淋洗离子）－＋NR 4-R ＝ A -+NR 4-R ＋ （淋洗离子） 对于样品中的阳离子，树脂交换平衡如下（H +为淋洗离子）： 阳离子交换 C + ＋ H +－O 3S-R ＝ C +－ O 3S-R ＋ H + 在阴离子交换平衡中，如果淋洗离子是HCO 3-，可以用下式表示阴离子交换平衡： [][][][]4 33 4NH CO H A HCO NR A K + ---+-= K 是选择性系数。K 值越大，说明样品离子的保留时间越常。选择性系数是电荷、离子半径、系统淋洗液种类和树脂种类的函数。 离子半径 样品离子的价数越高，对离子交换树脂的亲和力越大。因此，在一般的情况下，保留时间随离子电荷数的增加而增加。也就是说，淋洗三价离子需要采用高离子强度的淋洗液，二价离子可以用较低浓度的淋洗液，而低于一价离子，所需淋洗液浓度更低。
第七节离子交换色谱
第七节离子交换色谱 离子交换色谱(ion-exchange chromatography，IEC)是发展最早的色谱技术之一。20世纪30年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义，基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离，因为:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小，蛋白质分子无法进颗粒内部，只能吸附在表面，造成有效交换容量很小；②树脂表面电荷密度过大，使蛋白质在其上吸附得过于牢固，必须用较极端的条件才能洗脱，而这样的条件往往易造成蛋白质变性；③树脂的骨架具疏水性，一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用，也容易造成蛋白质变性失活。 20世纪50年代中期，Sober和Peterson合成了羧甲基(CM-）纤维素和二乙氨乙基（DEAE-）纤维素，这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力，而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交 换容量，而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱，因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。此后，多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成，包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等，以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷，极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。 一、离子交换色谱相关理论 (一)基本原理 离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换
剂带相反电荷因而能够与之竞争结合，而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，表现出与离子交换剂在结合强度上的差异，在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。离子交换色谱的原理和一般步骤如图6.7-1所示。 图6.7-1 离子交换色谱原理 梯度缓冲液中的离子；极限缓冲液中的离子； 待分离的目标分子；▲需除去的杂质 1- 上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合；2- 吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合；3- 开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；4- 完全解吸阶段，目标分子被洗脱；5- 再生阶段，用起始缓冲液重新平 衡色谱柱，以备下次使用 蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化，即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换，带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。 (二)基本理论 1 . 离子交换作用 离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电功能基团和与功能基团电性相反的反离子组成，在水溶液中，与功能基团带相反电荷的离子(包括缓冲液中的离子、
用高效离子交换色谱和脉冲安培检测器测定
用高效离子交换色谱和脉冲安培检测器测定果汁和糖果中糖醇 摘要：本文讨论了糖果和果汁中糖醇的分析,采用戴安公司的Carbopac MA1色谱柱，NaOH 为淋洗液梯度洗脱样品，用脉冲安培检测器分离糖醇。由于Carbopac MA1色谱柱是分离糖醇的推荐柱子，适合于糖的选择性差异较大的分离，允许淋洗液的浓度有较大的变化。CarboPac MA1柱分离糖醇具有高的灵敏度和选择性，用PAD检测所以不需要加入柱后衍生试剂。该方法适合糖醇的分析，具有很好的重复性及灵敏度。 关键词：糖醇；阴离子交换柱；脉冲安培检测器 糖醇有甜味而无热量，因此在糖果生产中用糖醇作甜味剂。食品中（特别是减肥食品中）常用山梨醇（蔗糖甜度的60％）和甘露醇代替蔗糖[1]，但因其有轻泻性和利尿性，在食品中它们的用量有一定限制。糖醇（也称醛醇）是醛糖的还原型。例如：D-葡萄糖可被还原成葡萄糖醇（山梨糖醇）[2]。 Carbopac MA1对糖醇有独特的选择性。作为高效高容量的阴离子交换柱，Carbopac MA1 可用高浓度的NaOH为淋洗液分离糖醇。与金属包覆的柱子不同，MA1柱可以在室温下用高浓度NaOH作为淋洗液，并用脉冲安培检测器检测得到最高的灵敏度；另外，用金属包覆的柱子时，大分子的糖先被淋洗，糖醇洗脱在后，而用MA1时，洗脱顺序取决于pKa值。高pKa的糖醇先被洗脱，依次为单糖和有低pKa的双糖等。 本文讨论了糖果和果汁中糖醇的分析。此外，Carbopac MA1柱也可用于体液、活组织和糖共轭物的还原糖（即β-裂解反应产物）的分离。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 梯度泵、脉冲安培检测器、色谱工作站 50％（w/w）低CO32-的NaOH溶液； 肌糖（纤维糖）、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、己六醇、树脂醛糖甘露糖、木糖和半乳糖。 1.2色谱条件 分离柱：Carbopac MA1（4×250mm）；压力：800-1100psi 进样体积：10μL 淋洗液：A: 去离子水 B: 1.0M NaOH 流速：0.4mL/min；检测：脉冲安培，金工作电极； 1.3试剂和标准的配制 淋洗液B：1M NaOH，52mL NaOH（50％w/w）稀释至1.0L 1.4样品的配制 “无糖”硬糖：称3.4g于10mL水中，用水稀释1:1000。 苹果汁：稀释苹果汁1:1000。 口香糖：取一小片（约2.7g）口香糖放入10mL水中，超声溶解10min，过On-Guard A 预处理柱以除去阴离子，再通过0.45μm滤膜除去颗粒物。用水稀释1000倍，备用。 2 结果与讨论 Carbopac MA1允许用NaOH淋洗液的浓度范围是0-1M。该点非常重要，因糖醇的pKa 高，而且各不相同。在MA1柱上分离时，淋洗液的pH值接近糖醇的pKa值。改变淋洗液NaOH的浓度可改变淋洗液的pH值，从而改变化合物的有效电荷和洗脱顺序，达到好的分离结果。图1A和图1B是一些糖醇的淋洗液浓度和容量因子的关系。从图可找出糖醇分离的最佳浓度。
色谱柱阴离子交换柱使用手册
阴离子交换柱使用手册 Chrompack HPLC lonoSpher A Columns Chrompack IonoSpher A色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（p H>6.5）或酸性溶剂（pH<2.5）会溶解硅胶材料导致柱子损坏。 在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。 1 . 简介 Chrompack IonoSpher A柱填充硅胶基质的强阴离子交换材料，含有季胺功能团。特别设计用于使用常规HPLC分析有机和无机阴离子。 2.色谱柱老化 在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。 要老化这类柱子，首先要使用甲醇淋洗，然后使用去离子水。再用你选用的洗脱液进行平衡。 在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。 3.洗脱液 推荐在这类柱上使用的洗脱液要求低电导，或者uv吸收的缓冲液，例如磷酸缓 冲液，pH范围从2.5到6.5。 绝对不能使用水杨酸缓冲液，因为水杨酸分解产物会改变固定相的性质。另外，硝酸铵（1mM可以改善峰型，而且不会明显影响保留时间，检测或定量结果。 洗脱液在使用以前要脱气，并用0.45微米滤膜过滤，防止发生检测和泵送问题。
4.流量和压力 注意：最高压力：不锈钢柱：4500psi ;玻璃柱：3000psi 增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。 如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。 拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。 高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。 使用保护柱（见第6节）会防止污染物沉积在分析柱上。 5.样品准备 保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将疏水性/与流动 相极性差别很大的化合物泵入色谱柱，不管是来自流动相还是样品。特别地，要禁止导入颗粒杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常困难或者不可能去除。 6.保护柱 一定要使用保护柱，因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高而且影响选择性。对于ChromSep柱我们建议使用ChromSep Anion交换保护柱。当柱压增高的或者观察到柱效降低的时候就需要更换保护柱了。对于常用不锈钢柱，我们 建议使用Chromguard Anion exchange High Efficiency （高效）柱（10X3.0mm）或High Capacity （高容量）柱（50X3.0mm）。 7.进样量和浓度
_高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量
枸橼酸作为一种常见的药用辅料，广泛应用于药品生物制品的生产中，主要作为pH值调节剂和稳定剂等。枸橼酸在人体内广泛存在，可促进体内钙的排泄，是泌尿系统结石的重要抑制因子，适当剂量对人体无害，但长期摄入则可能导致低钙血症［1］。在生物制品的生产中，特别是血液制品的生产中，常加入适量的枸橼酸作为稳定剂，可利于制剂的生产、贮存和运输。因此，对枸橼酸在制剂成品中的含量的控制尤其重要［2］。 高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中 枸橼酸离子的含量 张伟1，任连杰1，张彤1，韩春霞2 1.北京市药品检验所，北京100035； 2.赛默飞世尔科技（中国）有限公司，北京100007 摘要：目的采用高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量。方法高效阴离子交换色谱法色谱条件：色谱柱：IonPac AS11-HC离子交换柱（4mm×250mm）；流动相：20mmol／L的NaOH溶液，等度洗脱20min，流速：1.0ml／min；抑制器：ASRS4mm阴离子抑制器，抑制电流120mA；检测器：电导检测器，检测池温度30℃，进样量：25μl。对建立的方法进行线性范围、检测限的确定以及准确性、精密性验证，并进行初步应用。结果枸橼酸离子浓度在0.1～2.0μg／ml范围内，对照品色谱峰面积与枸橼酸离子浓度呈良好的线性关系，r=0.9990，按信噪比（S／N）为3确定方法的检测限为0.01μg／ml；准确性试验枸橼酸离子的总平均回收率为97.80％，RSD为 0.69％；1份加样人凝血因子Ⅷ溶液连续测定6次峰面积的RSD为0.08%；高效阴离子交换色谱法、比色法及阳离 子交换色谱法测定3批人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子含量的结果基本一致，均符合《中国药典》三部（2010版）规定。 结论高效阴离子交换色谱法可用于测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量，且该方法操作简便、快速，准确性、精密性高。 关键词：阴离子交换色谱法；凝血因子Ⅷ；枸橼酸；含量测定 中图分类号：O657.7+5文献标识码：A文章编号：1004-5503（2014）01-0125-04 Determination of citrate ion content in human coagulation factorⅧby high performance anion exchange chromatography ZHANG Wei*，REN Lian-jie，ZHANG Tong，Han Chun-xia *Beijing Institute for Drug Control，Beijing100035，China Corresponding author：REN Lian-jie，E-mail：warenlj@https://www.360docs.net/doc/da8227853.html, Abstract：Objective To determine the citrate ion content in human coagulation factorⅧ（FⅧ）by high performance anion exchange chromatography（HPAEC）.Methods The condition for HPAEC was as follows：chromatographic col－umn：IonPac AS11-HC（4mm×250mm）；mobile phase：20mmol／L sodium hydroxide solution；time for isocratic elu－tion：20min；flow rate：1.0ml／min；inhibitor：ASRS4mm anion inhibitor；inhibition current：120mA；detector：electrical conductivity detector；detector cell temperature：30℃；sample loading：25μl.The developed method was de－termined for linear range and detection limit，verified for accuracy and precision，and applied preliminarily.Results The chromatographic peak area of reference showed good linear relationship to citrate ion content at a range of0.1~ 2.0μg／ml（r=0.9990）.Serving the signal-to-noise（S／N）ratio as3，the detection limit of the developed method was0.01μg／ml.The total mean recovery of citrate ion in accuracy test was97.80%，with a RSD of0.69%.The RSD of6test results of one sample of FⅧwas0.08%.The determination results of three batches of FⅧby HPAEC，col－orimetry and cation exchange chromatography were basically in agreement，which met the requirements in Chinese Phar－macopoeia（VolumeⅢ，2010edition）.Conclusion HPAEC may be used for determination of citrate ion content in FⅧ，which was simple and rapid，with high accuracy and precision. Key words：Anion exchange chromatography；Coagulation factorⅧ；Citric acid；Content determination ·技术方法·通讯作者：任连杰，E-mail：warenlj@https://www.360docs.net/doc/da8227853.html,