金线莲组培快繁技术研究

金线莲组培快繁技术研究 【摘要】?? 目的建立金线莲快繁体系。方法以茎段为外植体，开展了茎段不同部位、培养基、激素、有机物和活性炭对不定芽增殖、幼苗生长的影响研究，并进行了移栽试验。结果外植体以不含顶芽和长根的中间段茎节为好；不定芽增殖最佳培养基配方为MS（或B5）+BA3.0?mg/L?+NAA0.5～1.0?mg/L，两个月增殖倍数达5.0以上；壮苗最适培养基为1/2MS＋NAA3.0?mg/L＋6-BA?0.5?mg/L＋香蕉提取物20%（或椰子汁20%）；试管苗移栽适宜的基质为菜园土1份＋2～3?mm粗砂2份（或1份）＋木屑1份（或2份），3个月成活率均达100%，且生长良好。结论采用上述方法，能实现金线莲幼苗的快速繁殖。 ?? 【关键词】??金线莲；?快速繁殖；?增殖；?生长；?移栽? 金线莲Anoectochilus?roxburghii（wall.）lindl为兰科开唇兰属多年生草本，别名金蚕、金线兰、金线虎头蕉等，是我国传统珍贵药材，素有“金草”“神药”“乌人参”等美称，在民间应用范围较广，广泛应用于风湿性关节炎、高血压病、糖尿病、肾病等疑难杂症的治疗和强身健体、病后体虚恢复等方面，在浙江、福建、台湾等省和东南亚地区被视为珍稀名贵药材，特别在台湾省更是备受青睐，被称为“药中之王”［1，2］。? ????? 金线莲种子微小，由未成熟的胚及数层种皮细胞构成，自然萌发率和繁殖率低，目前市场上货源主要来自于野生采挖，产品一直处于供不应求的状况。近年来，随着对其药效学和临床应用研究的深入，对金线莲药用价值的认识进一步提高，其市场货源紧缺的状况更为严峻，野生资源也不断遭到破坏性采挖，以致于处于濒临灭绝之地。本研究旨在采用组织培养技术，解决金线莲种苗来源，加快人工栽培，以保护金线莲野生资源、稳定市场供应。现将有关实验结果如下。? 1??材料与方法? 1.1??材料??无菌繁殖体系的建立为浙江金线莲野生种源，其它实验为继代培养的不定芽及无根幼苗茎段。? 1.2?? 无菌繁殖体系的建立 取生长健壮、无病虫害的植株，去叶后放入低浓度的洗衣粉水中漂洗3～5?min，然后用流水冲洗30?min。在超静工作台前，用75%?酒精湿润5～6?s，放入0.1%的HgCl溶液灭菌12～13?min，用无菌水冲洗5～6次。将消毒好的茎按上段（具茎尖）、中段和下段（匍匐茎段）切成长约1.5～2?cm，带有1～2个节间的小段，分别接种于MS+6－BA?4.0?mg/L?+NAA?0.4?mg/L?培养基上，pH5.6，蔗糖2.5%，琼脂0.7%。培养条件为：温度(25±2）℃?，光照时间12?h/d，光照强度1?500～2?000?lx。? 1.3??不定芽诱导? 1.3.1??基本培养基对不定芽诱导的影响 采用单因素实验，培养基选用MS（Murashige-Skoog）［3］，1/2MS（大量元素减半，其他成分不变），VW(Vacin?&?Went)，B5（Gamborg?Miller?&?Ojima）和KC(Knudson?C)等5种，分别添加6－BA?4.0mg/L，NAA?1.0?mg/L。? 1.3.2??激素对不定芽诱导的影响 以MS为基本培养基，添加不同种类及浓度的细胞分裂素和生长素。? ????? 上述实验选取无菌健壮植株，切取长约1～1.5?cm，带有一个节间的茎中段，每处理接10个茎节，重复3次。培养期间定时观察不定芽生长情况，培养60?d后统计不定芽数。其它条件同实验“1.2”项。? 1.4??壮苗培养? 1.4.1??激素对幼苗生长和发根的影响 以1/2MS为基本培养基，NAA设1～5?mg/L?5个处理，6－BA设0.5，1.0和1.5?mg/L?3个处理，共15个处理。? 1.4.2??添加物对幼苗生长和发根的影响以1/2MS＋NAA?2.0?mg/L＋6－BA?0.5?mg/L为基本培养，考察马铃薯提取物、香蕉提取物、苹果提取物、椰子汁等4种天然有机物和活性炭对金线莲幼苗生长的影响。? ????? 上述每种培养基均接入经增殖培养高约3?cm，具3～4节间、有1～2片的无根幼苗，每处理接种接无根幼苗10株，重复3次。培养后每隔15?d观察生长情况1次，至3个月考察每株净增加的叶片数、重量及发根数，并进行数理统计分析。? 1.5??移栽??选苗高约6～8?cm，茎基直径约2?mm，丛生根有2～3条的试管苗，炼苗4?d后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移人直径为15?cm，装有不同基质的土盆中，考察不同基质对金线莲试管苗成活率的影响。移栽前，实验基质均用45%多菌灵可湿性粉剂800倍溶液浇透消毒。实验条件为遮荫度80%的荫棚，保持空气相对湿度的80%～90%。如发现有病死植株，及时拔除。每处理5盆，每盆种5株，重复3次，移栽3个月后考察成活株数，并进行数理统计分析。? 2??结果? 2.1?? 无菌繁殖体系的建立??实验表明，外植体茎段的分化程度对诱导结果存在一定的影响。从表1可知，上、中段茎均能萌动生长。上段茎因有顶芽的存在，顶端优势表现较为强烈，因而以生长为主，不定芽发生较少，平均芽增殖数为0.6个；中段茎不定芽发生快、量大、长势好，平均芽增殖数为4.05个，并形成多枝丛生状。下段茎由于组织相对老化，虽有不定芽发生，但发生量与生长势均较弱。这和陈自力［4］报道的结果一致。? ????? 从实验中观察到，不定芽的产生以侧芽萌生为主。一般在培养15～20?d后，茎节上潜伏的叶腋芽萌动膨大，芽丛在节的四周萌出，起初为白色略带黄色，随着培养时间加长，芽不断伸展，逐渐转为黄绿色，形成主芽。叶腋芽是单生的，极个别节上能对生两个腋芽，未发现茎部或切口处长出不定芽。培养30?d左右，主芽基部的节再生侧芽(称一级侧芽)，45?d左右一级侧芽节上又可发生二级侧芽，随着芽的生长、出现叶片，节处毛并产生根，外被浓密的白色绒毛，从而形成完整小植株。培养3个月后每天观察，侧芽分生组织的增殖，一般只出现主芽和一二级侧芽或苗；培养5个月以上，主芽、侧芽较高，叶片较多、大，只有少数出现三级侧芽或苗。这种腋芽萌生的增殖形成了主轴分枝型的芽苗，随培养时间或继代繁殖代数的增加，或激素的作用，芽或苗因节间短，多数为形成似不定芽或丛生苗。培养过程中，未见愈伤组织，也没有发现有原球茎和类原球茎产生。? 表1??金线莲茎段外植体不定芽诱导（略）? 2.2??不定芽诱导? 2.2.1??基本培养基对不定芽诱导的影响 以金线莲的茎节段作为外植体，腋芽能快速萌发出不定芽体。经60?d的培养，增殖倍数可达3.1～5.4倍。但基本培养基对不定芽的诱导具有明显的影响，MS，B5培养基不定芽增殖率分别为5.4倍与5.2倍，比其它培养基增加23.8%～74.2%。? 表2??基本培养基对金线莲不定芽诱导的影响（略）? 经LSR差异显著性测定，MS，B5培养基之间无明显差异，与1/2MS，KC和VW之间存在极显著差异，且MS，B5培养基上诱导产生的不定芽色绿、粗壮（见表2），表明MS，B5培养基适合作为金线莲茎段不定芽诱导的基本培养基［5］。? 2.2.2??激素对不定芽诱导的影响??激素种类、水平与配比对组织培养快速繁殖在效率存在明显的影响，6-BA、KT和NAA是3种常用生长调节剂，其添加量对金线莲不定芽增殖的影响很大。结果见表3。从表3可知，同为细胞分裂素的6-BA，KT在相同的添加量下对不定芽的增殖效果差异极显著，6-BA比KT的增殖率提高46.0%和55.0%，表明6-BA比KT更适合金线莲茎节不定芽的诱导。? ????? 6-BA的浓度也影响不定芽诱导效果。在添加量小于4.0?mg/L的情况下，随浓度的提高，不定芽增殖率明显上升，添加量为4.0?mg/L的不定芽增殖率比2.0，1.0?mg/L分别提高22.1%和47.6%。当6-BA添加量达到6.0?mg/L时，其增殖率还出现下降趋势，表明本实验条件下6-BA添加的适宜量为4.0?mg/L。? 表3??激素对金线莲不定芽诱导的影响（略）? 生长素NAA对金线莲不定芽的诱导与生长具有明显的促进作用。从表3可以看出，添加了NAA的培养基不定芽增殖量与生长明显较不添加的好，芽体粗壮、色浓绿，其中添加0.5?mg/L的表现最好，添加1.0?mg/L的其次，但二者间差异未达到显著水平；与其它不添加NAA的相比差异达极显著水平。表明在本试验条件下NAA适宜添加的量为0.5～1.0?mg/L。? 2.3??壮苗培养? 2.3.1??激素对幼苗生长的影响??在金线莲壮苗培养中，NAA较6-BA对促进幼苗生长的影响更为明显。结果见表4。NAA浓度低于3?mg/L时，对幼苗生长有促进作用，随浓度的增加，叶片净增量、发根数和鲜重净增量明显增加，当浓度达到4.0?mg/L时，叶片净增量、发根数和鲜重净增量增加不明显。6-BA在0.5?mg/L情况下，比不加的具有一定的促进作用，但未达显著水平；在浓度为1.0?mg/L，1.5?mg/L情况下，叶片净增量、发根数和鲜重净增量反而减少，但在幼苗基部观察到丛生状不定芽的产生，表明6-BA在浓度高于1.0?mg/L情况下，有利于金线莲不定芽的生成，对幼苗生长不利。? ????? 从表4也可以看出，处理9、10号在发根数、鲜生净增量方面较其它处理明显提高，达极显著差异；在叶片净增量方面，除与处理13、14号无明显差异外，与其它处理之间的差异达极显著水平，表明在金线莲壮苗培养中，NAA适宜添加的量为3.0～4.0?mg/L，6-BA?添加量为0.5?mg/L或不加。? 表4??激素对金线莲幼苗生长的影响（略）? 2.3.2??活性炭与有机添加物对幼苗生长的影响??结果见表5。从表5可知，不同的添加物对金线莲幼苗生长的影响表现不一，香蕉、椰子汁对促进幼苗生长最为有利，叶片净增量、发根数和鲜重净增量均高于其它处理，二者间无明显差异；马铃薯对幼苗生长不利，与其它处理相比均存在极显著差异水平。活性炭对金线莲幼苗生长具有一定的促进作用，在添加0.3%情况下，叶片净增量、发根数和鲜重净增量与对照相比均显著提高，差异达极显著水平；但与香蕉、椰子汁处理相比，其促进幼苗生长的作用不如前二者，除发根数无差异外，叶净增量与香蕉、椰子汁处理差异达显著水平，鲜重净增量差异达极显著水平。同时观察到活性炭、香蕉和椰子汁新发根洁白、粗壮。试验结果表明添加20%香蕉和椰子汁最适宜金线莲幼苗的生长。? 表5??添加物对金线莲幼苗生长的影响（略）? 2.4??移栽??金线莲试管苗移栽3个月后的植株成活情况见表6。从表6中可以看出，处理7和处理9保持100%的成活率，处理3和处理8的植株成活率也在93%以上，处理1的成活率最低，仅为56%。经LSR差异显著性测定，处理3、7、8、9号之间无明显差异，与处理5、6号差异达显著水平、与处理1、2、4号差异达极显著水平。表明在菜园土中加入粗砂、木屑能明显提高金线莲试管苗移栽的成活率，适宜添加的比例为1份菜园土中加入粗砂2份、木屑1份或粗砂1份、木屑2份，要求充分混匀。? 表6??种植基质对金线莲试管苗移栽成活率的影响（略）? 3??小结? ?????