血红蛋白地提取和分离 基础知识
高二生物血红蛋白的提取和分离
课题3 血红蛋白的提取和分离【课题目标】本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。
【课题重点与难点】课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。
课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
【导学诱思】思考1：分离生物大分子的基本思路是什么？思考2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？思考3： 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？思考4：人们用鸡的红细胞提取DNA ，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？一、基础知识：㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）：1、概念：根据被分离蛋白质的 ，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。
2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
3、具体过程：A. 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。
B.（1） 混合物上柱；（2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；颗相对量较相对量较（1）（2） （3） （4） （5） B A的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；（3） 的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。
（4） 不同的蛋白质分子完全分开；（5） 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来， 的蛋白质还在行进中。
㈡ 缓冲溶液：1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH 发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用：能够抵制 的对溶液的 的影响，维持PH 基本不变。
3、缓冲溶液的配制通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。
调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液。
熟读生物化学与分子生物学技术实践的基础知识2012.5.20
熟读生物化学与分子生物学技术实践的基础知识2012.5.20第一节生物成分的分离与测定技术一、《血红蛋白的提取和分离》基础知识1．凝胶色谱法凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。
凝胶实际上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
（分配色谱法、相对分子质量的大小；多糖类化合物；较长、较慢；较大、凝胶外部、较短、较快）2．缓冲溶液缓冲溶液的作用是。
缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。
生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。
（能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变；1～2种缓冲剂；7.35～7.45）3．电泳电泳是指。
许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。
电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。
（带电粒子在电场的作用下发生迁移过程；正电或负电；相反；带电性质的差异；大小、形状；迁移速度）两种常用的电泳方法是和，在测定蛋白质分子量时通常使用。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于以及等因素。
（琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白质所带净电荷的多少、分子的大小）4．蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分为四步：、、和。
（样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定）5．样品处理血液由和组成，其中红细胞最多。
红细胞具有的特点。
红细胞中有一种非常重要的蛋白质，其作用是血红蛋白有4条肽链，每条肽链绕一个，此基团可携带。
提取血红素的原理是
提取血红素的原理是
血红素的提取原理通常涉及以下步骤：
1. 血红素来源：血红素是在人和动物体内产生的一个重要生物分子，它是红血球中的一种血红素蛋白的组成部分。
红血球中的血红素与氧气结合，使其在体内运输。
2. 血红素的分离：要从生物体内提取血红素，首先需要将其与其他细胞和组织分离。
这可以通过离心、溶液直接抽取或其他物理和化学方法来实现。
3. 血红素的萃取：分离的血红素可以通过溶剂萃取的方式进一步提取。
常用的溶剂包括乙醚、醋酸乙酯等。
萃取过程中，血红素会与溶剂发生相互作用，从而被溶剂分离出来。
4. 脱色和纯化：血红素的提取通常还需要进行脱色和纯化步骤。
脱色过程中，常用活性炭或其他吸附剂来去除杂质。
纯化过程可以利用色谱或透析等技术，将血红素与其他物质分离开来。
5. 结晶和干燥：纯化的血红素可以通过结晶技术进一步提纯和纯化。
结晶过程中，通过逐渐降低温度，使血红素分子逐渐聚集成晶体。
最后，晶体通过干燥等工艺得到血红素的固态形式。
需要注意的是，血红素的提取原理可以根据具体的应用和实验目的而有所不同，上述步骤仅为一般性描述。
在实际操作中，根据需要可能会使用更复杂的方法和技术。
血红蛋白的提取和分离
[基础全练]1．分离不同种类的蛋白质依据的原理不包括()A．分子的形状和大小B．所带电荷的性质和多少、吸附性质C．对其他分子的亲和力D．蛋白质分子的组成元素解析：根据分离蛋白质的方法可以知道，分离不同种类的蛋白质依据的原理包括分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、吸附性质、对其他分子的亲和力和蛋白质分子的溶解度等。
蛋白质分子的组成元素不是分离不同蛋白质的依据。
答案：D2．如图能正确表示相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程的是()解析：相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢；相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，故B正确。
答案：B3．凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是() A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C．将酶或细胞固定在凝胶中D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度解析：凝胶的种类较多，但每种凝胶内部都有孔隙。
当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质分子可以进入凝胶内部，通过的路程较长，洗脱时从凝胶柱中出来得较晚；相对分子质量较大的蛋白质分子则可以较早地洗脱出来，从而达到分离蛋白质的目的。
答案：A4．下列有关凝胶色谱操作的叙述，不正确的是()A．干的凝胶要用蒸馏水充分溶胀后，才能装填B．在装填凝胶色谱柱时，不得有气泡产生C．在装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管先打开后关闭D．在样品洗脱过程中，不能让洗脱液流干解析：在装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应始终打开，C错误。
答案：C5．下列关于DNA的粗提取实验和血红蛋白的提取实验，叙述正确的是() A．前者选择鸡血细胞作为实验材料较好，后者选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料较好B．样品预处理时，前者静置1天处理除去上清液；后者需要加入清水，反复低速短时间离心洗涤，至上清液无黄色C．在DNA粗提取实验中，往2 mol/L氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时，应该缓慢加入，直到出现黏稠物即止D．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐等解析：鸡血细胞有细胞核，适于提取DNA；哺乳动物成熟红细胞无细胞核和众多细胞器，适用于提取血红蛋白。
血红蛋白的提取和分离
2.粗分离----透析（去除分子量较小的杂质）
（1）用 透析
方法进行粗分离，透析袋由半透膜制 成， 玻璃纸、肠衣、膀胱膜 常用 。将透析袋放入 磷酸缓冲 溶液中进行透析。
（2）透析的原理是 透析袋能使小分子自由进出，而将 大分子保留在袋内 （3）透析的目的是
去除样品中分子量较小的杂质
。
• 透析过程中如何去除无机盐离子和小分子 有机物？ • 半透膜的选择透过性，大分子物质不能通 过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜 。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子 和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7 的磷酸缓冲液中。 • 透析过程中为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？ 为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？ • 维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分 子充分地向外扩散。
蛋白质的知识
(1)一个通式：是指组成蛋白质的基本单位氨基酸；氨基酸的通式只有 1个， 即 (形象记忆：碳周围有四个邻居，三个固定邻居即-H、-COOH、-NH2， 一个变动邻居即-R基)。不同的氨基酸分子，具有不同的-R基。 (2)两个标准：是指判断组成蛋白质的氨基酸必须同时具备的标准有2个： 一是数量标准，即每种氨基酸分子至少都含有一个氨基(-NH2)和一个羧基(COOH)；二是位置标准，即都是一个氨基和一个羧基连接在同一个碳原子上。
1、样品的处理
（1）红细胞的洗涤 A、洗涤目的: 去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化 B、分离时采用 低速短时间 三次 洗 涤，重复洗涤
表明红细胞已洗涤干净
五倍体积的生理盐水 离心，用 ，直至 上清液不再呈现黄色，
为什么要低速短时离心？ 防止白细胞沉淀 C、能否用蒸馏水代替生理盐水？
不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞 提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。
【凝胶色谱法的原理和方法】血红蛋白的提取和分离
【凝胶⾊谱法的原理和⽅法】⾎红蛋⽩的提取和分离【课题】：课题6 ⾎红蛋⽩的提取和分离【备课⼈】：【备课时间】：【上课时间】：【课型】：复习【课时数】：1课时【复习⽬标】本课题通过尝试对⾎液中⾎红蛋⽩的提取和分离，使学⽣能够体验从复杂体系中提取⽣物⼤分⼦的基本过程和⽅法，并了解⾊谱法、电泳法等分离⽣物⼤分⼦的基本原理，为今后学习运⽤这些技术打下基础。
【复习重点与难点】复习重点：凝胶⾊谱法的原理和⽅法。
复习难点：样品的预处理；⾊谱柱填料的处理和⾊谱柱的装填。
【知识回顾】：⼀、实验原理蛋⽩质的物化理性质：形状、⼤⼩、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和⼒等千差万别，由此提取和分离各种蛋⽩质。
1．凝胶⾊谱法（分配⾊谱法）：（1）原理：分⼦量⼤的分⼦通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分⼦量⼩的分⼦穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：混合物上柱→洗脱→⼤分⼦流动快、⼩分⼦流动慢→收集⼤分⼦→收集⼩分⼦＊洗脱：从⾊谱柱上端不断注⼊缓冲液，促使蛋⽩质分⼦的差速流动。
（4）作⽤：分离蛋⽩质，测定⽣物⼤分⼦分⼦量，蛋⽩质的脱盐等。
2．缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的⽤量，可配制不同pH的缓冲液。
（2）缓冲液作⽤：抵制外界酸、碱对溶液pH的⼲扰⽽保持pH稳定。
3．凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋⽩质的带电性质、电量、形状和⼤⼩不同，在电场中受到的作⽤⼒⼤⼩、⽅向、阻⼒不同，导致不同蛋⽩质在电场中的运动⽅向和运动速度不同。
（2）分离⽅法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
（3）分离过程：在⼀定pH下，使蛋⽩质基团带上正电或负电；加⼊带负电荷多的SDS，形成“蛋⽩质－SDS复合物”，使蛋⽩质迁移速率仅取决于分⼦⼤⼩。
⼆、实验步骤1．样品处理①红细胞的洗涤洗涤红细胞的⽬的是去除杂蛋⽩，采集的⾎样要及时采⽤低速短时间离⼼分离红细胞，然后⽤胶头吸管吸出上层透明的黄⾊⾎浆，将下层暗红⾊的红细胞液体倒⼊烧杯，再加⼊五倍体积的⽣理盐⽔，缓慢搅拌10min，低速短时间离⼼，如此重复洗涤三次，直⾄上清液中没有黄⾊，表明红细胞已洗涤⼲净。
知识剖析
血红蛋白的提取和分离【基础知识】蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质各种特性、的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等来分离不同种类的蛋白质。
（一）凝胶色谱法1、概念：也称分配色谱法，是根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离蛋白质的有效方法。
2、大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体。
3、具体过程：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
（二）缓冲溶液1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用：能够抵制外界的酸和碱对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。
3、缓冲溶液的配制:通常由1—2种缓冲剂溶解于水中配制而成。
调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。
（三）电泳1、概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
2、原理：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
3、分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。
（1）蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等。
（2）为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS。
SDS能使蛋白质发生完全变性。
由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。
（3）SDS与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。
因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子大小。
猪血红蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)
猪血红蛋白的提取纯化与鉴定系别：生命科学与技术学院专业：生物科学班级：生物科学0701姓名：李嘉、潘婷婷血红蛋白(Hemoglobin , Hb)是动物血液中的一种由4个亚基组成的多亚基蛋白质。
作为体内氧运输的载体具有重要的生理功能。
在 Hb 与氧结合及释放过程中 ,体现了别构蛋白各亚基之间相互作用的正协同效应特征 ,具有很强的代表性 ,是研究别构蛋白特性的良好材料。
此外 ,Hb 的单亚基结构还与食用肉主要色素蛋白-肌红蛋白(Myoglobin , Mb)的结构非常相似 ,均为血红素蛋白质,具有一个血红素活性中心。
只是 Mb 是单亚基结构 ,而 Hb为4亚基结构,相当于Mb的4倍体。
Hb和Mb均具有3种天然诱导体构型 ,即氧合型 (Oxy-Hb ; Oxy-Mb) ,还原型(Red-Hb ; Red-Mb)和氧化型(Met-Hb; Met-Mb) 。
两种蛋白质的相同构型均具有相同的颜色及相似的光谱学特性。
为此 ,也有人用 Hb 作为成本昂贵的 Mb 的代用品来研究食用肉色调变化的规律性。
而目前市售的Hb多采用冷冻干燥法制备 ,多为Met-Hb 构型,其纯度较低 ,氧合活性较差 ,且该产品不能进行诱导体构型转化的调制 ,因而不能满足人们对食用肉色调变化进行研究的要求。
用丰富而廉价动物血液为原料，通过简便生产工艺制备Hb结晶（该结晶属氧化型）可进行多种诱导体形态的调制 ,调制出的各种诱导体具有类似于天然 Hb 的氧合功能特性 ,保持了别构蛋白与底物结合的正协同效应特点 ,同时 ,具有与天然诱导体形态相同的色调变化规律和光谱学特征。
因此 ,可以满足人们进行别构蛋白及食肉色调研究的需求。
此结晶具有稳定的理化性质 ,可长期保存。
一、教学目的通过血红蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。
整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。
分离血红蛋白的方法
分离血红蛋白的方法血红蛋白是一种重要的蛋白质，在人体内起着不可或缺的作用。
然而，在某些情况下，需要分离出血红蛋白，以便进行进一步的研究或治疗。
本文将介绍几种分离血红蛋白的方法。
一、离心法离心法是一种简单易行的分离血红蛋白的方法。
将血液样品离心，使得红细胞和血清分离出来。
使用离心管和离心机，可以通过控制离心速度和离心时间，来达到分离红细胞和血清的目的。
离心分离出的红细胞可以通过化学方法进一步分离出血红蛋白。
二、溶解法溶解法是将红细胞中的血红蛋白溶解，并通过某种方法分离出来。
其中一种方法是用生理盐水将红细胞洗涤，使其膜破裂，让血红蛋白溶解在生理盐水中。
然后再通过化学方法将血红蛋白分离出来。
另外一种方法是使用高浓度的盐溶解红细胞，使血红蛋白溶解在盐溶液中。
然后通过恰当的方法去除盐，获得纯净的血红蛋白。
三、离子交换层析法离子交换层析法是一种静态吸附层析法，可以用于分离血红蛋白。
本方法是通过离子交换树脂静态吸附分离血红蛋白。
血红蛋白具有正电荷，因此可以用阴离子交换树脂来分离。
而离子交换树脂和血红蛋白之间的相互作用是由电荷的吸引力和排斥力来实现的。
离子交换法一般需要多次的洗脱操作，才能得到较为纯净的血红蛋白。
四、凝胶过滤法凝胶过滤法是一种能够分离不同分子量的蛋白质的方法。
通过分子量大小的不同，使得不同的蛋白质在凝胶柱中的渗透系数不同，从而实现分离。
血红蛋白相对分子量较大，因此凝胶过滤法可以有效地分离血红蛋白。
以上是分离血红蛋白的几种方法，每种方法都有它的优缺点，需要根据具体的情况选择合适的方法。
需要注意的是，在进行分离血红蛋白的过程中，需要严格按照正确的操作方法进行，保证实验结果的可靠性和准确性。
蛋白质的分离提取方法PPT课件
2021
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装 配 好 的 凝 胶 柱
2021
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⑶.样品加入与洗脱
①调节缓冲液面 ②滴加透析样品 注意：正确的加 样操作是： 1.不要触及并破 坏凝胶面。 2.贴壁加样。
3.使吸管管口沿管壁环绕移动。
③样品渗入凝胶床
④洗脱
⑤收集
注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，
说明色谱柱制作成功。
不同物理或化学性质的生物大分子。
2.蛋白质分离和提取的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的 形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解 度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等， 可以用来分离不同种类的蛋白质。
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思考
血液有哪些成分？
水分 血浆
固体物质
血
液
白细胞
血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等
子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳
迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以
测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分
子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白
试剂出售。
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实践训练
1.在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质
是( A )
A.糖类化合物
B.脂质
C.蛋白质
D.核酸
2.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动
㈡.你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你 的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝
胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝
胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子
的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡
聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、
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实用文档 第15课时 血红蛋白的提取和分离
1.归纳蛋白质多样性的原因 (1)图甲说明：氨基酸的种类不同，构成的肽链不同。 (2)图乙说明：氨基酸的数目不同，构成的肽链不同。 (3)图丙说明：氨基酸的排列次序不同，构成的肽链不同。 (4)图丁说明：肽链的数目和空间结构不同，构成的蛋白质不同。 2.血液包括血细胞和血浆，血细胞又分为红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞含有血红蛋白，使红细胞呈现红色。 3.红细胞放到低渗溶液中，会吸收水分，体积膨胀直至涨破。 课堂导入 蛋白质是生命活动不可缺少的物质，随着基因组测序工作的完成，人们对蛋白质的研究和应用工作进入了新的时代，这就需要获得纯度较高的蛋白质。因此对蛋白质的分离就是生物学研究中经常要做的工作，下面我们就以血红蛋白的提取和分离来学习有关蛋白质的一些基本技术。
探究点一 蛋白质分离技术 生物体的蛋白质多种多样，按照科学的需要有时要把它们分开，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子的之间的差异来分离的。 1.蛋白质特性的差异 (1)分子的形状和大小； (2)所带电荷的性质和多少； (3)溶解度； (4)吸附性质； 实用文档 (5)对其他分子的亲和力。 2.分离的方法 (1)凝胶色谱法
Ⅰ.概念：凝胶色谱法，也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 Ⅱ.凝胶：是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，含许多贯穿通道，具有多孔的凝胶又称为分子筛。 Ⅲ.凝胶色谱法分离蛋白质的原理(如图A) 相对分 子质量 直径大小 运动方式 运动 速度 运动 路程 洗脱 次序
大 大于凝胶颗粒空隙直径、被排阻在凝胶颗粒的外面 垂直向下移动 较快 较短 先从凝胶柱洗脱出来
小 小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入凝胶颗粒部 垂直向下移动，无规则扩散进入凝胶颗粒 较慢 较长 后从凝胶柱洗脱出来
Ⅳ.分离蛋白质的过程(如图B) ①蛋白质混合物上柱； ②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外； 实用文档 ③相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动； ④相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开； ⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。 (2)电泳 ①概念：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ②原理：在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 ③常用方法 a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状的不同而不同，从而得以分离。 b.聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入SDS作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 (3)缓冲溶液 ①概念：在一定围，能够抵制外界的酸、碱或稀释的影响，维持pH基本不变的溶液叫做缓冲溶液。 ②缓冲溶液的配制：缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH围使用的缓冲液。 小贴士 缓冲溶液常见的有三类 1弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。 2多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如：NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。 3弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。 归纳提炼 凝胶色谱法和电泳法 凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。 活学活用 1.下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因( ) 实用文档 A.分子带电性质的差异 B.分子的大小 C.分子的形状 D.分子的变性温度 [问题导析] 电泳法是在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 答案 D 解析 电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。 探究点二 血红蛋白的提取和分离 每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质不同会有很大差异，下面以哺乳动物红细胞为材料，学习初步分离蛋白质的方法。 1.蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 2.样品处理 (1)红细胞的洗涤 ①目的：去除杂蛋白； ②方法：采集血样，低速短时间离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水稀释，再离心，重复三次，直至上清液中不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。 (2)血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中： ①加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破； ②加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜； ③置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min，其作用是加速红细胞破裂； ④红细胞破裂，释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液 ①将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min的速度离心10 min，试管中的溶液分为4层：
②将试管中的液体用滤纸过滤、除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体，即血红蛋白溶液。 实用文档 (4)透析 ①原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋。 ②过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。 ③目的：a.除去样品中相对分子质量较小的杂质。b.用于更换样品的缓冲液。 3.凝胶色谱柱的制作 (1)取长40 cm，径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 (2)柱底部制作：橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。 (3)柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。 (4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。 4.凝胶色谱柱的装填 (1)计算：根据色谱柱的体积计算所需凝胶量 ↓ (2)凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液 ↓ (3)固定：将色谱柱垂直固定在支架上 ↓ (4)装填：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱 ↓ (5)洗涤平衡：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密 5.纯度鉴定——电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。 归纳提炼 实验注意事项 (1)红细胞的洗涤 ①离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。 ②重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。 (2)色谱柱填料的处理：为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需1～2 h。这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒的空气。 实用文档 (3)凝胶色谱柱的装填：在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 ①在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ②在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。 (4)蛋白质的分离：滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。 活学活用 2.下列说法不正确的是( ) A.在一定围，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变 B.缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成 C.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 D.透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋 [问题导析] 透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋。 答案 D 解析 透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋。透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质( ) A.路程较长，移动速度较慢 B.路程较长，移动速度较快 C.路程较短，移动速度较慢