DNA提取实验课件
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选修一5.1DNA的粗提取和鉴定人教版高二生物下课件(共29张PPT)
再用来自mol/L的NaCl溶液溶 解DNA。
Q1：在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，搅拌 1min，注意应沿一个方向，目的是？
目的是使DNA充分溶解
过滤溶解有DNA的2mol/L的NaCl溶液，目的是什么？
含DNA的滤液、除去不溶的杂质
含核物质的滤液
Q2：再加蒸馏水的目的是？同时搅拌的目的是？（轻轻地沿 一个方向不停地均与搅拌）过滤含DNA黏稠物的0．14mol/L 的NaCl溶液，目的是什么？
部分发生盐析(沉淀) 溶解 某些蛋白质可溶
（二）对酶、高温和洗涤剂的耐受性
①蛋白酶水解蛋白质，对DNA没有影响。 ②60～80°C的高温中，蛋白质变性后溶解度降 低而产生沉淀，DNA在80°C以上才会变性。 ③洗涤剂瓦解细胞膜（脂质），对DNA没有影 响（在植物材料中提取DNA使用）。
DNA具有耐受性
提取DNA的方法：利用DNA与蛋白质、 RNA 和 脂质等在 物理和 化学 性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
一、DNA的提取的原理： （一）溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶 液中和酒精中的溶解度不同。
❖ 据图： ❖ ①在什么浓度下，DNA的溶解度最小？
0.14 mol/L
课题 DNA的粗提取与鉴定
人教版高二年级 选修1
生物体内的DNA犹如“雾中花”，神秘莫 测，真实的DNA是什么模样？
探究DNA的提取与鉴定的原理
【问题思考】 1.细胞中有哪些生物大分子？ 2.DNA与蛋白质的物理化学性质有哪些主要差异？ 3.提取生物大分子的基本思路是什么？ 4.提取DNA分子的方法是什么？
DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大。
材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）
Q1：在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，搅拌 1min，注意应沿一个方向，目的是？
目的是使DNA充分溶解
过滤溶解有DNA的2mol/L的NaCl溶液，目的是什么？
含DNA的滤液、除去不溶的杂质
含核物质的滤液
Q2：再加蒸馏水的目的是？同时搅拌的目的是？（轻轻地沿 一个方向不停地均与搅拌）过滤含DNA黏稠物的0．14mol/L 的NaCl溶液，目的是什么？
部分发生盐析(沉淀) 溶解 某些蛋白质可溶
（二）对酶、高温和洗涤剂的耐受性
①蛋白酶水解蛋白质，对DNA没有影响。 ②60～80°C的高温中，蛋白质变性后溶解度降 低而产生沉淀，DNA在80°C以上才会变性。 ③洗涤剂瓦解细胞膜（脂质），对DNA没有影 响（在植物材料中提取DNA使用）。
DNA具有耐受性
提取DNA的方法：利用DNA与蛋白质、 RNA 和 脂质等在 物理和 化学 性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
一、DNA的提取的原理： （一）溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶 液中和酒精中的溶解度不同。
❖ 据图： ❖ ①在什么浓度下，DNA的溶解度最小？
0.14 mol/L
课题 DNA的粗提取与鉴定
人教版高二年级 选修1
生物体内的DNA犹如“雾中花”，神秘莫 测，真实的DNA是什么模样？
探究DNA的提取与鉴定的原理
【问题思考】 1.细胞中有哪些生物大分子？ 2.DNA与蛋白质的物理化学性质有哪些主要差异？ 3.提取生物大分子的基本思路是什么？ 4.提取DNA分子的方法是什么？
DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大。
材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）
高二人教版生物选修一课件：5.1 DNA的粗提取与鉴定
问题探究
1.DNA溶解性原理 (1)结合DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线，分析DNA在不同浓度NaCl溶 液中的溶解度有何特点。
项目
溶解规律
2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液
DNA
溶解
析出
蛋白质在NaCl溶液浓度从2 mol/L
蛋白质
部分发生盐析沉淀 溶解
降低过程中，溶解度逐渐增大
DNA尽量的多；
C项是让DNA充分沉淀，保证DNA的量；
D项的道理同C项；
而B项的操作并不能使DNA增多或减少。
解析 答案
4.下图所示为DNA的粗提取与鉴定实验的实验步骤，请据图回答下列问题：
(1)请写出①②③④的实验步骤名称
① 提取细胞核物质 ；
② 析出DNA的黏稠物 ；
③ 用冷却的酒精析出DNA；
(2)植物细胞的破碎 ①方法：需要先用洗涤剂 溶解细胞膜。 ②过程：以提取洋葱的DNA为例。 在切碎的洋葱中加入一定的 洗涤剂和食盐 ，进行充分地搅拌和 研磨 ， 过滤后收集研磨液。
3.去除滤液中的杂质
利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中 溶解度 不同，通过控制 方案一 NaCl溶液的 浓度 去除杂质
①低于0.14 mol/L时：_D_N_A__的__溶__解__度__随__N_a_C__l溶__液__物__质__的__量__浓__度__增__加__而__逐__ 渐降低 。 ②高于0.14 mol/L时：_D_N_A__的__溶__解__度__随__N_a_C__l溶__液__物__质__的__量__浓__度__增__加__而__逐__ 渐升高 。
(2)结合图表分析，如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶 解或析出，以达到去除杂质的目的？ 答案 提取获得的DNA滤液中含有蛋白质、多糖和RNA等多种杂质，用 2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA，然后过滤获得滤液，能够去除该条件下不 能溶解的杂质；调节NaCl溶液的物质的量浓度为0.14 mol/L，使DNA析 出，然后过滤获得析出物，能够去除该条件下仍然能够溶解的杂质。 (3)DNA不溶于酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质则溶于酒精溶液，此特 点对于提取DNA有什么作用？ 答案 可以将DNA和蛋白质进一步分离。
DNA和质粒抽提PPT课件
第43页/共142页
二、DNA的浓缩
1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋
外敷PEG至合适量
2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此 重复几次可显著减少DNA体积
第44页/共142页
三、DNA回收
主要是从电泳中分离回收DNA片段 回收原则：尽量提高回收率
去除回收DNA样品中的污染物
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完整性鉴定
凝胶电泳法：
基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降 解，可出现电泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在 RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。
第25页/共142页
第26页/共142页
5、核酸的贮存——DNA保存
1）短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少 DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。
• 提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因
第58页/共142页
第59页/共142页
质 粒 DNA 制 备
plasmid extraction
第60页/共142页
质粒简介
质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子
其大小范围从lkb至200kb以上不等。 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒. 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行
第37页/共142页
DNA的沉淀
1）无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子 表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。
无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出， 无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释 放热量对DNA的损伤。 2）异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分 子
二、DNA的浓缩
1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋
外敷PEG至合适量
2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此 重复几次可显著减少DNA体积
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三、DNA回收
主要是从电泳中分离回收DNA片段 回收原则：尽量提高回收率
去除回收DNA样品中的污染物
第24页/共142页
完整性鉴定
凝胶电泳法：
基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降 解，可出现电泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在 RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。
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5、核酸的贮存——DNA保存
1）短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少 DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。
• 提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因
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质 粒 DNA 制 备
plasmid extraction
第60页/共142页
质粒简介
质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子
其大小范围从lkb至200kb以上不等。 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒. 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行
第37页/共142页
DNA的沉淀
1）无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子 表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。
无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出， 无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释 放热量对DNA的损伤。 2）异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分 子
DNA提取方法和步骤课件
核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类 似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸 和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶 于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水， RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈 黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性 或弱碱性溶液中较稳定。
15min左右； • 5. 室温下10000rpm离心15min，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍
体积的冷酒精，-20 ℃放置1h或过夜； • 6. 挑出DNA置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加
入适量70%酒精，摇动洗涤10min，重复洗涤2-3次； • 7. 吹干DNA，加入适量TE在65℃溶解，完全溶解后离心去除杂质； • 加入RNase（10mg/mL）, 室温处理0.5-1h, 除去RNA，4℃或-20℃贮存。 • 如需纯化DNA，再加入适量TE，氯仿/异戊醇多次抽提后吸取上清，加
DNA样品在1% Agarose胶上电泳（例图）
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞 核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋 白质和糖去除，同时除去RNA及无机离子等，从中分离DNA 。
核酸的提取方法
提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法，对它们进行稍加 修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂裂 解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。
DNA提取方法和步 骤
实验原理
植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学 研究的基础要求。对DNA提取一般有三个要求：
质粒DNA提取PPT课件
但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始 终在下层，方便水相的回收；
27
酚/氯仿
还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独 用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚 会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），
因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一 次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液 进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的 酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切 等反应不能正常进行。
41
1.2.3 琼脂糖浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1
42
1.3 电泳方法
1.3.1 凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型).水平型电 泳时,凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm,故又称为潜水式。后者制胶和 加样比较方便,电泳槽简单,易于制作,又可以根据需要制备不同规格的凝胶板, 节约凝胶,因而较受欢迎。
28
乙醇
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就 可以将质粒DNA沉淀出来。
如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几 次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀 打碎，就能得到好的样品。
29
RNase
得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml） 的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的 RNA会干扰电泳结果的。
2. 启始复制子（ori, Origin of
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
site or polylinker)； 4. 标记基因(Marker gene, such as
27
酚/氯仿
还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独 用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚 会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），
因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一 次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液 进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的 酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切 等反应不能正常进行。
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1.2.3 琼脂糖浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1
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1.3 电泳方法
1.3.1 凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型).水平型电 泳时,凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm,故又称为潜水式。后者制胶和 加样比较方便,电泳槽简单,易于制作,又可以根据需要制备不同规格的凝胶板, 节约凝胶,因而较受欢迎。
28
乙醇
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就 可以将质粒DNA沉淀出来。
如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几 次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀 打碎，就能得到好的样品。
29
RNase
得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml） 的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的 RNA会干扰电泳结果的。
2. 启始复制子（ori, Origin of
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
site or polylinker)； 4. 标记基因(Marker gene, such as
高中生物选修一DNA的粗提取与鉴定.ppt课件
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⑵ DNA不溶于酒精溶液
DNA不溶于酒精溶液， 但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 将DNA与蛋白质进一步分离。
⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
① 蛋白酶——水解蛋白质， 对DNA没有影响
② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才会变性
③ 洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质 但对DNA没有. 影响
观察现象：解丝状物的溶液变为蓝色
.
四、课题成果评价：
是否提取出了DNA
观察你提取的DNA颜色， 如果不是白色丝状物， 说明DNA中的杂质较多； 二苯胺鉴定出现蓝色 说明实验基本成功， 如果不呈现蓝色， 可能所提取的DNA含量低， 或是实验操作中出现错误， 需要重新制备
.
课题延伸
本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的 科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DNA时， 通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷 基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。
答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出
.
3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色
答：D
4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液 中的上清液?
答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于 上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以 要除去上清液(含有蛋白质)。
讨论1：构成生物体的遗传物质是什么？ 讨论2：如何证明他们是遗传物质？ 讨论3：怎样才能将细胞内的这些物质分离出来？
.
§5.1 DNA的粗提取与鉴定
.
一、基础知识
（一）提取DNA的方法
1.提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法，分离具有不 同物理或化学性质的生物大分子
分子实验-植物DNA提取
0 1 实验原理
1、破壁：在液氮中对植物组织进行研磨，破碎细胞。并减少 研磨过程中各种酶类的作用。
2、溶解：CTAB离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜， 使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来。
3、分离：苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提 液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去 细胞碎片和大部分蛋白质。
三、主要仪器及耗材： 研钵及研钵棒、水浴锅、移液枪及配套枪头、2.0ml离心管、 离心机、 电子天平、通风橱、冰箱、电泳仪、 凝胶成像系统、超微量核酸蛋白测 定仪系统。
04
PART FORE
操作步骤
0 4 操作步骤
1.配置试剂： （1）10 ml 4% CTAB提取缓冲液
CTAB NaCl 1 M Tris- HCl(pH 8.0) 0.5 mol/L EDTA(pH 8. 0) ddH2O
(二)琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA:
1、将溶液加入样品槽时，勿划破或戳破加样孔，勿带入气泡; 2、使用干净的电泳溶液。
THANKS
心管，使之充分作用15 min。
0 4 操作步骤
10.重复第7步骤。 11.在上清液中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻柔颠倒，充分混匀，
室温放置 10min。 12.12 000 r/min 离心 5 min，弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2次。 13.室温挥发乙醇5-10min，加入适量的ddH2O溶解。 14.电泳检测。取3 μL提取的植物总DNA，加入 1μL 6x Loading buffer，
0.4g 1.64g 20ml 0.8ml 7.2ml
（2）10ml 70%乙醇
无水乙醇
7ml
水
3ml
0 4 操作步骤
DNA的粗提取与鉴定课件
• 问题：如果溶液变蓝是否能说明DNA 的存在? • 设置对照组 对照组
• 除了可以使用二苯胺法，还有什 么方法可以鉴定DNA？ • 用甲基绿溶液直接滴在有DNA丝状 物的载玻片或玻棒上，呈绿色反 应
1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入 3g柠檬酸钠，防止血液凝固。 2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产 生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精 和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的 断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
DNA析出 DNA析出 析出……………… 加蒸馏水至0.14mol/L， 加蒸馏水至 .14mol/L， .14mol/L 过滤，再溶解到2mol/L mol/L溶液中 过滤，再溶解到 mol/L溶液中 除去细胞质中的大部分物质。 除去细胞质中的大部分物质。 DNA初步纯化 DNA初步纯化 初步纯化………… 与等体积 ％冷却酒 与等体积95％ 精混合， 精混合，析出白色丝状物 除去核蛋白、RNA、多糖等。 除去核蛋白、RNA、多糖等。 DNA鉴定 鉴定……………… 二苯胺，沸水浴，呈 二苯胺，沸水浴， DNA鉴定 现蓝色
在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随 NaCl溶液浓度的增加而逐渐 NaCl 溶液浓度的增加而逐渐 降低； mol/L时 降低；在0.14 mol/L时，DNA 溶解度最小； NaCl溶液浓 溶解度最小 ； 当 NaCl 溶液浓 度继续增加时，DNA的溶解度 度继续增加时，DNA的溶解度 又逐渐增大。 又逐渐增大。
DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于酒精溶液， DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些 物质则可以溶于酒精。 利用这一原理 ， 物质则可以溶于酒精 。 利用这一原理， 可以将DNA与蛋白质进一步分离。 可以将DNA与蛋白质进一步分离。